小鼠卵细胞质内显微注入单精子受精的实验研究
作者：杨益寿 熊素芳 龙 文 李 鸣 夏明珠 汪昌介
单位：湖北医科大学附属第一医院，武汉 430060
关键词：卵胞质内单精子注射；显微注射针；采卵时相；培养液；昆明白小鼠
解剖学报/980425 摘 要 为了探讨提高小鼠卵细胞质内单精子注入受精率的方法，选取鼠龄12～14周的健康昆明白小鼠作为精子和卵子的供体，采用ICSI技术，以受精后二细胞卵裂的形成率为指标，了解不同采卵时间、不同微注射针参数及不同培养液对细胞质内单精子注入的影响。结果表明，hCG注射后18～19h采卵，用针尖内径为4～5 μm、斜面角度为35～40度的微注射针进行ICSI操作，受精后卵子置CZB中培养可获得较多的2细胞胚，卵裂率明显高于其余各组(28.10%)，有高度显著性差异(P<0.01)。结果提示：恰当的采卵时间、微注射针参数及培养液对ICSI结果有很大影响。
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动物的显微注精始于1962年，到80年代后期取得重大进展。显微注精技术可分为透明带下单精子或多精子注射[1]、透明带部分切除[2]、透明带打扎[3]、胞质内精子注射[4]等。其中卵胞质内精子注射，精子不需在体外获能，且对精子形态的选择无严格要求[5]，因此对生殖医学的基础及应用研究均有较高的价值。我们从1994年开始，在湖北省畜牧研究所生物工程室协助下，对昆明白小鼠卵细胞质内单精子注入受精时取卵时相、微注射针参数及不同的体外培养系统等影响因素进行研究，获得部分结果，报道如下。
材料和方法
1. 实验动物
选出生后12～14周健康昆明白小鼠，雄性体重30～40g，雌性体重20～25g。均取自湖北省医科院实验动物中心。
, 百拇医药
2. 精子采集和处理
将上述小鼠处死，分离附睾，置M2培养液[6]中，轻压附睾尾部，精子自然流出。将精子离心洗涤2次，保留0.4ml M2液，置5%CO2培养箱(37℃)，60min，待用。
3. 超排及采卵
将上述所选取的雌性小鼠，腹腔注射孕马血清(PMSG)5IU， 48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)5IU,第2次注射后13～19h处死雌鼠，分离卵巢和输卵管，用5号针头划破输卵管膨大部，轻轻挤压，使卵块排出，置0.1%透明质酸酶中5min，使卵细胞裸化，导入不同培养液中，放入5%CO2培养箱(37℃)15 min，待用。
4. 培养液的配制
M16[6]、WM[7]及CZB[8]3种培养液(均购自华美生化试剂公司)均用五蒸水配制(表1)。
, 百拇医药
5. 操作用针、管的制备
5.1 固定管制备：取直径1 mm，长120 mm毛细玻璃管在酒精灯上加热，拉制成外径约0.12～0.14 mm的细管，将细管的端口在修针仪上加温，修制成内径20～30 μm、边缘整齐光滑的固定管。
5.2 微注射针的制备：取直径1 mm，长120 mm毛细玻璃管，在拉针仪上拉制成尖长约0.5 cm的细针，在磨针仪上加工成内径分别为6～7 μm、4～5 μm及<4μm、针口斜面为35～60度的微注射针。上述制备的针、管均经清洗、消毒待用。
表1 培养液的主要成分
Table 1 Main components of media 培养液成分(10g/L)(component of mdeia)
M16培养液
, 百拇医药
WM培养液
CZB培养液
氯化钠
NaCl
0.553
0.514
0.477
氯化钾
KCl
0.035
0.036
0.036
磷酸二氢钾
, 百拇医药
KH2PO4
0.016
0.016
0.016
硫酸镁
MgSO4.7H2O
0.029
0.029
0.029
碳酸氢钠
NaHCO3
, 百拇医药
0.210
0.190
0.211
氯化钙
CaCl2.2H2O
0.025
0.025
葡萄糖
D-Glucose
0.100
0.100
乳酸钠
, 百拇医药
Sodium lactate
0.35ml
0.37ml
0.45ml
乳酸钙
Calcium lactate
0.053
丙酮酸钠
Sodium pyruvate
0.003
0.003
0.003
, 百拇医药
乙二胺四乙酸钠
EDTA-Na2
0.004
谷氨酰胺
Glutamine
0.014
牛血清白蛋白
BSA(mg/ml)
4
3
5
60%的乳酸钠糖汁(sodium lactate of 60% syrup)
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6. 实验设组
根据观察内容的不同分为以下几个部分
6.1 采卵时间：按设计要求，分为13 h、15 h、19h 3种不同采卵时间组。微注射针斜面角度为35～40度，内径为4～5 μm。显微注射后置M16液中培养。
