大鼠双后肢高能爆炸伤后远位器官的研究*
作者：李 巍 蔡文琴
单位：第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400038
关键词：高能爆炸伤；远位器官；生长抑素；促肾上腺皮质激素释放因子；原位杂交；免疫组织化学
解剖学报/980420 摘 要 为了探讨大鼠双后肢高能爆炸伤后，远位器官(脑、小肠、膀胱)的形态学改变和这些器官中的生长抑素(SOM)和促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的变化，用原位杂交组织化学、免疫组织化学、常规光、电镜技术和图像分析等方法作为研究手段，结果显示：1. 大鼠双后肢炸伤后，超微结构有明显变化，主要表现为小肠、膀胱中的血管内皮皱缩、胞质内吞饮小泡增多及脑内神经毡水肿和轴突退行性变。2. 炸伤后，远位器官中SOM及SOMmRNA和CRFmRNA均有一过性的、应激性的变化。3.炸伤后，远位器官中不仅神经内分泌细胞SOM和CRF表达增强，而且在小肠和膀胱结缔组织中，也出现了高表达的SOMmRNA和CRFmRNA信号细胞，性质待定。本研究提示：高能爆炸伤可致远位器官损伤，SOM和CRF参与了大鼠炸伤后的创伤应激反应和远达效应的发生，为高能爆炸伤的发生机制和战伤研究提供了基础资料。
, 百拇医药
随着现代轻武器的发展，出现了许多杀伤力强、速度快、能量传递率高的高速(900m/s以上)破片武器、小型武器等称为高速投射物[1]。这些高速投射物除造成严重的局部损伤外，还会引起远位器官损伤，严重影响伤情转归[2]。因而，高速投射物远达效应，已成为当前火器伤研究的前沿课题。神经内分泌因子在远达效应中的作用，也越来越受到人们的关注，损伤后这些因子的变化，国内外已有少数文献报道[3，4]。但是否会引起神经内分泌因子的前体mRNA的变化，尚未见文献报道。因此，本研究采用免疫组织化学、原位杂交组织化学、常规光、电镜观察和图像分析等技术，研究了大鼠双后肢高能爆炸伤后，远位器官(脑、小肠、膀胱)在常规光、电镜下的形态学变化及其中的生长抑素(SOM)及其mRNA和促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin releasing factor CRF) mRNA的变化，以期为远达效应的发生机制提供基础资料。
材料和方法
, http://www.100md.com
健康成年雄性Wistar大鼠100只，随机分成5组，即对照组(16只)、伤后30min、1h、6h、及12h组(致伤组，21只/组)。动物麻醉后，将小型爆炸器(含300mgTNT)捆在大鼠双后肢之间，引爆后，选择双后肢粉碎性断离而腹壁未破者为研究对象(成功率为90%左右)。根据实验方法的不同，以两种方式取材：
1. 光镜、电镜部分
动物麻醉后，直接取膀胱、小肠、脑(以视交叉冠状平面为界向后保留0.5cm)，光镜组组织放入Bouin液中固定24h左右。石蜡切片(厚5μm)，HE染色，光镜观察。电镜组则将组织修成1mm左右的方块(脑组织取大脑皮层和下丘脑)，放入3%戊二醛溶液中4℃固定24h左右。超薄切片(厚50～70nm)，铀、铅染色，透射电镜观察。
2. 免疫组织化学和原位杂交组织化学部分
动物麻醉后，用4%多聚甲醛加0.3%饱和苦味酸混合液(pH7.2～7.4)行主动脉灌注，取脑、小肠和膀胱置于相同固定液中8～12h(4℃)，再用含20%蔗糖上述固定液浸泡至组织块下沉后冰冻切片(厚30μm)。(1) 免疫组织化学染色：用Sternberger PAP法，显示SOM-imminoreactive(SOM-IR)细胞和纤维。主要染色程序为：冰冻切片经兔SOM抗血清(1∶4 000，Peninsula Lab. USA),4℃过夜；羊抗兔IgG(1∶50，第二军医大学产品)，37℃，45min；兔PAP复合物(1∶200，上海第二医科大学产品)37℃，1h；DAB-H2O2液显色。对照实验用0.01 mol/L PBS加1%牛血清白蛋白代替一抗，其余步骤同上。(2) 原位杂交组织化学：用Behringer Mannheim公司的Dig-RNA标记盒，合成反义SOMcRNA探针和CRFcRNA探针。主要程序：冰冻切片经蛋白酶K(2mg/L)37℃孵育20min；分别入含地高辛标记的SOM-cRNA探针和CRF-cRNA探针(0.5 mg/L)的杂交液中杂交，43℃，12～16h；碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体Fab段(1∶1 000 Boehringer Mannheim公司)，37℃，2h；硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)混合液在室温下显色3～5h；光镜观察。对照实验用未加探针的杂交液杂交，其余步骤相同。分别将各组、各组织的原位杂交切片和免疫组织化学切片各10张，每张随机采集3～5个视野(物镜40倍)，将阳性细胞摄入图像分析系统，用德国LEICA公司的“MDIO型彩色图像分析系统”，检测阳性细胞的平均光密度，所得结果用医用数理统计程序处理，并用Harvard graphics软件制图。
