p21Cip1基因对V79-8细胞周期的影响*
作者：江 虹 冯 洁 王永潮
单位：北京师范大学生物学系细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875
关键词：V79-8细胞；p21Cip1基因；细胞周期调控；转染
解剖学报980310 摘 要 为了探讨缺乏可测出G1、G2期V79-8细胞株的细胞周期失调的分子机理，构建了人的周期负调控基因p21Cip1的可表达重组质粒pXJSC，转染该细胞系，建立了高表达p21的V79-8-SC细胞。以3HTdR放射自显影法，流式细胞光度术，细胞增殖曲线测定及免疫印迹技术，检测及比较了与细胞周期变化和增殖有关基因的表达，发现该细胞较对照细胞V79-8-neoG1期明显延长，G2期也稍有增加。与此同时，G1期调控的cyclinD1、CDK4、Id基因表达明显下降，G2期调控基因cyclinB1的表达也有所下降。结果表明：此细胞系的细胞周期缺陷可能由于p21Cip1、CDKs/cyclins及其相关基因的表达失调所致。
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V79-8是一种增殖速度非常快的中国仓鼠肺成纤维细胞系(Chinese hamster lung fibroblast)，它的倍增时间仅为9.5～10h[1,2]。该细胞由Elkind和Sutton于1960年从其母细胞系V79转化而来，V79最初由Ford和Yerganian于1958年建系。1967年,Robbins和Scherff用[3H]胸腺嘧啶核苷参入法([3H]thymidine incorporation assay)首次发现V79-8细胞缺乏可检测的G1期，1977年Liskay[1]用同样的方法证实V79和V79-8也缺乏可检测的G2期。V79-8具有非常短的G1、G2期这一特性，为研究高等真核细胞G1期、G1/S、G2/M转换的调控提供了很好的模型。
通过Northern杂交检测，我们曾发现V79-8细胞中cyclinD1、cyclinD3及Id mRNA的表达明显高于V79细胞(待发表)，由此推测这些G1期调控因子的高表达可能造成了V79-8细胞G1期的缺失，所以如果人为地改变G1期调控因子的表达，就有可能使V79-8细胞的G1期明显延长，从而可在体内研究它们对细胞周期造成的影响。此外，我们的结果显示，V79-8细胞中p21与人和小鼠不同，有两个转录本。
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材料和方法
1.细胞培养
V79-8细胞由美国MD Anderson肿瘤中心PN Rao教授赠送，培养于DMEM(GIBCOL BRL)培养基(10%小牛血清，108IU/L青霉素，100mg/L链霉素)，37℃，5%CO2的孵育箱中。
2.G418剂量预实验
处于对数生长期的V79-8细胞以3×103细胞/cm2接种，培养过夜，待细胞完全贴壁后，分别以含G418(GIBCOL BRL)100、200、400、600、800mg/L的新鲜培养基换液，平行3组对照，每3d换1次液，换3次(9d)后，选择G418致死细胞的最小浓度。由此测得G418筛选V79-8细胞的药物浓度为400mg/L。
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3.真核表达p21Cip1重组质粒的构建及V79-8-SC细胞株的建立
用限制性内切酶XhoI/KpnI将p21 cDNA从p21-pGEX-2TKcs质粒上切下，正向克隆至真核表达载体pXJ41-neo的多克隆位点处。
构建的重组质粒pXJSC用磷酸钙法转染V79-8细胞(转染时细胞汇合度约为30%)。48h后细胞培养于含400mg/L G418的培养液中筛选阳性细胞，2～3d换液1次，细胞长满可传代继续筛选。10d之后，细胞以10个/cm3接种，长成肉眼可见的集落，分别挑入24孔板中，长满后转入大方瓶培养，转染的细胞始终以400mg/L的培养基保种。以Northern杂交及免疫印迹鉴定阳性细胞中p21的表达。
同时，pXJ41-neo空载体转染细胞以建立对照细胞株V79-8-neo。
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4.Northern杂交
细胞总RNA用异硫氰酸胍一步法提取，上样量为15μg，1%甲醛变性凝胶电泳后，真空转移至尼龙膜上，杂交探针为自制的体外转录[α-32P]rUTP标记单链反义RNA，探针来源、RNA聚合酶及转录本长度如下：pXJ41-p21Cip1(antisense)-T7-1kb; pGEM3z-β-actin-sp6-0.5kb; pSK-CDK4-T3-1.3kb; pGEM4z-CycD1-sp6-1.14kb; pXJ41-CycD3 (antisense)-T7-1.96kb; pSK-Id-T7-0.93kb; pXJ41-CycB1(antisense)-T7-1.45kb。如果需要，每张膜均做β-actin内参照，每次杂交结果均用密度扫描校正。
5.免疫印迹
取对数生长的细胞(一大方瓶)，加入200μl 85℃ 1×SDS上样缓冲液裂解细胞。裂解液在水浴中煮沸10min，10 000g，离心10min，取上清。Lowry法定量，每孔上样100μg，10%SDS-PAGE电泳，石墨电极半干转移至硝酸纤维素膜上，一抗为兔抗人p21 IgG(本室制备)，二抗为碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG(Promega)，结果用同样的上样量电泳后考马斯亮蓝R-250染色为内参照经密度扫描校正。