6.2 微注射针不同参数观察：按设计要求，分为2组，均于hCG注射后19h取卵。第1组针口斜面角度为45～60度，内径分别为6～7μm、4～5μm及<4 μm。第2组针口斜面为35～40度，各内径同上。显微注射后置M16液中培养。
6.3 不同体外培养系统的观察：按设计要求，分为M16组、WM组、CZB组。均于hCG注射后19h取卵，微注射针斜面角度为35～40度，内径为4～5 μm。
以上各部分均设实验对照组和空白对照组。前者除微注射针未吸入精子外，操作同前，旨在排除机械刺激诱发卵细胞激活的假阳性。后者在取出卵细胞后，置入上述各培养液中，不作任何处理，以排除卵细胞自发激活分裂因素的干扰。
, 百拇医药
7. 显微注射受精
在凹形载玻片中央滴约5μl的M2微滴，内置卵细胞5～8枚，旁边置经10%PVP稀释的精子悬液，上覆石蜡油，用固定针固定卵细胞，如见第一极体，则应使之位于12点或6点处，微注射针将精子从尾部吸入，使精子头部位于管口，从3点处进针，避开核区，尽量少带入培养液(图1)。注射卵放入M16液中，上覆石蜡油，置5%CO2培养箱37℃，培养8h，观察结果。
8. 卵细胞受精的判断
以卵细胞出现卵裂为标准(图2)。
本实验全部数据用χ2检验(chi-square text)，直接计算概率法等进行统计学处理。
, 百拇医药 图1 将精子注入小鼠卵细胞 ×400
图2 显微注精卵细胞发育到2-4细胞 ×400
Fig.1 The oocyte was microinjected into a sperm. ×400
Fig.2 The oocyte microinjected cleaved to 2-4 cell in vitro ×400
结 果
不同采卵时间的观察显示，hCG注射后19h采卵出现的卵裂为二细胞的形成率，均明显高于其他4组，呈显著差异(P<0.01)。其他4组间卵裂为二细胞的形成率均极低，差异不显著，P>0.05。不同微注射针参数观察显示，针尖斜面为35～40度、内径为4～5μm时，卵裂率明显高于其余各组，差异高度显著(P<0.01)。而空白对照组形态正常率明显高于其余各组，这提示微注射针对卵细胞的机械损伤，是影响受精率的重要因素，不同体外培养系统的观察显示，CZB组卵裂率明显高于其余各组，差异高度显著(P<0.01)。以上结果提示，hCG注射后19h取卵，用针尖斜面为35～40度、针尖内径为4～5 μm微注射针操作卵细胞，用CZB液进行体外培养，可获较多形态正常的操作后卵细胞及较高受精率(表2～5)。
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表2 不同采卵时间对小鼠卵细胞质内
显微注入受精的影响
Table 2 Effect of different time of
collecting mouse eggs on ICSI 组别
group
卵数
amount of eggs
二细胞形成率
2-cell formed(%)
13h
115
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1.73
15h
140
3.57
19h
710
18.03
实验对照 exper-
iment control
180
1.66
空白对照
control
, 百拇医药
200
0
表3 斜面为45～60度时，不同针尖内径的显微注入受精结果
Table 3 Effect of different internal diameter
of injection pipette with incline plane angle
of 45-60 on ICSI 组别
group
卵数
amount of eggs
形态正常率(%)
, 百拇医药
normal shape
二细胞形成率(%)
2-cell formed
6～7 μm
62
17.74
0
4～5 μm
78
51.28
3.85
<4 μm
, 百拇医药 73
21.91
2.74
实验对照 exper-
iment control
65
46.15
0
空白对照
control
79
96.20
0
, 百拇医药
表4 斜面为35～40度时，不同针尖内径的显微注入受精结果
Table 4 Effect of different internal diameter
of injection pipette with incline plane angle
of 35-40 on ICSI 组别
group
卵数
amount of eggs
形态正常率(%)
normal shape
, 百拇医药 二细胞形成率(%)
2-cell formed
6～7 μm
67
22.39
0
4～5 μm
76
72.37
13.16
<4 μm
61
34.43
, 百拇医药
3.28
实验对照 exper-
iment control
60
61.67
0
空白对照
control
64