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图13 大鼠伤后SOM-IR细胞的光密度值变化，与对照组相比P<0.01
图14 大鼠伤后SOMmRNA阳性细胞光密度值的变化，与对照组相比P<0.01
Fig. 14 The changes of optical density in SOMmRNA positive cells after wound.
comparied with control group, P<0.01
图15 大鼠伤后CRFmRNA阳性细胞光密度值的变化，与对照组相比P<0.01
, 百拇医药
Fig. 15 The changes of optical density in CRFmRNA positive cells after wound.
compared with control group, P<0.01
结 果
1. 脑、小肠和膀胱的光镜、电镜观察
光镜下，大鼠大脑皮层、下丘脑、小肠和膀胱的上皮和血管等部位，各时相均未见明显的病理学改变，只是小肠和膀胱静脉似有轻度淤血。电镜下，在伤后6h组，却有明显的病理学变化，主要表现为：(1) 下丘脑内神经毡水肿，神经纤维间隙增宽，轴突退行性变(图1，2)。(2) 在膀胱，小血管和毛细血管内皮细胞皱缩，内皮表面不规则指状突起明显增多，内皮胞质内吞饮小泡增多并呈较大空泡(图3)。膀胱上皮细胞间隙增宽，胞质内出现少量空泡。(3) 在小肠粘膜下层和固有层内，小血管和毛细血管内皮细胞呈现类似膀胱血管的病理变化，但程度略轻。
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图1 伤后6h，大鼠下丘脑神经毡水肿(
) ×9 800
图2 伤后6h，大鼠下丘脑神经纤维退行性变() ×9 800
图3 伤后6h，大鼠膀胱血管内皮皱缩，突起增多(〕，胞质内吞饮小泡增多(↑) ×4 900
Fig.1 The neuropil edema()in hypothalamus at 6h after wound. ×9 800
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Fig.2 The axon degeneration ()in hypothalamus at 6h after wound. ×9 800
Fig.3 The shrinkage of the endothelial cell of the blood vessle in urinary bladder, the projections() and pinocytotic vacuoles (↑) were increased in endothelial cell at 6h after wound. ×4 900
2.伤后生长抑素及其mRNA和促肾上腺皮质激素释放因子mRNA的变化
, 百拇医药 免疫组织化学显示：大鼠炸伤后，下丘脑室周核、小肠粘膜和粘膜下层中的SOM免疫反应性细胞数量和着色程度均增加，以伤后6h变化最明显，伤后12h基本恢复正常。另外，在伤后6h组，在膀胱和小肠粘膜固有层和粘膜下层中还有正常或其他时相未能见到的少量的SOM免疫反应性细胞，细胞呈椭圆形或圆形，大小不一。图像分析结果见(图13)。
原位杂交组织化学显示：大鼠炸伤后，远位器官中的SOMmRNA和CRFmRNA表达增高，以伤后1h组变化最明显，12h基本恢复正常。在伤后1h组，在下丘脑室周核，细胞突起减少、细胞变圆、SOMmRNA信号细胞明显增多、染色强度增强(图4，5)；在大脑皮层、下丘脑室旁核中的CRFmRNA信号细胞也明显增多(图6，7)；在膀胱和小肠粘膜固有层和粘膜下层中有表达较高的SOMmRNA信号细胞和CRFmRNA信号细胞，细胞呈椭圆形或圆形，大小不一(图8，9)，还可见膀胱上皮内有CRFmRNA信号细胞(图10)(对照组或其他时相组未见)。伤后30min、6h和12h组的SOMmRNA和CRFmRNA表达与对照组相比无显著差异(图11，12)。图像分析结果见(图14，15)。
, 百拇医药
图4 正常大鼠下丘脑室周核SOMmRNA阳性神经细胞() ×400
图5 伤后1h，大鼠下丘脑室周核SOMmRNA阳性神经细胞() ×400
图6 伤后1h，大鼠大脑皮层CRFmRNA阳性神经细胞 ×400
图7 伤后1h，大鼠下丘脑室旁核CRFmRNA阳性神经细胞 ×400
图8 伤后1h，大鼠小肠腺中SOMmRNA阳性细胞，固有层中的SOMmRNA阳性细胞(↑) ×400
图9 伤后1h，大鼠小肠粘膜下神经丛中CRFmRNA阳性细胞()，粘膜下层中CRFmRNA阳性细胞(↑) ×400
, 百拇医药
图10 伤后1h，大鼠膀胱上皮中CRFmRNA阳性细胞() ×400