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6.生长曲线测定(MTT法)
培养于24孔板的细胞，0.5ml培养液中加50μl MTT(5g/L,溶于PBS)，37℃孵育3h，加0.5ml DTW脱色液(1份Triton X-100溶于3份DMF中，摇匀后加入2份去离子水，加枸橼酸至0.2mol/L，pH5～6)，空白对照以0.5ml培养基代替，于570nm处读取OD值[3]，每隔12h测量1个点，每个点为3次测量的平均值。
7.流式细胞光度术(FCM)
细胞用胰酶消化后，离心收集，用冰冷的PBS洗，然后在80%乙醇-20℃固定。12h后，样品用冰冷的PBS洗3次，加入200mg/L无DNase的RNase，37℃保温30min，之后加入1g/L的碘化丙啶(propidium iodide, Sigma)，37℃保温30min，样品在4℃避光保存，并在24h内测量[4]，每种样品做3个平行组。
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8.[3H]胸腺嘧啶核苷参入及放射自显影
取对数生长的细胞，加入4mCi/L[3H]胸腺嘧啶核苷(上海核子所)脉冲标记20min，细胞用甲醇：冰醋酸(9∶1)固定，核-4乳胶(中国科学院原子能所)涂片，4℃曝光6d，ID196显影液19℃显影4min，20℃酸性坚膜定影液定影15min，流水冲洗30min，晾干，Giemsa染色，镜检，核内有5个以上银颗粒计为阳性[1]。
结 果
1.p21Cip1在V79-8细胞中存在与人和小鼠不同的两个转录本
Northern杂交的结果表明，V79-8细胞中p21存在两个转录本，除了与人和小鼠相似的约2.1kb的转录本外，还存在1个1.6kb左右的转录本(图1)[5]。
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2.建立高表达人p21的细胞株V79-8-SC
重组质粒pXJSC经载体HCMV启动子在体内转录p21的转录本大小应为1.7kb左右，略大于V79-8本身的第2个转录本。
Northern杂交检测转染细胞中p21mRNA的表达情况，转染pXJSC的第3个克隆(图2d)与前两个克隆及转染V79-8-neo的对照组(图2b,c,a)相比，前者明显存在略大于1.6kb的p21 mRNA的表达。密度扫描比较杂交结果的第2条带与第1条带的相对值，对照组V79-8-neo及转染pXJSC的前两个克隆中两者比值约为0.59～0.67，而第3个克隆的比值为1.03，说明pXJSC可在该细胞克隆中有效表达人p21，因此确定为阳性细胞株V79-8-SC。
免疫印迹的结果进一步证明V79-8-SC中p21蛋白的表达是V79-8-neo的1.5倍(图3)。
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图1 Northern杂交分析p21在HeLa及V79-8细胞中的表达a:HeLa; b:V79-8
Fig.1 Northern blotting analysis of theexpression of p21 in HeLa and V79-8 cellsa:HeLa; b:V79-8
图2 Northern杂交鉴定高表达p21的细胞克隆
a:转染pXJ41-neo的对照细胞克隆
b,c,d:转染pXJ41SC的细胞克隆
Fig.2 Northern blotting testing cellclones which have higher human
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p21 expressiona:control cell clone transfectedwith pXJ41-neo
b,c,d: cell clones transfected with pXJSC
图3 免疫印迹鉴定V79-8-SC中p21蛋白的表达
a:V79-8-neo; b:V79-8-SC
Fig.3 Western blotting analysis ofp21 protein expression
a:V79-8-neo; b:V79-8-SC
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3.p21使V79-8细胞的G1期明显增长
在相差显微镜下观察相同密度的V79-8-SC及V79-8-neo细胞的形态，发现V79-8-SC细胞趋近于上皮样细胞，细胞更铺展；而V79-8-neo细胞为细长的梭形，呈典型的成纤维细胞状(图4)，与V79-8细胞形态相似。
流式细胞光度术(FCM)的结果显示，V79-8-SC G1、S期细胞分别为47%和38%，而V79-8-neo为37%和49%，前者G1期细胞增加了10%，说明它的G1期明显增长。G2+M期细胞V79-8-SC则为15%，V79-8-neo为13%，说明前者的G2期也稍有增长(图5)。
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图5 V79-8-neo及V79-8-SC的FCM分析a：V79-8-neo; b:V79-8-SC
Fig.5 FCM analysis of V79-8-neo and V79-8-SC cellsa：V79-8-neo; b:V79-8-SC
图6 生长曲线a：V79-8-neo; b:V79-8-SC
Fig.6 Growth curvesa：V79-8-neo; b:V79-8-SC