95.53
0
表5 不同培养液对显微注入受精的影响
, 百拇医药
Table 5 Effect of different
medium on ICSI 组别
group
卵数
amount of eggs
二细胞形成率
2-cell formed(%)
M16
710
18.03
WM
366
, http://www.100md.com
7.92
CZB
710
28.10
实验对照 exper-
iment control
502
1.19
空白对照
control
553
0.54
讨 论
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在哺乳动物的卵细胞质内单精子注入(intracytoplasmic sperm injection)受精中，小鼠卵细胞质内显微注精是较困难的。小鼠卵细胞较小，抗损伤能力弱，自我修复能力差，轻微的机械损伤就会造成不可逆的损害，使之很快溶解，而且对外界环境的变化也较敏感。因此，小鼠卵胞质内显微注精的受精率往往较低[3，9]，近年来，一些非常规操作设备(如具有近距离高速穿刺功能的显微操作系统)的应用提高了小鼠卵胞质内显微注精的受精率[9]，但对这一技术各个关键环节的改进仍是十分重要的。本实验使用常规显微操作设备，对显微受精过程中的一些环节进行观察、比较、筛选，得到了较好的结果。
1. 采卵时间的选择
目前的研究大多表明，小鼠卵细胞显微注精的采卵时间和经典的体外受精一样，在hCG注射后14～15h进行[10]。但显微注精的过程毕竟与经典体外受精不同，它不经过精子获能，卵膜融合等过程，因而显微注精的集卵时间是否须和经典体外受精一致，还须进一步研究。我们在hCG注射后19h采卵，进行胞质内单精注射，获得比其他时相大的受精率，是否因为这一时期的卵细胞更易被激活而促进注入精子解聚形成原核，还有待研究。
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2. 不同参数的微注射针选择
选择恰当的微注射针尖的内径及斜面的角度，对将显微注射时卵细胞的损伤降低到最低限度非常重要。关于微注射针尖斜面的角度，报道不等[9，10]，根据操作设备的不同，有所变化，但多在35～60度之间。由于小鼠卵细胞透明带及卵膜有一定的韧性，根据我们的观察，斜面大于40度，进针时会遇到较大的抵抗，难以一次穿透透明带及卵膜，破坏了细胞质的稳定状态，使受精后的卵细胞不能正常发育。本实验表明，针尖斜面角度在35～40度之间较为恰当，可在显微操作后获得较多形态正常的卵细胞及较高的受精率。关于微注射针尖的内径，报道多在4～7μm之间[9，10]。根据我们的观察，内径大于6μm，会造成卵细胞较大的损伤，使卵胞质较多外流，并使随精子进入细胞质的操作液过多，导致卵细胞溶解。内径小于4μm时，整个精子头部完全卡在注射针口外，进针时易使精子头和尾部分离，不能进入卵细胞质内，给操作带来一定困难。本实验表明，针尖内径在4～5 μm之间、斜面在35～40度较为合适，此时，整个精子头部正位于管口，进针容易，且带入操作液较少，对卵细胞机械损伤小，可获得较高的受精率。
, 百拇医药
3.不同体外培养液的选择
M16、WM及CZB培养液为小鼠体外受精常用培养液，3者组成成分的最大差别在于：WM含乳酸钙，CZB液含谷氨酰胺及EDTA，其余成分类似。本实验CBZ组卵裂率明显高于其他各组，WM组卵裂最低，提示培养液组成成分的不同对小鼠卵胞质内显微注精的结果有很大影响。
CZB液提高小鼠卵细胞质内显微注精卵裂率的机理可能是以下几个方面：(1) 谷氨酰胺的作用：研究提示，体外受精的早期小鼠胚胎，不能有效利用葡萄糖提供能量，而谷氨酰胺可补充其能量的供给[8，11]。1～2细胞小鼠胚胎中，谷氨酰胺的聚集超过其他氨基酸。此外，谷氨酰胺在核苷酸的合成方面也起着重要作用。这些对小鼠胚胎的早期发育都是有利的。(2) EDTA的作用：报告表明[12]，具有细胞毒性的重金属离子，对早期胚胎是极为不利的，可导致胚胎发育完全停止。而EDTA可与重金属离子形成螯合物，起到清除及中和重金属离子的作用，有利于胚胎的体外发育。(3) 培养液中其他成分在量方面的平衡，也会对胚胎的发育产生影响[13]。CZB液中NaCl浓度明显低于其他两种培养液，而WM中含乳酸钙，其显微注精后培养结果明显低于其他两组，可能和培养液中各成分间量的不同组合有关。最后，大部分品系的小鼠体外受精胚胎发育阻滞发生在较早时期，即受精卵发育停止在2细胞期。而小鼠卵细胞质内显微注精的卵裂率一般较低(15%左右)这一事实是否提示，胞质内显微注精更多地干扰了卵细胞的正常受精过程，从而可能使胚胎发育的阻滞期提前到2细胞前。而CZB液是否由于上述原因，可能突破胚胎发育2细胞期前的阻滞，使卵裂率提高，还有待进一步研究。
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本研究得到湖北省农业科学院动物生物工程实验室魏庆信研究员、樊俊华副研究员、郑新民副研究员、赵浩斌博士协助，特此感谢。