图11 伤后30min，大鼠大脑皮层中CRFmRNA阳性神经细胞() ×400
图12 伤后12h，大鼠下丘脑室旁核中CRFmRNA阳性神经细胞() ×400
Fig.4 The control group, the SOMmRNA positive neurons () in periventricular zone. ×400
, 百拇医药
Fig.5 The SOMmRNA positive neurons () in periventricular zone at 1h after wound. ×400
Fig.6 The CRFmRNA positive neurons() in cerebral cortex at 1h after wound. ×400
Fig.7 The CRFmRNA positive neurons()in paraventricular nucleus at 1h after wound. ×400
, 百拇医药 Fig.8 The SOMmRNA positive cells in intestinal gland() and in lamina propria (↑) of the small intestine at 1h after wound. ×400
Fig.9 The CRFmRNA positive cells in the Meissner plexus() and in the submucosa (↑) of the small in intestine at 1h after wound. ×400
Fig.10 The CRFmRNA positive cells in epithelium of the urinary bladder at 1h after wound. ×400
, 百拇医药
Fig.11 The CRFmRNA positive neurons () in cerebral cortex at 30 min after wound. ×400
Fig.12 The CRFmRNA positive neurons () in paraventricular nucleus at 12 h after wound. ×400
讨 论
1. 高能爆炸伤后，脑、小肠、膀胱的形态学变化及意义
本实验结果表明，大鼠双后肢高能爆炸伤后，在光镜下，远位器官(脑、小肠、膀胱)未见明显的病理学改变，但超微结构病理变化明显，主要集中在血管内皮细胞和脑组织，说明高能爆炸伤时，压力波、冲击波沿血流传导而致血管内皮直接受损，造成远位器官损伤，支持刘荫秋等[5，6]的血流扰动学说。而脑离后肢最远，也出现了神经纤维退行性变、神经纤维间隙增宽等，提示压力波、冲击波可致远位器官的损伤，其作用机制还有待研究。
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2. SOM及其mRNA和CRFmRNA的变化规律及意义
图像分析结果提示，大鼠双后肢高能爆炸伤后，SOM及其mRNA和CRFmRNA均有一过性的、应激性的变化，且转录水平(mRNA水平)的峰值为伤后1h，翻译水平(蛋白水平以SOM为代表)的峰值为伤后6h，伤后12h两者均基本恢复正常。这一变化规律提示：当机体受到严重创伤后，首先激活基因，即SOMmRNA和CRFmRNA即刻增高，伤后1h达峰值。而这些被大量转录的mRNA则可翻译成蛋白多肽，使血和组织中的蛋白水平升高，至伤后6h达峰值。本研究结果与以往所报道资料基本一致，如蔡文琴等[7]的研究表明，犬高速投射物伤后，血和胃肠道、心、肺中血管活性肠肽(VIP)、神经紧张素(neroutensin)、强啡肽(dynorphin)、β-内啡肽(β-endorphin)和SOM的变化峰值，均在伤后6h。血浆儿茶酚胺浓度也增加，其中肾上腺素更明显，且主要集中在伤后6h左右[8]。但未见高速投射物伤后，神经内分泌因子转录水平的报道。
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3. 高能爆炸伤后，在小肠、膀胱出现SOMmRNA信号细胞及SOM免疫反应性细胞和CRFmRNA信号细胞的可能意义
原位杂交结果显示，伤后1h，在小肠粘膜下层和粘膜固有层以及膀胱上皮和膀胱结缔组织中，均出现有CRFmRNA信号和SOMmRNA信号细胞，其形态、大小各异，除膀胱上皮的阳性细胞可确认为上皮性质外，结缔组织中阳性细胞的确切性质和病理生理学意义还有待研究。这一结果，目前尚未见有同类文献报道。推测在严重创伤应激下，机体除调动中枢神经系统和外周神经系统的神经内分泌细胞合成和分泌神经内分泌因子外，还激活其他细胞，合成和分泌神经内分泌因子，参与或调节机体的应激过程及高能爆炸伤后远达效应的发生和发展。这些推测尚需进一步研究得以证实。
参考文献
[1]安 波，刘荫秋，何 平等.投射物伤远达效应发生条件的探讨.中华创伤杂志，1991，7(增刊)：15
