实验犬环杓后肌功能重建的组织化学研究及图像分析*
作者：黄秀琴 蒋淑萱** 吴 平* 张德芳* 王正强*梁伟平* 陈贤明* 马丽梅 李 坪
单位：昆明医学院组织学胚胎学教研室，**寄生虫学教研室，昆明 650031 *昆明医学院附属二院耳鼻咽喉科
关键词：声带麻痹；环杓后肌；神经肌蒂；组织化学；图像分析
解剖学报/980422 摘 要 为了确定并比较实验犬两种不同术式：Ⅰ.颈袢胸骨舌骨肌支肌蒂移植术；Ⅱ.副神经胸锁乳突肌支肌蒂移植术，治疗声带麻痹的效果。建立单侧联合性声带麻痹动物模型，分别用Ⅰ、Ⅱ两种术式移植神经肌蒂于失神经的环杓后肌(PCAM)。术后4个月取各组PCAM做超微结构检查，并做光镜组织化学：乙酰胆碱酯酶(AChE)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、糖原(PAS)反应。用图像分析定量并测示肌纤维直径。结果发现两种术式都能使PCAM恢复功能，第Ⅱ种术式组织化学结果优于第Ⅰ种术式。为治疗声带麻痹提供了重要的理论根据。
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喉部肿瘤、创伤、手术等可引起喉麻痹。当双侧损伤时声带固定于旁中位，常引起严重的呼吸困难。永久性气管造瘘、杓状软骨切除或声带外移等治疗方法，均累及发音功能，并易发生各种并发症。因此实现环杓后肌(posterior cricoarytenoid muscle,PCAM)神经再支配来恢复声带外展功能是更为合理的治疗方法。神经肌蒂(neuromuscular pedicle,NMP)移植术被认为是实现喉内肌神经再支配的有效方法[1]。本研究通过对实验犬进行两种不同术式NMP移植于失神经的PCAM后，进行电镜、光镜的形态结构观察，并做组织化学图像定量分析，比较两种术式治疗声带麻痹的效果，现报道如下：
材料和方法
1. 建立单侧联合性声带麻痹动物模型[2]
健康成年犬20只，体重8～12kg,雌雄兼用，全麻下先后切断左喉上神经外侧支和左喉返神经，并剪掉2cm，造成左侧联合性声带麻痹。切断神经后，再行肌电图检查，证实已切断的神经与相应肌肉间的连接已不存在，单侧联合性声带麻痹模型建立。
, 百拇医药
2. 神经肌蒂移植术
将上述实验犬随机分为A、B、D 3组。A组为手术Ⅰ组，在左PCAM中部移植左颈袢胸骨舌骨肌支NMP。 B组为手术Ⅱ组，在左PCAM中部移植左副神经胸锁乳突肌NMP。 D组不作NMP移植。术后注射青霉素2d。A、B、D 3组在同等条件下饲养4个月。
3. 取材
术后4个月各组犬完成发音及肌电图检查后，完整取下PCAM及部分环杓侧肌及环甲肌。观察各肌肉一般形态、大小、体积并行两侧比较。A组共取术侧PCAM 8个样本(因有1只犬病死)。B组共取术侧PCAM8个样本(因有1只犬中途死亡)。D组取术侧PCAM、环杓侧肌各2个样本，另取B组术侧环甲肌2个样本，共计6个样本，作为去神经后，非移植组对照。取A、B、D各组健侧PCAM共18个样本以及D组健侧环杓侧肌2个样本，合计20个样本作为正常对照，并设为C组。
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4. 形态结构观察
(1) 石蜡包埋切片，做HE染色及AgNO3染色。(2)磷钨酸苏木精(PTAH)染色。(3) Carnoy加1%高碘酸混合固定液固定氧化24h做PAS整块染色。(4)氯化金染色铺片显示运动终板(motor end-plate,MEP)。(5)做超薄切片，在JEM-100CX型电子显微镜下观察肌纤维及神经形态结构并摄片。
附表 实验犬环杓后肌功能重建的组织化学、肌纤维直径
图像分析结果及显著性检验
Table Histochemistry and image analysis
of muscle fiber's diameters on recovery of
, 百拇医药
posterior cricoarytenoid muscle's
function in Dog and its significance test 名 称
name
组别
group
样本数
number of
sample
细胞数
number
of cell
±s
, http://www.100md.com
乙酰胆碱酯酶
A
8
400
6.6116±
1.1943▲
AChE
B
8
400
7.7309±
0.9594△
, http://www.100md.com C
20
1 000
8.4484±
0.5188
琥珀酸脱氢酶
A
8
400
5.3705±
0.8697*
SDH
B
, 百拇医药
8
400
5.8253±
1.1543*
C
20
1 000
7.1233±
0.8262
D
6
300
2.7049±
, 百拇医药
0.4865*
三磷酸腺苷酶
A
8
400
4.5080±
0.8094△
ATPase
B
8
400
4.8641±
, 百拇医药 1.3056△
C
20
1 000
5.1666±
0.9545
D
6
300
2.0951±
0.5224*
糖 原
A
, 百拇医药
8
400
4.0163±
1.0092△
glycogen
B
8
400
4.2812±
1.1722△
C
20
, 百拇医药 1 000
4.7574±
1.1136
D
6
300
1.6509±
0.5460*
肌纤维直径(μm)
A
8
400
53.2424±
, 百拇医药
14.2672△
muscle fiber
B
8
400
53.6242±
13.0088△
diameter
C
20
1 000
57.4321±