参考文献
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[2]Cohen J, Alikani M, Malter HE, et al. Partial zona dissection or subzonal sperm insertion: micro-surgical fertilization alternatives based on evaluation of sperm and embryo morphology. Fertil Steril, 1991, 56(2):696
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[10]Iritani A, Utsumi K, Miyake M, et al. In vitro fertilization by a routine method and by micromanipulation. Ann N Y Acad Sci, 1988, 541:583
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[12]Mehta TS, Kiessling AA. The development potential of mouse embryos conceived in Ham's F-10 medium containing ethylenediaminetetraacetic acid. Fertil Steril, 1993,60(6):1088
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[13]Lawitts JA, Biggers JD. Overcoming the 2-cell block by modifying standard components in a mouse embryo culture medium. Biol Reprod, 1991, 45(2):245
EXPERIMENTAL STUDY ON INTRACYTOPLASMIC SPERM
INJECTION IN THE MOUSE EGG
Yang Yishou△, Xiong Shufang, Long Wen, Li Ming,Xia Mingzhu Wang Changje
(First Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan)
, 百拇医药
To study methods raising average percentage of fertilization by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in muose eggs. Methods: Kunming white mice (12-14 weeks of age) were use as donors of sperms or eggs. The presentation of 2-cell blastomere was considered a success of fertilization. The influence of different parameter of micropipette,phases of collecting eggs and media on ICSI was investigated. Results: The results showed that the average percentage of 2-cell stage was clearly higher (28.10%) than that of other groups while using micropipette tip with internal diameter 4-5 μm and angle of incline plane 35-40, collecting eggs on 18-19 h after injecting human chorionic gonadotrophin、 application of Chatot-Ziomek-Bavister medium. Conclusion: Results suggest that proper parameter of micropipette,phases of collecting eggs and selected medium were closely related to percentage of fertilization during ICSI course.