, http://www.100md.com
[2]刘荫秋，周宝桐，赖西南等.高速投射物伤远达效应的机理及其对伤情转归的影响.中华创伤杂志，1991，7(增刊)：8
[3]Madsen M, Smeds S, Lennquist S. Relationships between thyroid hormone and catecholamines in experimental trauma. Acta Chir Scand, 1986, 152(6):413
[4]Li WP, Chen Maner, Liu YQ, et al. An experimental study of brain vasoactive peptides in early stages of high velocity missile wounds of legs. J Trauma, 1990,6(2):suppl 340
[5]Liu YQ, Chen L, Chen Y, et al. Mechanism and characteristics of the remote effects of projectiles. J Trauma, 1990,6(2):suppl 16
, 百拇医药
[6]王建民，刘荫秋，李曙光等.高速投射物所致循环管路内流体动力效应的实验研究.北京：第四届全国创伤弹道学会议论文汇编，1993.10
[7]蔡文琴，王正品，吴 康等.狗双后肢高速枪弹伤后外周血及组织中神经肽的变化.中华创伤杂志，1991，7(增刊)：21
[8]Huang MY, Wang DS, Liu YQ. Changes of plasma catecholamines in dogs injuried by fragments. J Trauma, 1990, 6(2):suppl 341
THE STUDY OF REMOTE ORGANS OF THE RAT AFTER HIGH
ENERGY EXPLOSIVE WOUND IN BOTH HIND LEGS
, 百拇医药
Li Wei, Cai WenqinΔ
(Department of Histology and Embryology, The Third Military Medical University, Chongqing)
By using in in situ hybridization, immunochemistry, HE staining, electron microscopy and image analysis, we studied the remote organs (the brain, the small intestine and the urinary bladder) of the rat with high energy explosive wound (HEEW) in both hind legs. The results showed: 1. Obvious pathological ultrastructure changes were observed after the HEEW. Especially, the shrinkage of endothelial cells of blood vessles in the small intestine and the urinary bladder; the neuropil edema and axon degeneration appeared in hypothalamus. 2. The expression of somatostatin (SOM) and its mRNA and corticotropin releasing factor (CRF) mRNA were transiently increased in the brain, the small intestine and the urinary bladder of the rat with HEEW. 3. The SOMmRNA and CRFmRNA were not only expressed in neuroendocrine cells but also in some other cells in small intestine and urinary bladder at 1h after the HEEW. The results suggested that:1.SOM and its mRNA as well as CRFmRNA are involved in the remote effects of HEEW. 2. There are some pathological ultrastructure changes in some remote organs of the rat after the HEEW in both hind legs.