, http://www.100md.com
13.9433
D
6
300
10.7975±
4.7848*
D组未见MEP，故未测AChE No MEP in D group and AChE isn't tested
组间相比：*P<0.01 Comparison between groups: *P<0.01
与对照组比：△P>0.05 Comparison with control group:△P>0.05
, 百拇医药
A组与B组比：▲P<0.05 Comparison between A group and B group:▲P<0.05
5. 酶组织化学染色
在-13℃恒冷箱下连续切片(厚6μm)，分别做如下几种染色：(1)HE染色；(2) 铜-铅-硫胆碱法[3]显示AChE。(3)胆碱酯酶和肌内神经纤维合并染色法[4]，显示神经纤维及MEP。(4)四唑盐法[5]显示SDH。(5)钙钴法[5]显示ATPase。去底物孵育作为阴性对照。
6. 定量分析
各酶组织化学显示的阳性部位用英国剑桥公司的Quantiment-900图像分析仪分别测示其光密度值，作定量分析。并测肌纤维直径。
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7. 统计方法
所得数据输入IBM586计算机，采用《医百*医统》软件包进行方差分析，q检验或秩和检验。
结 果
1. 各组样本组织化学及肌纤维直径图像分析结果及显著性检验(附表)
2. HE染色及PTAH染色
可见C组PCAM肌纤维排列整齐，横纹结构清晰可见，可分辨红白肌。A组、B组PCAM形态、大小基本接近正常，横纹清晰可见(图1)。D组肌纤维细，明显萎缩，肌纤维排列松散，横纹不清晰。部分肌纤维变性、坏死、消失，肌间结缔组织明显增生，炎性细胞、吞噬细胞大量出现，局部有出血(图2)。
3.HE染色、PTAH染色、AgNO3染色
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在A、B、C组都可以看到神经(图3)。D组未看到神经。
图1 A组PCAM。↑.红肌 ▲.白肌 PTAH染色，石蜡切片 ×400
图2 D组PCAM。★.萎缩的肌纤维 ▲.结缔组织 ↑.炎性细胞 HE染色，石蜡切片 ×400
图3 B组PCAM。▲.神经 ↑.肌纤维 PTAH染色 ×40
Fig.1 PTAH staining, paraffin section, A group PCAM. red muscle(↑) white muscle(▲) ×400
Fig.2 HE staining, paraffin section, D group PCAM. atrophic muscle fiber (★) connective tissue(▲) phlogolic cells(↑) ×400
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Fig.3 PTAH staining, B group PCAM.nerve(▲) muscle fiber(↑) ×40
4. AChE与AgNO3联合染色
冰冻切片，A、B组均可见到许多粗大的神经纤维及MEP(图4)。D组失神经支配的肌纤维中几乎无MEP， 肌纤维明显萎缩。氯化金染色铺片可见A组、B组PCAM植入NMP后，通过肌蒂中切断的神经支和神经纤维再生形成新的MEP(图5)。可以看到PCAM中以肌蒂为中心，神经末梢芽生长入MEP内并向周围扩张，其范围大大超过了肌蒂范围。冰冻切片，C组在纵切肌纤维中段，可见较清楚的单MEP， 排列整齐，MEP呈椭圆形斑块状(图6)。A组、B组分布同C组，形态基本规则，但偶见形态较小的MEP，染色稍淡，为尚未成熟的MEP。
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图4 B组PCAM。▲.有髓神经纤维 ↑.运动终板 AChE+AgNo3染色，冰冻切片 ×400
图5 A组运动终板。★.神经 ▲.肌纤维 ↑.运动终板 氯化金染色，铺片 ×200
图6 C组PCAM纵切面。↑.单运动终板 ▲.肌纤维 AChE+AgNo3染色，冰冻切片 ×200
Fig.4 AChE+AgNO3 staining, frozen section, B group PCAM. medullary nerve fiber(▲) motor end-plate(↑) ×400
Fig.5 Auric chloride staining, bed-section, A group motor end-plate. nerve(★) muscle fiber(▲) motor end-plate(↑) ×200
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Fig.6 AChE+AgNO3 staining, frozen section, C group PCAM longitudinal setion. single motor end-plate(↑) muscle fiber(▲)×200
5. SDH
C组光镜下可见SDH阳性产物为蓝色甲
颗粒。红肌纤维颗粒多，呈深蓝色。白肌纤维颗粒少呈浅蓝色。中间肌居于两者之间。A组、B组与D组相比，已有了显著恢复，肌纤维形态接近于C组，但SDH阳性反应仍较C组差(图7)。D组肌纤维明显萎缩变细，SDH反应颗粒明显减少，颜色变浅(图8)。
图7 B组PCAM。▲.白肌纤维 ↑.红肌纤维 SDH冰冻切片 ×400