KEY WORDS Intracytoplasmic sperm injection; Micropipette; Medium; Phase of collecting eggs; Kunming white mouse
△First Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430060, China, 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第一医院，武汉 430060
关键词：卵胞质内单精子注射；显微注射针；采卵时相；培养液；昆明白小鼠
解剖学报/980425 摘 要 为了探讨提高小鼠卵细胞质内单精子注入受精率的方法，选取鼠龄12～14周的健康昆明白小鼠作为精子和卵子的供体，采用ICSI技术，以受精后二细胞卵裂的形成率为指标，了解不同采卵时间、不同微注射针参数及不同培养液对细胞质内单精子注入的影响。结果表明，hCG注射后18～19h采卵，用针尖内径为4～5 μm、斜面角度为35～40度的微注射针进行ICSI操作，受精后卵子置CZB中培养可获得较多的2细胞胚，卵裂率明显高于其余各组(28.10%)，有高度显著性差异(P<0.01)。结果提示：恰当的采卵时间、微注射针参数及培养液对ICSI结果有很大影响。
, http://www.100md.com
动物的显微注精始于1962年，到80年代后期取得重大进展。显微注精技术可分为透明带下单精子或多精子注射[1]、透明带部分切除[2]、透明带打扎[3]、胞质内精子注射[4]等。其中卵胞质内精子注射，精子不需在体外获能，且对精子形态的选择无严格要求[5]，因此对生殖医学的基础及应用研究均有较高的价值。我们从1994年开始，在湖北省畜牧研究所生物工程室协助下，对昆明白小鼠卵细胞质内单精子注入受精时取卵时相、微注射针参数及不同的体外培养系统等影响因素进行研究，获得部分结果，报道如下。
材料和方法
1. 实验动物
选出生后12～14周健康昆明白小鼠，雄性体重30～40g，雌性体重20～25g。均取自湖北省医科院实验动物中心。
, 百拇医药
2. 精子采集和处理
将上述小鼠处死，分离附睾，置M2培养液[6]中，轻压附睾尾部，精子自然流出。将精子离心洗涤2次，保留0.4ml M2液，置5%CO2培养箱(37℃)，60min，待用。
3. 超排及采卵
将上述所选取的雌性小鼠，腹腔注射孕马血清(PMSG)5IU， 48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)5IU,第2次注射后13～19h处死雌鼠，分离卵巢和输卵管，用5号针头划破输卵管膨大部，轻轻挤压，使卵块排出，置0.1%透明质酸酶中5min，使卵细胞裸化，导入不同培养液中，放入5%CO2培养箱(37℃)15 min，待用。
4. 培养液的配制
M16[6]、WM[7]及CZB[8]3种培养液(均购自华美生化试剂公司)均用五蒸水配制(表1)。
, 百拇医药
5. 操作用针、管的制备
5.1 固定管制备：取直径1 mm，长120 mm毛细玻璃管在酒精灯上加热，拉制成外径约0.12～0.14 mm的细管，将细管的端口在修针仪上加温，修制成内径20～30 μm、边缘整齐光滑的固定管。
5.2 微注射针的制备：取直径1 mm，长120 mm毛细玻璃管，在拉针仪上拉制成尖长约0.5 cm的细针，在磨针仪上加工成内径分别为6～7 μm、4～5 μm及<4μm、针口斜面为35～60度的微注射针。上述制备的针、管均经清洗、消毒待用。
表1 培养液的主要成分
Table 1 Main components of media 培养液成分(10g/L)(component of mdeia)
M16培养液
, 百拇医药
WM培养液
CZB培养液
氯化钠
NaCl
0.553
0.514
0.477
氯化钾
KCl
0.035
0.036
0.036
磷酸二氢钾
, 百拇医药
KH2PO4
0.016
0.016
0.016
硫酸镁
MgSO4.7H2O
0.029
0.029
0.029
碳酸氢钠
NaHCO3
, 百拇医药
0.210
0.190
0.211
氯化钙
CaCl2.2H2O
0.025
0.025
葡萄糖
D-Glucose
0.100
0.100
乳酸钠
, 百拇医药
Sodium lactate
0.35ml