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生长曲线表明，V79-8-SC生长较V79-8-neo慢，前者倍增时间(GT)为14.15h，而后者为11.94h(图6)。[3H]胸腺嘧啶核苷参入法统计S期细胞百分比，并统计M期细胞的百分比，(每种细胞至少统计500个)，结果如下：
M
S
G1+G2
V79-8-SC
4.0%
70.4%
25.6%
V79-8-neo
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4.5%
82.6%
25.9%
以上结果似乎与FCM的结果有出入，这种差异来自于两者方法上的不同。[3H]胸腺嘧啶核苷参入法以是否标记上[3H]胸腺嘧啶核苷来划分是否属于S期，而FCM是以DNA的含量来决定细胞分期的，如果细胞只有极少量的DNA合成，那么用前一方法将归为S期，用后一方法则归为G1期；同样，当细胞只有极少量的DNA未合成时，那么用前一方法也归为S期，用后一方法归为G2期。而以[3H]胸腺嘧啶核苷参入法区分S期细胞，计算S期的长度则更接近实际情况。因此，计算各时相长短(h)如下：
M
S
G1+G2
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GT
V79-8-SC
0.57
9.96
3.62
14.15
V79-8-neo
0.54
9.86
1.54
11.94
可见V79-8-SC、G1+G2较V79-8-neo延长了2.08h，结合FCM的结果可以断定这主要是G1期延长的结果，而G2的延长也有较小的贡献。
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4.cyclin、CDK及Id基因在V79-8-SC中的表达明显降低
Northern杂交并经密度扫描校正后的结果表明(附表)，在G1期起调控作用的cyclinD1、CDK4、Id的表达在V79-8-SC中都较对照细胞V79-8-neo有明显的降低，而CyclinD3的变化不明显。作为G1期的cyclin，cyclinD1可以和CDK2、4、5结合形成激酶复合物[6]，而CDK4则在限制点R起重要的作用[6,7]，CDK4-cyclinD的关键底物是Rb相关蛋白，它被磷酸化后可释放转录因子E2F，促进G1/S的转换[8，9]。Id基因为分化抑制基因，具有抑制分化、促进增殖的作用，也是G1期的调控因子，在肌肉细胞中，Id基因的表达可以拮抗肌源性b-HLH调节因子(如MyoD)的作用，以达到抑制肌肉细胞分化的作用，说明Id基因在成纤维细胞的分化与增殖中起一定的作用[10]。因此，cyclinD1、CDK4、Id三者表达水平的降低对V79-8-SC G1期的明显延长有所影响。
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此外，cyclinB1的表达在V79-8-SC中也有所降低。cdc2-cyclinB1在G2、M期，特别是在G2/M转换点促进细胞周期的进程[11]。CyclinB1表达水平降低是造成V79-8-SC G2期增长的原因之一。
附表 Northern blot检测比较一些周期调控因子在两种细胞中mRNA表达水平(密度扫描值)
Table Comparation of mRNA expression level of some cell cycle control factors in
two cell types by Northern blot (screening densities value)
cyclinD1
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cyclinD3
CDK4
Id
cyclinB1
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
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特定探针
specific probes
342.0
398.4
162.8
142.4
325.2
226.2
411.1
250.3
293.9
302.4
, http://www.100md.com β-肌动蛋白
β-actin
376.3
570.3
307.5
319.3
307.5
319.3
761.9
739.4
268.2
362.6
校正值
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corrected value
0.909
0.699
0.529
0.446
1.058
0.708
0.540
0.339
1.096
0.834
A:V79-8-neo; B:V79-8-SC讨 论
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我们所用的对照组的细胞，V79-8-neo的细胞周期与Liskay所提到的V79-8细胞有所差异，前者的GT(11.94h)比后者的(10h)长[1]，这种差异来自于两个方面：首先，两者的培养条件不同，我们的培养基为DMEM+10%小牛血清，而Liskay为DMEM+15%胎牛血清[1]；其次，V79-8-neo细胞转染了pXJ41-neo空载体并经过了G418的筛选。V79-8-neo与V79-8-SC经过了同样的实验过程，以它作为参照，应该能显示p21对V79-8细胞周期造成的影响。