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图8 D组PCAM。↑.萎缩的肌纤维 SDH冰冻切片 ×200
Fig.7 SDH frozen section, B group PCAM. white muscle fiber(▲) red muscle fiber(↑) ×400
Fig.8 SDH frozen section, D group PCAM. atrophic muscle fiber(↑) ×200
6. ATPase
光镜下可见C组PCAM白肌纤维色深呈棕黑色，红肌纤维呈浅黑色。白肌纤维以无氧酵解为主，故ATPase活性高。D组肌纤维细ATPase色浅。A组、B组已明显恢复，接近于C组(图9)。
7. 阴性对照
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去底物对照标本均呈阴性反应。
8. PAS整块染色
C组光镜下可见PAS阳性反应为红色颗粒，色深、颗粒多粗大，A组、B组基本恢复正常(图10)。D组萎缩的细肌纤维糖原颗粒少，色浅(图11)。
图9 B组PCAM。↑.白肌 ▲.红肌 ATPase冰冻切片 ×400
图10 A组PCAM。PAS糖原颗粒较多 PAS整块染色，石蜡切片 ×200
图11 D组PCAM。PAS糖原颗粒较少 PAS整块染色，石蜡切片 ×200
Fig.9 ATPase frozen section, B group PCAM. white muscle fiber(▲) red muscle fiber(↑) ×400
, 百拇医药
Fig.10 PAS massive staining, paraffin section, A group PCAM. PAS glycogen granule increase greatly(↑) ×200
Fig.11 PAS massive staining, paraffin section, D group PCAM. PAS glycogen granule decrease greatly(↑) ×200
9. 电镜
透射电镜检查结果：A组、B组PCAM形态结构恢复正常(图13，14)。少数可见肌收缩带。远侧端确具神经纤维Waller变性及相应的雪旺细胞增生，神经纤维再生，部分纤维胞质内已可见小的轴突(图15)。并可见Büngner带。
, 百拇医药
图12～15 为术后4个月PCAM电镜照片
图12 C组PCAM， 肌纤维结构正常 ×6 600
图13 A组PCAM，肌纤维结构已恢复正常 ×6 600
图14 B组PCAM，骨骼肌肌节结构清楚，肌纤维结构已恢复正常 ×20 000
图15 B组PCAM，可见神经纤维再生，雪旺细胞增生 ×20 000
Fig. 12 C group PCAM, the structure of muscle fiber is normal. ×6 600
Fig. 13 A group PCAM, The structure of muscle fiber restore to normal. ×6 600
, 百拇医药
Fig. 14 B group PCAM, The structure of sarcomere of skeletal muscle is clear, The structure of muscle fiber restore to normal.×20 000
Fig. 15 B group PCAM, hyperplasia of nerve fiber, hyperplasia of Schwann's cell. ×20 000
讨 论
1. AChE存在于大多数动物神经组织、肌肉组织中。在骨骼肌纤维中，AChE在MEP区含量远远高于其他部位。MEP是传导兴奋释放神经递质的通道。对肌肉的活动和代谢起支配和调节作用，MEP的功能状态能反映出肌肉的功能状态[6，7]。本实验通过对MEP部位AChE的定量分析，可了解肌纤维的恢复情况。因D组未见MEP故未测D组。B组恢复接近正常，但A组还未恢复到正常(因为是术后4个月取材)。文献报道中也说到在各型肌纤维MEP中，术后4个月终板AChE含量偏低，差异显著[8]。6个月后，才完全恢复到正常。
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Kand等[9]报道人的PCAM只有5%的多MEP。猫的PCAM多为单MEP。光镜、电镜均显示MEP为斑块状，且位于肌纤维中段。本实验结果与文献报道一致。因而在PCAM再神经支配时，神经及NMP应植入PCAM中段，尽可能接近原终板区。
2. SDH是肌纤维线粒体标志酶，在三羧酸循环中催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。通过对SDH的定量，可反映出线粒体的供能水平和肌纤维的功能状态。当神经损伤后，导致肌萎缩。故切断神经的D组，SDH明显下降。A组、B组由于移植了NMP，术后4个月SDH已经回升，与D组相比已有了显著恢复，但与C组相比，SDH含量仍偏低，差别有统计学意义。这与文献报道一致[8]。