KEY WORDS High energy explosive wound; Remote organs; Somatostatin; Corticotropin releasing factor, In situ hybridization; Immunohistochemistry
△Department of Histology and Embryology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038,China
* 中国人民解放军“九五”指令性基金课题(No.96L039), 百拇医药
单位：第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400038
关键词：高能爆炸伤；远位器官；生长抑素；促肾上腺皮质激素释放因子；原位杂交；免疫组织化学
解剖学报/980420 摘 要 为了探讨大鼠双后肢高能爆炸伤后，远位器官(脑、小肠、膀胱)的形态学改变和这些器官中的生长抑素(SOM)和促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的变化，用原位杂交组织化学、免疫组织化学、常规光、电镜技术和图像分析等方法作为研究手段，结果显示：1. 大鼠双后肢炸伤后，超微结构有明显变化，主要表现为小肠、膀胱中的血管内皮皱缩、胞质内吞饮小泡增多及脑内神经毡水肿和轴突退行性变。2. 炸伤后，远位器官中SOM及SOMmRNA和CRFmRNA均有一过性的、应激性的变化。3.炸伤后，远位器官中不仅神经内分泌细胞SOM和CRF表达增强，而且在小肠和膀胱结缔组织中，也出现了高表达的SOMmRNA和CRFmRNA信号细胞，性质待定。本研究提示：高能爆炸伤可致远位器官损伤，SOM和CRF参与了大鼠炸伤后的创伤应激反应和远达效应的发生，为高能爆炸伤的发生机制和战伤研究提供了基础资料。
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随着现代轻武器的发展，出现了许多杀伤力强、速度快、能量传递率高的高速(900m/s以上)破片武器、小型武器等称为高速投射物[1]。这些高速投射物除造成严重的局部损伤外，还会引起远位器官损伤，严重影响伤情转归[2]。因而，高速投射物远达效应，已成为当前火器伤研究的前沿课题。神经内分泌因子在远达效应中的作用，也越来越受到人们的关注，损伤后这些因子的变化，国内外已有少数文献报道[3，4]。但是否会引起神经内分泌因子的前体mRNA的变化，尚未见文献报道。因此，本研究采用免疫组织化学、原位杂交组织化学、常规光、电镜观察和图像分析等技术，研究了大鼠双后肢高能爆炸伤后，远位器官(脑、小肠、膀胱)在常规光、电镜下的形态学变化及其中的生长抑素(SOM)及其mRNA和促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin releasing factor CRF) mRNA的变化，以期为远达效应的发生机制提供基础资料。
材料和方法
, http://www.100md.com
健康成年雄性Wistar大鼠100只，随机分成5组，即对照组(16只)、伤后30min、1h、6h、及12h组(致伤组，21只/组)。动物麻醉后，将小型爆炸器(含300mgTNT)捆在大鼠双后肢之间，引爆后，选择双后肢粉碎性断离而腹壁未破者为研究对象(成功率为90%左右)。根据实验方法的不同，以两种方式取材：
1. 光镜、电镜部分
动物麻醉后，直接取膀胱、小肠、脑(以视交叉冠状平面为界向后保留0.5cm)，光镜组组织放入Bouin液中固定24h左右。石蜡切片(厚5μm)，HE染色，光镜观察。电镜组则将组织修成1mm左右的方块(脑组织取大脑皮层和下丘脑)，放入3%戊二醛溶液中4℃固定24h左右。超薄切片(厚50～70nm)，铀、铅染色，透射电镜观察。
2. 免疫组织化学和原位杂交组织化学部分
动物麻醉后，用4%多聚甲醛加0.3%饱和苦味酸混合液(pH7.2～7.4)行主动脉灌注，取脑、小肠和膀胱置于相同固定液中8～12h(4℃)，再用含20%蔗糖上述固定液浸泡至组织块下沉后冰冻切片(厚30μm)。(1) 免疫组织化学染色：用Sternberger PAP法，显示SOM-imminoreactive(SOM-IR)细胞和纤维。主要染色程序为：冰冻切片经兔SOM抗血清(1∶4 000，Peninsula Lab. USA),4℃过夜；羊抗兔IgG(1∶50，第二军医大学产品)，37℃，45min；兔PAP复合物(1∶200，上海第二医科大学产品)37℃，1h；DAB-H2O2液显色。对照实验用0.01 mol/L PBS加1%牛血清白蛋白代替一抗，其余步骤同上。(2) 原位杂交组织化学：用Behringer Mannheim公司的Dig-RNA标记盒，合成反义SOMcRNA探针和CRFcRNA探针。