p21是一个广泛的CDK抑制因子，它优先和G1/S的CDKs结合[12]，但也能和含cyclinB的复合物结合[13]。p21导入V79-8细胞使细胞中p21水平上升，抑制G1 CDKs的活性，使G1期明显延长，同时它也对G2期CDKs稍有抑制，而使G2期略有增加。此外，细胞的周期实际上是受一个调控网络支配，网络中的某一个因子水平的变化，必然会通过一系列反馈途径影响其他因子表达的变化以达到一个平衡状态。因此，p21的导入也使G1期的调控因子cyclinD1、CDK4、Id以及G2期的cyclinB1的表达水平下降。
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V79-8这一快速增殖的细胞系，DNA合成及染色单体分离交替进行，两者之间几乎没有间隔，有研究认为V79-8细胞中持续存在高于阈值的DNA合成诱导物，甚至在M期也是如此[14]。可以认为在G1/S及S早期起作用的CDK-cyclin就属于这些诱导物[15]，这些因子在V79-8的周期中高表达造成了这一细胞的快速增殖。在我们以往的研究中，将反义CDK4及cyclinD3导入这一细胞使它的G1期明显延长，而导入反义cyclinB1则使它的G2期延长(待发表)。说明这些因子的高表达造成了V79-8细胞G1、G2期的缺失。
在细胞周期中，p21作为CKI起着水坝和水闸的作用，cyclin积累到一定量超出“水坝的高度”就触发“水闸开放”——CKI失活或降解，CDK-cyclin就可表现活性[14]。p21在V79-8细胞中作为“水坝”，其高度可能是很低的，而导入p21使“水坝”增高就出现了明显的G1期的延长。我们的工作还显示V79-8中还存在一个P21的1.6kb左右的转录本，这是否影响了V79-8-neo细胞周期的调控，有待进一步研究证实。
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收稿 1997-05 修回 1997-12
图版说明
图4 相差显微镜下比较V79-8-neo和V79-8-SC的形态(×100)a,b,c:V79-8-neo; d,e,f:V79-8-SC
Explanation of figures
Fig.4 Differen morphology of V79-8-neo and V79-8-SC cells under contrast phase microscope
a,b,c:V79-8-neo; d,e,f:V79-8-SC
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* 国家自然科学基金资助课题(No.39430080)
参考文献
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[3]贾熙华，肖成祖. MTT比色法在微囊培养动物细胞计数中的应用.军事医学科学院院刊，1993，17(3)：207
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THE EFFECT OF p21Cip1 GENE ON CELL CYCLE
REGULATION OF V79-8 CELLS
Jiang Hong, Feng Jie, Wang YongchaoΔ
, 百拇医药
(Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, Beijing Normal University, Beijing)
To explore the molecular mechanism of cell cycle control disorder of the cell line, V79-8 which has no detectable G1 and G2 phases, we constructed human negative cell cycle control gene p21Cip1, eukaryoticaly expressing recombinant pXJSC, and transfected it into V79-8 to establish V79-8-sc cell line, which had higher p21 expression. By using 3HTdR autoradiography, FCM, cell growth curve measurement, and Northern botl techniques to measure and compare the changes of cell cycle time,and cell proliferation-related gene expression, we found that V79-8-sc cells have obviously lengthened G1 phase and slightly lengthened G2 phase comparing with control V79-8-neo cells. At the same time, the expression of G1 regulators, such as cyclin D1, CDK4, and Id are obviously decreased and the G2 regulator cyclinB1 is also decreased. From all the results, we recognized that the failure in cell cycle might be due to the discordance of p21cip1, CDKs/cyclins and its related gene expression.