3. D组当PCAM切断神经后，肌纤维明显萎缩，部分肌纤维变性、坏死、消失。MEP减少、消失。肌纤维直径以及AChE、SDH、ATPase、糖原含量都明显下降，与正常组及手术组相比均有显著性差异(P<0.01)。手术Ⅰ组、Ⅱ组由于植入了NMP，新的MEP建立，促进了肌肉酶代谢的恢复，加速了肌纤维的完全再生及肌肉功能的重建。术后4个月，ATPase、糖原含量、肌纤维直径已恢复接近正常，与C组相比(P>0.05)无显著性差异。由于术后仅4个月，故AChE在手术Ⅰ组、SDH在手术Ⅰ组、Ⅱ组都未恢复到正常；与C组相比仍有显著性差异(P<0.01)。从各项组织化学指标来看，手术Ⅱ组优于手术Ⅰ组。可能是因为副神经胸锁乳突肌支比颈袢胸骨舌骨肌支粗，故易恢复失神经支配PCAM的功能。但手术Ⅰ组与手术Ⅱ组相比无显著性差异(P>0.05)。肌电图检查显示左PCAM有肌电活动，其信号量、潜伏期、波幅与术前无明显差异(P>0.05)。直接喉镜及声带录像检查见左侧声带恢复了外展功能，手术Ⅰ组、Ⅱ组所有动物发音基本恢复正常。电镜检查神经肌肉的基本形态大致恢复正常。以上结果均证实两种术式都可以使PCAM获得有效的再神经支配，为临床治疗声带麻痹提供了重要的实验基础。
, 百拇医药
参考文献
[1]Tucker H M. Long-term results of nerve muscle pedicle reinnervation for laryngeal paralysis. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1989, 98(9):674
[2]吴 平，王正强，张德芳等.实验犬两种神经肌蒂环杓后肌移植术术式探讨.昆明医学院学报，1997，18(1)：5
[3]徐根兴.定量细胞学和细胞化学技术.长春：吉林科学技术出版社，1993
[4]孔志中.胆碱酯酶和肌内神经纤维合并染色方法.中华病理学杂志，1985，14(1)：73
[5]李肇特.组织化学.北京：北京医科大学出版社，1993：11
, 百拇医药
[6]Appell H J. Proliferation of motor end plates induced by increase muscular activity. Int J Sports Med, 1984, 5(3):125
[7]Booth FW, Gollnick PD. Effects of disuse on the structure and function of skeletal muscle. Med Sci Sport Wxerc (MG8), 1983 15(5):415
[8]董建明，李 吉，王 顺.周围神经再生过程中骨骼肌纤维及运动终板变化的组化研究.中国医科大学学报，1992，21(5)：334
[9]Kanda T, Yoshihara T, Miyazaki M, et al. Neuromuscular junctions of the posterior cricoarytenoid muscle in the cat. Acta Otolaryngol 1983,393(suppl):25
, 百拇医药
HISTOCHEMISTRY STUDY AND IMAGE ANALYSIS ON RECOVERY
OF POSTERIOR CRICOARYTENOID MUSCLE'S
FUNCTION IN THE EXPERIMENTAL DOG
Huang Xiuqing△, Jiang Shuxuan**， Wu Ping*， Zhang Defang*，Wang Zhengqiang*，Liang Weiping*, Chen Xianming*， Ma Limei, Li Ping
(Department of Histology and Embryology; **Department of Parasitology Kunming
, http://www.100md.com
Medical College; Department of Othorhinolaryngology, The Second
Affiliated Hospital of Kunming Medical College)
Comparing curative effects of two surgical procedures of transplanting neuromuscular pedicles (NMP) into posterior cricoarytenoid muscles (PCAM) in the experimental dog. An animal model of unilateral combined vocal cord paralysis (VCP) was established, the ansa cervicalis-sternastoideus and the accessory nerve-sternocleidonastoideus were separately transplanted into uninnervated PCAM. Fourth month after operation, PCAM form all the groups were detected with AChE、SDH、ATPase and PAS histochemistry methods and the results were quantitated by image analysis. The fiber diameter was measured and ultramicroscopic structure was observed. Result: Above two surgical procedures of NMP transplantation are effective and available on curing VCP. Both can restore the function of PCAM, and the second procedure is better than the first.