主要程序：冰冻切片经蛋白酶K(2mg/L)37℃孵育20min；分别入含地高辛标记的SOM-cRNA探针和CRF-cRNA探针(0.5 mg/L)的杂交液中杂交，43℃，12～16h；碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体Fab段(1∶1 000 Boehringer Mannheim公司)，37℃，2h；硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)混合液在室温下显色3～5h；光镜观察。对照实验用未加探针的杂交液杂交，其余步骤相同。分别将各组、各组织的原位杂交切片和免疫组织化学切片各10张，每张随机采集3～5个视野(物镜40倍)，将阳性细胞摄入图像分析系统，用德国LEICA公司的“MDIO型彩色图像分析系统”，检测阳性细胞的平均光密度，所得结果用医用数理统计程序处理，并用Harvard graphics软件制图。
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图13 大鼠伤后SOM-IR细胞的光密度值变化，与对照组相比P<0.01
图14 大鼠伤后SOMmRNA阳性细胞光密度值的变化，与对照组相比P<0.01
Fig. 14 The changes of optical density in SOMmRNA positive cells after wound.
comparied with control group, P<0.01
图15 大鼠伤后CRFmRNA阳性细胞光密度值的变化，与对照组相比P<0.01
, 百拇医药
Fig. 15 The changes of optical density in CRFmRNA positive cells after wound.
compared with control group, P<0.01
结 果
1. 脑、小肠和膀胱的光镜、电镜观察
光镜下，大鼠大脑皮层、下丘脑、小肠和膀胱的上皮和血管等部位，各时相均未见明显的病理学改变，只是小肠和膀胱静脉似有轻度淤血。电镜下，在伤后6h组，却有明显的病理学变化，主要表现为：(1) 下丘脑内神经毡水肿，神经纤维间隙增宽，轴突退行性变(图1，2)。(2) 在膀胱，小血管和毛细血管内皮细胞皱缩，内皮表面不规则指状突起明显增多，内皮胞质内吞饮小泡增多并呈较大空泡(图3)。膀胱上皮细胞间隙增宽，胞质内出现少量空泡。(3) 在小肠粘膜下层和固有层内，小血管和毛细血管内皮细胞呈现类似膀胱血管的病理变化，但程度略轻。
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图1 伤后6h，大鼠下丘脑神经毡水肿(
) ×9 800图2 伤后6h，大鼠下丘脑神经纤维退行性变(
) ×9 800图3 伤后6h，大鼠膀胱血管内皮皱缩，突起增多(
〕，胞质内吞饮小泡增多(↑) ×4 900Fig.1 The neuropil edema(
)in hypothalamus at 6h after wound. ×9 800, http://www.100md.com
Fig.2 The axon degeneration (
)in hypothalamus at 6h after wound. ×9 800Fig.3 The shrinkage of the endothelial cell of the blood vessle in urinary bladder, the projections(
) and pinocytotic vacuoles (↑) were increased in endothelial cell at 6h after wound. ×4 9002.伤后生长抑素及其mRNA和促肾上腺皮质激素释放因子mRNA的变化
, 百拇医药 免疫组织化学显示：大鼠炸伤后，下丘脑室周核、小肠粘膜和粘膜下层中的SOM免疫反应性细胞数量和着色程度均增加，以伤后6h变化最明显，伤后12h基本恢复正常。另外，在伤后6h组，在膀胱和小肠粘膜固有层和粘膜下层中还有正常或其他时相未能见到的少量的SOM免疫反应性细胞，细胞呈椭圆形或圆形，大小不一。图像分析结果见(图13)。
原位杂交组织化学显示：大鼠炸伤后，远位器官中的SOMmRNA和CRFmRNA表达增高，以伤后1h组变化最明显，12h基本恢复正常。在伤后1h组，在下丘脑室周核，细胞突起减少、细胞变圆、SOMmRNA信号细胞明显增多、染色强度增强(图4，5)；在大脑皮层、下丘脑室旁核中的CRFmRNA信号细胞也明显增多(图6，7)；在膀胱和小肠粘膜固有层和粘膜下层中有表达较高的SOMmRNA信号细胞和CRFmRNA信号细胞，细胞呈椭圆形或圆形，大小不一(图8，9)，还可见膀胱上皮内有CRFmRNA信号细胞(图10)(对照组或其他时相组未见)。伤后30min、6h和12h组的SOMmRNA和CRFmRNA表达与对照组相比无显著差异(图11，12)。图像分析结果见(图14，15)。