0.37ml
0.45ml
乳酸钙
Calcium lactate
0.053
丙酮酸钠
Sodium pyruvate
0.003
0.003
0.003
, 百拇医药
乙二胺四乙酸钠
EDTA-Na2
0.004
谷氨酰胺
Glutamine
0.014
牛血清白蛋白
BSA(mg/ml)
4
3
5
60%的乳酸钠糖汁(sodium lactate of 60% syrup)
, http://www.100md.com
6. 实验设组
根据观察内容的不同分为以下几个部分
6.1 采卵时间：按设计要求，分为13 h、15 h、19h 3种不同采卵时间组。微注射针斜面角度为35～40度，内径为4～5 μm。显微注射后置M16液中培养。
6.2 微注射针不同参数观察：按设计要求，分为2组，均于hCG注射后19h取卵。第1组针口斜面角度为45～60度，内径分别为6～7μm、4～5μm及<4 μm。第2组针口斜面为35～40度，各内径同上。显微注射后置M16液中培养。
6.3 不同体外培养系统的观察：按设计要求，分为M16组、WM组、CZB组。均于hCG注射后19h取卵，微注射针斜面角度为35～40度，内径为4～5 μm。
以上各部分均设实验对照组和空白对照组。前者除微注射针未吸入精子外，操作同前，旨在排除机械刺激诱发卵细胞激活的假阳性。后者在取出卵细胞后，置入上述各培养液中，不作任何处理，以排除卵细胞自发激活分裂因素的干扰。
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7. 显微注射受精
在凹形载玻片中央滴约5μl的M2微滴，内置卵细胞5～8枚，旁边置经10%PVP稀释的精子悬液，上覆石蜡油，用固定针固定卵细胞，如见第一极体，则应使之位于12点或6点处，微注射针将精子从尾部吸入，使精子头部位于管口，从3点处进针，避开核区，尽量少带入培养液(图1)。注射卵放入M16液中，上覆石蜡油，置5%CO2培养箱37℃，培养8h，观察结果。
8. 卵细胞受精的判断
以卵细胞出现卵裂为标准(图2)。
本实验全部数据用χ2检验(chi-square text)，直接计算概率法等进行统计学处理。
, 百拇医药 图1 将精子注入小鼠卵细胞 ×400
图2 显微注精卵细胞发育到2-4细胞 ×400
Fig.1 The oocyte was microinjected into a sperm. ×400
Fig.2 The oocyte microinjected cleaved to 2-4 cell in vitro ×400
结 果
不同采卵时间的观察显示，hCG注射后19h采卵出现的卵裂为二细胞的形成率，均明显高于其他4组，呈显著差异(P<0.01)。其他4组间卵裂为二细胞的形成率均极低，差异不显著，P>0.05。不同微注射针参数观察显示，针尖斜面为35～40度、内径为4～5μm时，卵裂率明显高于其余各组，差异高度显著(P<0.01)。而空白对照组形态正常率明显高于其余各组，这提示微注射针对卵细胞的机械损伤，是影响受精率的重要因素，不同体外培养系统的观察显示，CZB组卵裂率明显高于其余各组，差异高度显著(P<0.01)。以上结果提示，hCG注射后19h取卵，用针尖斜面为35～40度、针尖内径为4～5 μm微注射针操作卵细胞，用CZB液进行体外培养，可获较多形态正常的操作后卵细胞及较高受精率(表2～5)。
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表2 不同采卵时间对小鼠卵细胞质内
显微注入受精的影响
Table 2 Effect of different time of
collecting mouse eggs on ICSI 组别
group
卵数
amount of eggs
二细胞形成率
2-cell formed(%)
13h
115
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1.73
15h
140
3.57
19h
710
18.03
实验对照 exper-
iment control
180
1.66
空白对照
control
, 百拇医药
200
0
表3 斜面为45～60度时，不同针尖内径的显微注入受精结果
Table 3 Effect of different internal diameter