KEY WORDS Vocal cord paralysis; Posterior cricoarytenoid muscle; Neuromuscular pedicle; Histochemistry; Image analysis
△Department of Histology and Embryology of Kunming Medical College, Kunming 650031, China
* 云南省自然科学基金资助课题(No:95C138M), 百拇医药(黄秀琴 蒋淑萱** 吴 平* 张德芳* 王正强*梁伟平* 陈贤明* 马丽梅 李 坪)
单位：昆明医学院组织学胚胎学教研室，**寄生虫学教研室，昆明 650031 *昆明医学院附属二院耳鼻咽喉科
关键词：声带麻痹；环杓后肌；神经肌蒂；组织化学；图像分析
解剖学报/980422 摘 要 为了确定并比较实验犬两种不同术式：Ⅰ.颈袢胸骨舌骨肌支肌蒂移植术；Ⅱ.副神经胸锁乳突肌支肌蒂移植术，治疗声带麻痹的效果。建立单侧联合性声带麻痹动物模型，分别用Ⅰ、Ⅱ两种术式移植神经肌蒂于失神经的环杓后肌(PCAM)。术后4个月取各组PCAM做超微结构检查，并做光镜组织化学：乙酰胆碱酯酶(AChE)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、糖原(PAS)反应。用图像分析定量并测示肌纤维直径。结果发现两种术式都能使PCAM恢复功能，第Ⅱ种术式组织化学结果优于第Ⅰ种术式。为治疗声带麻痹提供了重要的理论根据。
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喉部肿瘤、创伤、手术等可引起喉麻痹。当双侧损伤时声带固定于旁中位，常引起严重的呼吸困难。永久性气管造瘘、杓状软骨切除或声带外移等治疗方法，均累及发音功能，并易发生各种并发症。因此实现环杓后肌(posterior cricoarytenoid muscle,PCAM)神经再支配来恢复声带外展功能是更为合理的治疗方法。神经肌蒂(neuromuscular pedicle,NMP)移植术被认为是实现喉内肌神经再支配的有效方法[1]。本研究通过对实验犬进行两种不同术式NMP移植于失神经的PCAM后，进行电镜、光镜的形态结构观察，并做组织化学图像定量分析，比较两种术式治疗声带麻痹的效果，现报道如下：
材料和方法
1. 建立单侧联合性声带麻痹动物模型[2]
健康成年犬20只，体重8～12kg,雌雄兼用，全麻下先后切断左喉上神经外侧支和左喉返神经，并剪掉2cm，造成左侧联合性声带麻痹。切断神经后，再行肌电图检查，证实已切断的神经与相应肌肉间的连接已不存在，单侧联合性声带麻痹模型建立。
, 百拇医药
2. 神经肌蒂移植术
将上述实验犬随机分为A、B、D 3组。A组为手术Ⅰ组，在左PCAM中部移植左颈袢胸骨舌骨肌支NMP。 B组为手术Ⅱ组，在左PCAM中部移植左副神经胸锁乳突肌NMP。 D组不作NMP移植。术后注射青霉素2d。A、B、D 3组在同等条件下饲养4个月。
3. 取材
术后4个月各组犬完成发音及肌电图检查后，完整取下PCAM及部分环杓侧肌及环甲肌。观察各肌肉一般形态、大小、体积并行两侧比较。A组共取术侧PCAM 8个样本(因有1只犬病死)。B组共取术侧PCAM8个样本(因有1只犬中途死亡)。D组取术侧PCAM、环杓侧肌各2个样本，另取B组术侧环甲肌2个样本，共计6个样本，作为去神经后，非移植组对照。取A、B、D各组健侧PCAM共18个样本以及D组健侧环杓侧肌2个样本，合计20个样本作为正常对照，并设为C组。
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4. 形态结构观察
(1) 石蜡包埋切片，做HE染色及AgNO3染色。(2)磷钨酸苏木精(PTAH)染色。(3) Carnoy加1%高碘酸混合固定液固定氧化24h做PAS整块染色。(4)氯化金染色铺片显示运动终板(motor end-plate,MEP)。(5)做超薄切片，在JEM-100CX型电子显微镜下观察肌纤维及神经形态结构并摄片。
附表 实验犬环杓后肌功能重建的组织化学、肌纤维直径
图像分析结果及显著性检验
Table Histochemistry and image analysis
of muscle fiber's diameters on recovery of
, 百拇医药
posterior cricoarytenoid muscle's
function in Dog and its significance test 名 称
name
组别
group
样本数
number of
sample
细胞数
number
of cell
±s, http://www.100md.com
乙酰胆碱酯酶
A
8
400
6.6116±
1.1943▲
AChE
B
8
400
7.7309±
0.9594△
, http://www.100md.com C
20
1 000
8.4484±
0.5188
琥珀酸脱氢酶
A
8
400
5.3705±
0.8697*
SDH
B
, 百拇医药
8
400
5.8253±
1.1543*
C
20
1 000
7.1233±
0.8262
D
6
300
2.7049±
, 百拇医药
0.4865*
三磷酸腺苷酶
A
8
400
4.5080±
0.8094△
ATPase
B
8
400
4.8641±
, 百拇医药 1.3056△
C
20
1 000
5.1666±
0.9545
D
6
300
2.0951±
0.5224*
糖 原
A
, 百拇医药
8
400
4.0163±
1.0092△
glycogen
B
8
400
4.2812±
1.1722△
C
20
, 百拇医药 1 000
4.7574±
1.1136
D
6
300
1.6509±
0.5460*
肌纤维直径(μm)
A
8
400
53.2424±
, 百拇医药
14.2672△
muscle fiber
B
8
400