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图4 正常大鼠下丘脑室周核SOMmRNA阳性神经细胞(
) ×400图5 伤后1h，大鼠下丘脑室周核SOMmRNA阳性神经细胞(
) ×400图6 伤后1h，大鼠大脑皮层CRFmRNA阳性神经细胞 ×400
图7 伤后1h，大鼠下丘脑室旁核CRFmRNA阳性神经细胞 ×400
图8 伤后1h，大鼠小肠腺中SOMmRNA阳性细胞，固有层中的SOMmRNA阳性细胞(↑) ×400
图9 伤后1h，大鼠小肠粘膜下神经丛中CRFmRNA阳性细胞(
)，粘膜下层中CRFmRNA阳性细胞(↑) ×400, 百拇医药
图10 伤后1h，大鼠膀胱上皮中CRFmRNA阳性细胞(
) ×400图11 伤后30min，大鼠大脑皮层中CRFmRNA阳性神经细胞(
) ×400图12 伤后12h，大鼠下丘脑室旁核中CRFmRNA阳性神经细胞(
) ×400Fig.4 The control group, the SOMmRNA positive neurons (
) in periventricular zone. ×400, 百拇医药
Fig.5 The SOMmRNA positive neurons (
) in periventricular zone at 1h after wound. ×400Fig.6 The CRFmRNA positive neurons(
) in cerebral cortex at 1h after wound. ×400Fig.7 The CRFmRNA positive neurons(
)in paraventricular nucleus at 1h after wound. ×400, 百拇医药 Fig.8 The SOMmRNA positive cells in intestinal gland(
) and in lamina propria (↑) of the small intestine at 1h after wound. ×400Fig.9 The CRFmRNA positive cells in the Meissner plexus(
) and in the submucosa (↑) of the small in intestine at 1h after wound. ×400Fig.10 The CRFmRNA positive cells in epithelium of the urinary bladder at 1h after wound. ×400
, 百拇医药
Fig.11 The CRFmRNA positive neurons (
) in cerebral cortex at 30 min after wound. ×400Fig.12 The CRFmRNA positive neurons (
) in paraventricular nucleus at 12 h after wound. ×400讨 论
1. 高能爆炸伤后，脑、小肠、膀胱的形态学变化及意义
本实验结果表明，大鼠双后肢高能爆炸伤后，在光镜下，远位器官(脑、小肠、膀胱)未见明显的病理学改变，但超微结构病理变化明显，主要集中在血管内皮细胞和脑组织，说明高能爆炸伤时，压力波、冲击波沿血流传导而致血管内皮直接受损，造成远位器官损伤，支持刘荫秋等[5，6]的血流扰动学说。而脑离后肢最远，也出现了神经纤维退行性变、神经纤维间隙增宽等，提示压力波、冲击波可致远位器官的损伤，其作用机制还有待研究。
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2. SOM及其mRNA和CRFmRNA的变化规律及意义
图像分析结果提示，大鼠双后肢高能爆炸伤后，SOM及其mRNA和CRFmRNA均有一过性的、应激性的变化，且转录水平(mRNA水平)的峰值为伤后1h，翻译水平(蛋白水平以SOM为代表)的峰值为伤后6h，伤后12h两者均基本恢复正常。这一变化规律提示：当机体受到严重创伤后，首先激活基因，即SOMmRNA和CRFmRNA即刻增高，伤后1h达峰值。而这些被大量转录的mRNA则可翻译成蛋白多肽，使血和组织中的蛋白水平升高，至伤后6h达峰值。本研究结果与以往所报道资料基本一致，如蔡文琴等[7]的研究表明，犬高速投射物伤后，血和胃肠道、心、肺中血管活性肠肽(VIP)、神经紧张素(neroutensin)、强啡肽(dynorphin)、β-内啡肽(β-endorphin)和SOM的变化峰值，均在伤后6h。血浆儿茶酚胺浓度也增加，其中肾上腺素更明显，且主要集中在伤后6h左右[8]。但未见高速投射物伤后，神经内分泌因子转录水平的报道。
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3. 高能爆炸伤后，在小肠、膀胱出现SOMmRNA信号细胞及SOM免疫反应性细胞和CRFmRNA信号细胞的可能意义