KEY WORDS V79-8 cells; p21Cip1 gene; Cell cycle regulation; Transfection
△Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875, China, 百拇医药
单位：北京师范大学生物学系细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875
关键词：V79-8细胞；p21Cip1基因；细胞周期调控；转染
解剖学报980310 摘 要 为了探讨缺乏可测出G1、G2期V79-8细胞株的细胞周期失调的分子机理，构建了人的周期负调控基因p21Cip1的可表达重组质粒pXJSC，转染该细胞系，建立了高表达p21的V79-8-SC细胞。以3HTdR放射自显影法，流式细胞光度术，细胞增殖曲线测定及免疫印迹技术，检测及比较了与细胞周期变化和增殖有关基因的表达，发现该细胞较对照细胞V79-8-neoG1期明显延长，G2期也稍有增加。与此同时，G1期调控的cyclinD1、CDK4、Id基因表达明显下降，G2期调控基因cyclinB1的表达也有所下降。结果表明：此细胞系的细胞周期缺陷可能由于p21Cip1、CDKs/cyclins及其相关基因的表达失调所致。
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V79-8是一种增殖速度非常快的中国仓鼠肺成纤维细胞系(Chinese hamster lung fibroblast)，它的倍增时间仅为9.5～10h[1,2]。该细胞由Elkind和Sutton于1960年从其母细胞系V79转化而来，V79最初由Ford和Yerganian于1958年建系。1967年,Robbins和Scherff用[3H]胸腺嘧啶核苷参入法([3H]thymidine incorporation assay)首次发现V79-8细胞缺乏可检测的G1期，1977年Liskay[1]用同样的方法证实V79和V79-8也缺乏可检测的G2期。V79-8具有非常短的G1、G2期这一特性，为研究高等真核细胞G1期、G1/S、G2/M转换的调控提供了很好的模型。
通过Northern杂交检测，我们曾发现V79-8细胞中cyclinD1、cyclinD3及Id mRNA的表达明显高于V79细胞(待发表)，由此推测这些G1期调控因子的高表达可能造成了V79-8细胞G1期的缺失，所以如果人为地改变G1期调控因子的表达，就有可能使V79-8细胞的G1期明显延长，从而可在体内研究它们对细胞周期造成的影响。此外，我们的结果显示，V79-8细胞中p21与人和小鼠不同，有两个转录本。
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材料和方法
1.细胞培养
V79-8细胞由美国MD Anderson肿瘤中心PN Rao教授赠送，培养于DMEM(GIBCOL BRL)培养基(10%小牛血清，108IU/L青霉素，100mg/L链霉素)，37℃，5%CO2的孵育箱中。
2.G418剂量预实验
处于对数生长期的V79-8细胞以3×103细胞/cm2接种，培养过夜，待细胞完全贴壁后，分别以含G418(GIBCOL BRL)100、200、400、600、800mg/L的新鲜培养基换液，平行3组对照，每3d换1次液，换3次(9d)后，选择G418致死细胞的最小浓度。由此测得G418筛选V79-8细胞的药物浓度为400mg/L。
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3.真核表达p21Cip1重组质粒的构建及V79-8-SC细胞株的建立
用限制性内切酶XhoI/KpnI将p21 cDNA从p21-pGEX-2TKcs质粒上切下，正向克隆至真核表达载体pXJ41-neo的多克隆位点处。
构建的重组质粒pXJSC用磷酸钙法转染V79-8细胞(转染时细胞汇合度约为30%)。48h后细胞培养于含400mg/L G418的培养液中筛选阳性细胞，2～3d换液1次，细胞长满可传代继续筛选。10d之后，细胞以10个/cm3接种，长成肉眼可见的集落，分别挑入24孔板中，长满后转入大方瓶培养，转染的细胞始终以400mg/L的培养基保种。以Northern杂交及免疫印迹鉴定阳性细胞中p21的表达。
同时，pXJ41-neo空载体转染细胞以建立对照细胞株V79-8-neo。
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4.Northern杂交
细胞总RNA用异硫氰酸胍一步法提取，上样量为15μg，1%甲醛变性凝胶电泳后，真空转移至尼龙膜上，杂交探针为自制的体外转录[α-32P]rUTP标记单链反义RNA，探针来源、RNA聚合酶及转录本长度如下：pXJ41-p21Cip1(antisense)-T7-1kb; pGEM3z-β-actin-sp6-0.5kb; pSK-CDK4-T3-1.3kb; pGEM4z-CycD1-sp6-1.14kb; pXJ41-CycD3 (antisense)-T7-1.96kb; pSK-Id-T7-0.93kb; pXJ41-CycB1(antisense)-T7-1.45kb。如果需要，每张膜均做β-actin内参照，每次杂交结果均用密度扫描校正。
5.免疫印迹
取对数生长的细胞(一大方瓶)，加入200μl 85℃ 1×SDS上样缓冲液裂解细胞。裂解液在水浴中煮沸10min，10 000g，离心10min，取上清。Lowry法定量，每孔上样100μg，10%SDS-PAGE电泳，石墨电极半干转移至硝酸纤维素膜上，一抗为兔抗人p21 IgG(本室制备)，二抗为碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG(Promega)，结果用同样的上样量电泳后考马斯亮蓝R-250染色为内参照经密度扫描校正。