53.6242±
13.0088△
diameter
C
20
1 000
57.4321±
, http://www.100md.com
13.9433
D
6
300
10.7975±
4.7848*
D组未见MEP，故未测AChE No MEP in D group and AChE isn't tested
组间相比：*P<0.01 Comparison between groups: *P<0.01
与对照组比：△P>0.05 Comparison with control group:△P>0.05
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A组与B组比：▲P<0.05 Comparison between A group and B group:▲P<0.05
5. 酶组织化学染色
在-13℃恒冷箱下连续切片(厚6μm)，分别做如下几种染色：(1)HE染色；(2) 铜-铅-硫胆碱法[3]显示AChE。(3)胆碱酯酶和肌内神经纤维合并染色法[4]，显示神经纤维及MEP。(4)四唑盐法[5]显示SDH。(5)钙钴法[5]显示ATPase。去底物孵育作为阴性对照。
6. 定量分析
各酶组织化学显示的阳性部位用英国剑桥公司的Quantiment-900图像分析仪分别测示其光密度值，作定量分析。并测肌纤维直径。
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7. 统计方法
所得数据输入IBM586计算机，采用《医百*医统》软件包进行方差分析，q检验或秩和检验。
结 果
1. 各组样本组织化学及肌纤维直径图像分析结果及显著性检验(附表)
2. HE染色及PTAH染色
可见C组PCAM肌纤维排列整齐，横纹结构清晰可见，可分辨红白肌。A组、B组PCAM形态、大小基本接近正常，横纹清晰可见(图1)。D组肌纤维细，明显萎缩，肌纤维排列松散，横纹不清晰。部分肌纤维变性、坏死、消失，肌间结缔组织明显增生，炎性细胞、吞噬细胞大量出现，局部有出血(图2)。
3.HE染色、PTAH染色、AgNO3染色
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在A、B、C组都可以看到神经(图3)。D组未看到神经。
图1 A组PCAM。↑.红肌 ▲.白肌 PTAH染色，石蜡切片 ×400
图2 D组PCAM。★.萎缩的肌纤维 ▲.结缔组织 ↑.炎性细胞 HE染色，石蜡切片 ×400
图3 B组PCAM。▲.神经 ↑.肌纤维 PTAH染色 ×40
Fig.1 PTAH staining, paraffin section, A group PCAM. red muscle(↑) white muscle(▲) ×400
Fig.2 HE staining, paraffin section, D group PCAM. atrophic muscle fiber (★) connective tissue(▲) phlogolic cells(↑) ×400
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Fig.3 PTAH staining, B group PCAM.nerve(▲) muscle fiber(↑) ×40
4. AChE与AgNO3联合染色
冰冻切片，A、B组均可见到许多粗大的神经纤维及MEP(图4)。D组失神经支配的肌纤维中几乎无MEP， 肌纤维明显萎缩。氯化金染色铺片可见A组、B组PCAM植入NMP后，通过肌蒂中切断的神经支和神经纤维再生形成新的MEP(图5)。可以看到PCAM中以肌蒂为中心，神经末梢芽生长入MEP内并向周围扩张，其范围大大超过了肌蒂范围。冰冻切片，C组在纵切肌纤维中段，可见较清楚的单MEP， 排列整齐，MEP呈椭圆形斑块状(图6)。A组、B组分布同C组，形态基本规则，但偶见形态较小的MEP，染色稍淡，为尚未成熟的MEP。
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图4 B组PCAM。▲.有髓神经纤维 ↑.运动终板 AChE+AgNo3染色，冰冻切片 ×400
图5 A组运动终板。★.神经 ▲.肌纤维 ↑.运动终板 氯化金染色，铺片 ×200
图6 C组PCAM纵切面。↑.单运动终板 ▲.肌纤维 AChE+AgNo3染色，冰冻切片 ×200
Fig.4 AChE+AgNO3 staining, frozen section, B group PCAM. medullary nerve fiber(▲) motor end-plate(↑) ×400
Fig.5 Auric chloride staining, bed-section, A group motor end-plate. nerve(★) muscle fiber(▲) motor end-plate(↑) ×200
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Fig.6 AChE+AgNO3 staining, frozen section, C group PCAM longitudinal setion. single motor end-plate(↑) muscle fiber(▲)×200
5. SDH
C组光镜下可见SDH阳性产物为蓝色甲
颗粒。红肌纤维颗粒多，呈深蓝色。白肌纤维颗粒少呈浅蓝色。中间肌居于两者之间。A组、B组与D组相比，已有了显著恢复，肌纤维形态接近于C组，但SDH阳性反应仍较C组差(图7)。D组肌纤维明显萎缩变细，SDH反应颗粒明显减少，颜色变浅(图8)。图7 B组PCAM。▲.白肌纤维 ↑.红肌纤维 SDH冰冻切片 ×400
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图8 D组PCAM。↑.萎缩的肌纤维 SDH冰冻切片 ×200