原位杂交结果显示，伤后1h，在小肠粘膜下层和粘膜固有层以及膀胱上皮和膀胱结缔组织中，均出现有CRFmRNA信号和SOMmRNA信号细胞，其形态、大小各异，除膀胱上皮的阳性细胞可确认为上皮性质外，结缔组织中阳性细胞的确切性质和病理生理学意义还有待研究。这一结果，目前尚未见有同类文献报道。推测在严重创伤应激下，机体除调动中枢神经系统和外周神经系统的神经内分泌细胞合成和分泌神经内分泌因子外，还激活其他细胞，合成和分泌神经内分泌因子，参与或调节机体的应激过程及高能爆炸伤后远达效应的发生和发展。这些推测尚需进一步研究得以证实。
参考文献
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[7]蔡文琴，王正品，吴 康等.狗双后肢高速枪弹伤后外周血及组织中神经肽的变化.中华创伤杂志，1991，7(增刊)：21
[8]Huang MY, Wang DS, Liu YQ. Changes of plasma catecholamines in dogs injuried by fragments. J Trauma, 1990, 6(2):suppl 341
THE STUDY OF REMOTE ORGANS OF THE RAT AFTER HIGH
ENERGY EXPLOSIVE WOUND IN BOTH HIND LEGS
, 百拇医药
Li Wei, Cai WenqinΔ
(Department of Histology and Embryology, The Third Military Medical University, Chongqing)
By using in in situ hybridization, immunochemistry, HE staining, electron microscopy and image analysis, we studied the remote organs (the brain, the small intestine and the urinary bladder) of the rat with high energy explosive wound (HEEW) in both hind legs. The results showed: 1. Obvious pathological ultrastructure changes were observed after the HEEW. Especially, the shrinkage of endothelial cells of blood vessles in the small intestine and the urinary bladder; the neuropil edema and axon degeneration appeared in hypothalamus. 2. The expression of somatostatin (SOM) and its mRNA and corticotropin releasing factor (CRF) mRNA were transiently increased in the brain, the small intestine and the urinary bladder of the rat with HEEW. 3. The SOMmRNA and CRFmRNA were not only expressed in neuroendocrine cells but also in some other cells in small intestine and urinary bladder at 1h after the HEEW. The results suggested that:1.SOM and its mRNA as well as CRFmRNA are involved in the remote effects of HEEW. 2. There are some pathological ultrastructure changes in some remote organs of the rat after the HEEW in both hind legs.
KEY WORDS High energy explosive wound; Remote organs; Somatostatin; Corticotropin releasing factor, In situ hybridization; Immunohistochemistry
△Department of Histology and Embryology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038,China
* 中国人民解放军“九五”指令性基金课题(No.96L039), 百拇医药