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6.生长曲线测定(MTT法)
培养于24孔板的细胞，0.5ml培养液中加50μl MTT(5g/L,溶于PBS)，37℃孵育3h，加0.5ml DTW脱色液(1份Triton X-100溶于3份DMF中，摇匀后加入2份去离子水，加枸橼酸至0.2mol/L，pH5～6)，空白对照以0.5ml培养基代替，于570nm处读取OD值[3]，每隔12h测量1个点，每个点为3次测量的平均值。
7.流式细胞光度术(FCM)
细胞用胰酶消化后，离心收集，用冰冷的PBS洗，然后在80%乙醇-20℃固定。12h后，样品用冰冷的PBS洗3次，加入200mg/L无DNase的RNase，37℃保温30min，之后加入1g/L的碘化丙啶(propidium iodide, Sigma)，37℃保温30min，样品在4℃避光保存，并在24h内测量[4]，每种样品做3个平行组。
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8.[3H]胸腺嘧啶核苷参入及放射自显影
取对数生长的细胞，加入4mCi/L[3H]胸腺嘧啶核苷(上海核子所)脉冲标记20min，细胞用甲醇：冰醋酸(9∶1)固定，核-4乳胶(中国科学院原子能所)涂片，4℃曝光6d，ID196显影液19℃显影4min，20℃酸性坚膜定影液定影15min，流水冲洗30min，晾干，Giemsa染色，镜检，核内有5个以上银颗粒计为阳性[1]。
结 果
1.p21Cip1在V79-8细胞中存在与人和小鼠不同的两个转录本
Northern杂交的结果表明，V79-8细胞中p21存在两个转录本，除了与人和小鼠相似的约2.1kb的转录本外，还存在1个1.6kb左右的转录本(图1)[5]。
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2.建立高表达人p21的细胞株V79-8-SC
重组质粒pXJSC经载体HCMV启动子在体内转录p21的转录本大小应为1.7kb左右，略大于V79-8本身的第2个转录本。
Northern杂交检测转染细胞中p21mRNA的表达情况，转染pXJSC的第3个克隆(图2d)与前两个克隆及转染V79-8-neo的对照组(图2b,c,a)相比，前者明显存在略大于1.6kb的p21 mRNA的表达。密度扫描比较杂交结果的第2条带与第1条带的相对值，对照组V79-8-neo及转染pXJSC的前两个克隆中两者比值约为0.59～0.67，而第3个克隆的比值为1.03，说明pXJSC可在该细胞克隆中有效表达人p21，因此确定为阳性细胞株V79-8-SC。
免疫印迹的结果进一步证明V79-8-SC中p21蛋白的表达是V79-8-neo的1.5倍(图3)。
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图1 Northern杂交分析p21在HeLa及V79-8细胞中的表达a:HeLa; b:V79-8
Fig.1 Northern blotting analysis of theexpression of p21 in HeLa and V79-8 cellsa:HeLa; b:V79-8
图2 Northern杂交鉴定高表达p21的细胞克隆
a:转染pXJ41-neo的对照细胞克隆
b,c,d:转染pXJ41SC的细胞克隆
Fig.2 Northern blotting testing cellclones which have higher human
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p21 expressiona:control cell clone transfectedwith pXJ41-neo
b,c,d: cell clones transfected with pXJSC
图3 免疫印迹鉴定V79-8-SC中p21蛋白的表达
a:V79-8-neo; b:V79-8-SC
Fig.3 Western blotting analysis ofp21 protein expression
a:V79-8-neo; b:V79-8-SC
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3.p21使V79-8细胞的G1期明显增长
在相差显微镜下观察相同密度的V79-8-SC及V79-8-neo细胞的形态，发现V79-8-SC细胞趋近于上皮样细胞，细胞更铺展；而V79-8-neo细胞为细长的梭形，呈典型的成纤维细胞状(图4)，与V79-8细胞形态相似。
流式细胞光度术(FCM)的结果显示，V79-8-SC G1、S期细胞分别为47%和38%，而V79-8-neo为37%和49%，前者G1期细胞增加了10%，说明它的G1期明显增长。G2+M期细胞V79-8-SC则为15%，V79-8-neo为13%，说明前者的G2期也稍有增长(图5)。
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图5 V79-8-neo及V79-8-SC的FCM分析a：V79-8-neo; b:V79-8-SC
Fig.5 FCM analysis of V79-8-neo and V79-8-SC cellsa：V79-8-neo; b:V79-8-SC
图6 生长曲线a：V79-8-neo; b:V79-8-SC
Fig.6 Growth curvesa：V79-8-neo; b:V79-8-SC