Fig.7 SDH frozen section, B group PCAM. white muscle fiber(▲) red muscle fiber(↑) ×400
Fig.8 SDH frozen section, D group PCAM. atrophic muscle fiber(↑) ×200
6. ATPase
光镜下可见C组PCAM白肌纤维色深呈棕黑色，红肌纤维呈浅黑色。白肌纤维以无氧酵解为主，故ATPase活性高。D组肌纤维细ATPase色浅。A组、B组已明显恢复，接近于C组(图9)。
7. 阴性对照
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去底物对照标本均呈阴性反应。
8. PAS整块染色
C组光镜下可见PAS阳性反应为红色颗粒，色深、颗粒多粗大，A组、B组基本恢复正常(图10)。D组萎缩的细肌纤维糖原颗粒少，色浅(图11)。
图9 B组PCAM。↑.白肌 ▲.红肌 ATPase冰冻切片 ×400
图10 A组PCAM。PAS糖原颗粒较多 PAS整块染色，石蜡切片 ×200
图11 D组PCAM。PAS糖原颗粒较少 PAS整块染色，石蜡切片 ×200
Fig.9 ATPase frozen section, B group PCAM. white muscle fiber(▲) red muscle fiber(↑) ×400
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Fig.10 PAS massive staining, paraffin section, A group PCAM. PAS glycogen granule increase greatly(↑) ×200
Fig.11 PAS massive staining, paraffin section, D group PCAM. PAS glycogen granule decrease greatly(↑) ×200
9. 电镜
透射电镜检查结果：A组、B组PCAM形态结构恢复正常(图13，14)。少数可见肌收缩带。远侧端确具神经纤维Waller变性及相应的雪旺细胞增生，神经纤维再生，部分纤维胞质内已可见小的轴突(图15)。并可见Büngner带。
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图12～15 为术后4个月PCAM电镜照片
图12 C组PCAM， 肌纤维结构正常 ×6 600
图13 A组PCAM，肌纤维结构已恢复正常 ×6 600
图14 B组PCAM，骨骼肌肌节结构清楚，肌纤维结构已恢复正常 ×20 000
图15 B组PCAM，可见神经纤维再生，雪旺细胞增生 ×20 000
Fig. 12 C group PCAM, the structure of muscle fiber is normal. ×6 600
Fig. 13 A group PCAM, The structure of muscle fiber restore to normal. ×6 600
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Fig. 14 B group PCAM, The structure of sarcomere of skeletal muscle is clear, The structure of muscle fiber restore to normal.×20 000
Fig. 15 B group PCAM, hyperplasia of nerve fiber, hyperplasia of Schwann's cell. ×20 000
讨 论
1. AChE存在于大多数动物神经组织、肌肉组织中。在骨骼肌纤维中，AChE在MEP区含量远远高于其他部位。MEP是传导兴奋释放神经递质的通道。对肌肉的活动和代谢起支配和调节作用，MEP的功能状态能反映出肌肉的功能状态[6，7]。本实验通过对MEP部位AChE的定量分析，可了解肌纤维的恢复情况。因D组未见MEP故未测D组。B组恢复接近正常，但A组还未恢复到正常(因为是术后4个月取材)。文献报道中也说到在各型肌纤维MEP中，术后4个月终板AChE含量偏低，差异显著[8]。6个月后，才完全恢复到正常。
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Kand等[9]报道人的PCAM只有5%的多MEP。猫的PCAM多为单MEP。光镜、电镜均显示MEP为斑块状，且位于肌纤维中段。本实验结果与文献报道一致。因而在PCAM再神经支配时，神经及NMP应植入PCAM中段，尽可能接近原终板区。
2. SDH是肌纤维线粒体标志酶，在三羧酸循环中催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。通过对SDH的定量，可反映出线粒体的供能水平和肌纤维的功能状态。当神经损伤后，导致肌萎缩。故切断神经的D组，SDH明显下降。A组、B组由于移植了NMP，术后4个月SDH已经回升，与D组相比已有了显著恢复，但与C组相比，SDH含量仍偏低，差别有统计学意义。这与文献报道一致[8]。
3. D组当PCAM切断神经后，肌纤维明显萎缩，部分肌纤维变性、坏死、消失。MEP减少、消失。肌纤维直径以及AChE、SDH、ATPase、糖原含量都明显下降，与正常组及手术组相比均有显著性差异(P<0.01)。手术Ⅰ组、Ⅱ组由于植入了NMP，新的MEP建立，促进了肌肉酶代谢的恢复，加速了肌纤维的完全再生及肌肉功能的重建。术后4个月，ATPase、糖原含量、肌纤维直径已恢复接近正常，与C组相比(P>0.05)无显著性差异。由于术后仅4个月，故AChE在手术Ⅰ组、SDH在手术Ⅰ组、Ⅱ组都未恢复到正常；与C组相比仍有显著性差异(P<0.01)。从各项组织化学指标来看，手术Ⅱ组优于手术Ⅰ组。可能是因为副神经胸锁乳突肌支比颈袢胸骨舌骨肌支粗，故易恢复失神经支配PCAM的功能。但手术Ⅰ组与手术Ⅱ组相比无显著性差异(P>0.05)。肌电图检查显示左PCAM有肌电活动，其信号量、潜伏期、波幅与术前无明显差异(P>0.05)。直接喉镜及声带录像检查见左侧声带恢复了外展功能，手术Ⅰ组、Ⅱ组所有动物发音基本恢复正常。电镜检查神经肌肉的基本形态大致恢复正常。以上结果均证实两种术式都可以使PCAM获得有效的再神经支配，为临床治疗声带麻痹提供了重要的实验基础。
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参考文献
[1]Tucker H M. Long-term results of nerve muscle pedicle reinnervation for laryngeal paralysis. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1989, 98(9):674
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[3]徐根兴.定量细胞学和细胞化学技术.长春：吉林科学技术出版社，1993
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[7]Booth FW, Gollnick PD. Effects of disuse on the structure and function of skeletal muscle. Med Sci Sport Wxerc (MG8), 1983 15(5):415
[8]董建明，李 吉，王 顺.周围神经再生过程中骨骼肌纤维及运动终板变化的组化研究.中国医科大学学报，1992，21(5)：334
[9]Kanda T, Yoshihara T, Miyazaki M, et al. Neuromuscular junctions of the posterior cricoarytenoid muscle in the cat. Acta Otolaryngol 1983,393(suppl):25
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HISTOCHEMISTRY STUDY AND IMAGE ANALYSIS ON RECOVERY
OF POSTERIOR CRICOARYTENOID MUSCLE'S
FUNCTION IN THE EXPERIMENTAL DOG
Huang Xiuqing△, Jiang Shuxuan**， Wu Ping*， Zhang Defang*，Wang Zhengqiang*，Liang Weiping*, Chen Xianming*， Ma Limei, Li Ping
(Department of Histology and Embryology; **Department of Parasitology Kunming
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Medical College; Department of Othorhinolaryngology, The Second
Affiliated Hospital of Kunming Medical College)
Comparing curative effects of two surgical procedures of transplanting neuromuscular pedicles (NMP) into posterior cricoarytenoid muscles (PCAM) in the experimental dog. An animal model of unilateral combined vocal cord paralysis (VCP) was established, the ansa cervicalis-sternastoideus and the accessory nerve-sternocleidonastoideus were separately transplanted into uninnervated PCAM. Fourth month after operation, PCAM form all the groups were detected with AChE、SDH、ATPase and PAS histochemistry methods and the results were quantitated by image analysis. The fiber diameter was measured and ultramicroscopic structure was observed. Result: Above two surgical procedures of NMP transplantation are effective and available on curing VCP. Both can restore the function of PCAM, and the second procedure is better than the first.
KEY WORDS Vocal cord paralysis; Posterior cricoarytenoid muscle; Neuromuscular pedicle; Histochemistry; Image analysis
△Department of Histology and Embryology of Kunming Medical College, Kunming 650031, China
* 云南省自然科学基金资助课题(No:95C138M), 百拇医药(黄秀琴 蒋淑萱** 吴 平* 张德芳* 王正强*梁伟平* 陈贤明* 马丽梅 李 坪)