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生长曲线表明，V79-8-SC生长较V79-8-neo慢，前者倍增时间(GT)为14.15h，而后者为11.94h(图6)。[3H]胸腺嘧啶核苷参入法统计S期细胞百分比，并统计M期细胞的百分比，(每种细胞至少统计500个)，结果如下：
M
S
G1+G2
V79-8-SC
4.0%
70.4%
25.6%
V79-8-neo
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4.5%
82.6%
25.9%
以上结果似乎与FCM的结果有出入，这种差异来自于两者方法上的不同。[3H]胸腺嘧啶核苷参入法以是否标记上[3H]胸腺嘧啶核苷来划分是否属于S期，而FCM是以DNA的含量来决定细胞分期的，如果细胞只有极少量的DNA合成，那么用前一方法将归为S期，用后一方法则归为G1期；同样，当细胞只有极少量的DNA未合成时，那么用前一方法也归为S期，用后一方法归为G2期。而以[3H]胸腺嘧啶核苷参入法区分S期细胞，计算S期的长度则更接近实际情况。因此，计算各时相长短(h)如下：
M
S
G1+G2
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GT
V79-8-SC
0.57
9.96
3.62
14.15
V79-8-neo
0.54
9.86
1.54
11.94
可见V79-8-SC、G1+G2较V79-8-neo延长了2.08h，结合FCM的结果可以断定这主要是G1期延长的结果，而G2的延长也有较小的贡献。
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4.cyclin、CDK及Id基因在V79-8-SC中的表达明显降低
Northern杂交并经密度扫描校正后的结果表明(附表)，在G1期起调控作用的cyclinD1、CDK4、Id的表达在V79-8-SC中都较对照细胞V79-8-neo有明显的降低，而CyclinD3的变化不明显。作为G1期的cyclin，cyclinD1可以和CDK2、4、5结合形成激酶复合物[6]，而CDK4则在限制点R起重要的作用[6,7]，CDK4-cyclinD的关键底物是Rb相关蛋白，它被磷酸化后可释放转录因子E2F，促进G1/S的转换[8，9]。Id基因为分化抑制基因，具有抑制分化、促进增殖的作用，也是G1期的调控因子，在肌肉细胞中，Id基因的表达可以拮抗肌源性b-HLH调节因子(如MyoD)的作用，以达到抑制肌肉细胞分化的作用，说明Id基因在成纤维细胞的分化与增殖中起一定的作用[10]。因此，cyclinD1、CDK4、Id三者表达水平的降低对V79-8-SC G1期的明显延长有所影响。
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此外，cyclinB1的表达在V79-8-SC中也有所降低。cdc2-cyclinB1在G2、M期，特别是在G2/M转换点促进细胞周期的进程[11]。CyclinB1表达水平降低是造成V79-8-SC G2期增长的原因之一。
附表 Northern blot检测比较一些周期调控因子在两种细胞中mRNA表达水平(密度扫描值)
Table Comparation of mRNA expression level of some cell cycle control factors in
two cell types by Northern blot (screening densities value)
cyclinD1
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cyclinD3
CDK4
Id
cyclinB1
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
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特定探针
specific probes
342.0
398.4
162.8
142.4
325.2
226.2
411.1
250.3
293.9
302.4
, http://www.100md.com β-肌动蛋白
β-actin
376.3
570.3
307.5
319.3
307.5
319.3
761.9
739.4
268.2
362.6
校正值
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corrected value
0.909
0.699
0.529
0.446
1.058
0.708
0.540
0.339
1.096
0.834
A:V79-8-neo; B:V79-8-SC讨 论
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我们所用的对照组的细胞，V79-8-neo的细胞周期与Liskay所提到的V79-8细胞有所差异，前者的GT(11.94h)比后者的(10h)长[1]，这种差异来自于两个方面：首先，两者的培养条件不同，我们的培养基为DMEM+10%小牛血清，而Liskay为DMEM+15%胎牛血清[1]；其次，V79-8-neo细胞转染了pXJ41-neo空载体并经过了G418的筛选。V79-8-neo与V79-8-SC经过了同样的实验过程，以它作为参照，应该能显示p21对V79-8细胞周期造成的影响。
p21是一个广泛的CDK抑制因子，它优先和G1/S的CDKs结合[12]，但也能和含cyclinB的复合物结合[13]。p21导入V79-8细胞使细胞中p21水平上升，抑制G1 CDKs的活性，使G1期明显延长，同时它也对G2期CDKs稍有抑制，而使G2期略有增加。此外，细胞的周期实际上是受一个调控网络支配，网络中的某一个因子水平的变化，必然会通过一系列反馈途径影响其他因子表达的变化以达到一个平衡状态。因此，p21的导入也使G1期的调控因子cyclinD1、CDK4、Id以及G2期的cyclinB1的表达水平下降。
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V79-8这一快速增殖的细胞系，DNA合成及染色单体分离交替进行，两者之间几乎没有间隔，有研究认为V79-8细胞中持续存在高于阈值的DNA合成诱导物，甚至在M期也是如此[14]。可以认为在G1/S及S早期起作用的CDK-cyclin就属于这些诱导物[15]，这些因子在V79-8的周期中高表达造成了这一细胞的快速增殖。在我们以往的研究中，将反义CDK4及cyclinD3导入这一细胞使它的G1期明显延长，而导入反义cyclinB1则使它的G2期延长(待发表)。说明这些因子的高表达造成了V79-8细胞G1、G2期的缺失。
在细胞周期中，p21作为CKI起着水坝和水闸的作用，cyclin积累到一定量超出“水坝的高度”就触发“水闸开放”——CKI失活或降解，CDK-cyclin就可表现活性[14]。p21在V79-8细胞中作为“水坝”，其高度可能是很低的，而导入p21使“水坝”增高就出现了明显的G1期的延长。我们的工作还显示V79-8中还存在一个P21的1.6kb左右的转录本，这是否影响了V79-8-neo细胞周期的调控，有待进一步研究证实。
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收稿 1997-05 修回 1997-12
图版说明
图4 相差显微镜下比较V79-8-neo和V79-8-SC的形态(×100)a,b,c:V79-8-neo; d,e,f:V79-8-SC
Explanation of figures
Fig.4 Differen morphology of V79-8-neo and V79-8-SC cells under contrast phase microscope
a,b,c:V79-8-neo; d,e,f:V79-8-SC
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* 国家自然科学基金资助课题(No.39430080)
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THE EFFECT OF p21Cip1 GENE ON CELL CYCLE
REGULATION OF V79-8 CELLS
Jiang Hong, Feng Jie, Wang YongchaoΔ
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(Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, Beijing Normal University, Beijing)
To explore the molecular mechanism of cell cycle control disorder of the cell line, V79-8 which has no detectable G1 and G2 phases, we constructed human negative cell cycle control gene p21Cip1, eukaryoticaly expressing recombinant pXJSC, and transfected it into V79-8 to establish V79-8-sc cell line, which had higher p21 expression. By using 3HTdR autoradiography, FCM, cell growth curve measurement, and Northern botl techniques to measure and compare the changes of cell cycle time,and cell proliferation-related gene expression, we found that V79-8-sc cells have obviously lengthened G1 phase and slightly lengthened G2 phase comparing with control V79-8-neo cells. At the same time, the expression of G1 regulators, such as cyclin D1, CDK4, and Id are obviously decreased and the G2 regulator cyclinB1 is also decreased. From all the results, we recognized that the failure in cell cycle might be due to the discordance of p21cip1, CDKs/cyclins and its related gene expression.
KEY WORDS V79-8 cells; p21Cip1 gene; Cell cycle regulation; Transfection
△Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875, China, 百拇医药