of injection pipette with incline plane angle
of 45-60 on ICSI 组别
group
卵数
amount of eggs
形态正常率(%)
, 百拇医药
normal shape
二细胞形成率(%)
2-cell formed
6～7 μm
62
17.74
0
4～5 μm
78
51.28
3.85
<4 μm
, 百拇医药 73
21.91
2.74
实验对照 exper-
iment control
65
46.15
0
空白对照
control
79
96.20
0
, 百拇医药
表4 斜面为35～40度时，不同针尖内径的显微注入受精结果
Table 4 Effect of different internal diameter
of injection pipette with incline plane angle
of 35-40 on ICSI 组别
group
卵数
amount of eggs
形态正常率(%)
normal shape
, 百拇医药 二细胞形成率(%)
2-cell formed
6～7 μm
67
22.39
0
4～5 μm
76
72.37
13.16
<4 μm
61
34.43
, 百拇医药
3.28
实验对照 exper-
iment control
60
61.67
0
空白对照
control
64
95.53
0
表5 不同培养液对显微注入受精的影响
, 百拇医药
Table 5 Effect of different
medium on ICSI 组别
group
卵数
amount of eggs
二细胞形成率
2-cell formed(%)
M16
710
18.03
WM
366
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7.92
CZB
710
28.10
实验对照 exper-
iment control
502
1.19
空白对照
control
553
0.54
讨 论
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在哺乳动物的卵细胞质内单精子注入(intracytoplasmic sperm injection)受精中，小鼠卵细胞质内显微注精是较困难的。小鼠卵细胞较小，抗损伤能力弱，自我修复能力差，轻微的机械损伤就会造成不可逆的损害，使之很快溶解，而且对外界环境的变化也较敏感。因此，小鼠卵胞质内显微注精的受精率往往较低[3，9]，近年来，一些非常规操作设备(如具有近距离高速穿刺功能的显微操作系统)的应用提高了小鼠卵胞质内显微注精的受精率[9]，但对这一技术各个关键环节的改进仍是十分重要的。本实验使用常规显微操作设备，对显微受精过程中的一些环节进行观察、比较、筛选，得到了较好的结果。
1. 采卵时间的选择
目前的研究大多表明，小鼠卵细胞显微注精的采卵时间和经典的体外受精一样，在hCG注射后14～15h进行[10]。但显微注精的过程毕竟与经典体外受精不同，它不经过精子获能，卵膜融合等过程，因而显微注精的集卵时间是否须和经典体外受精一致，还须进一步研究。我们在hCG注射后19h采卵，进行胞质内单精注射，获得比其他时相大的受精率，是否因为这一时期的卵细胞更易被激活而促进注入精子解聚形成原核，还有待研究。
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2. 不同参数的微注射针选择
选择恰当的微注射针尖的内径及斜面的角度，对将显微注射时卵细胞的损伤降低到最低限度非常重要。关于微注射针尖斜面的角度，报道不等[9，10]，根据操作设备的不同，有所变化，但多在35～60度之间。由于小鼠卵细胞透明带及卵膜有一定的韧性，根据我们的观察，斜面大于40度，进针时会遇到较大的抵抗，难以一次穿透透明带及卵膜，破坏了细胞质的稳定状态，使受精后的卵细胞不能正常发育。本实验表明，针尖斜面角度在35～40度之间较为恰当，可在显微操作后获得较多形态正常的卵细胞及较高的受精率。关于微注射针尖的内径，报道多在4～7μm之间[9，10]。根据我们的观察，内径大于6μm，会造成卵细胞较大的损伤，使卵胞质较多外流，并使随精子进入细胞质的操作液过多，导致卵细胞溶解。内径小于4μm时，整个精子头部完全卡在注射针口外，进针时易使精子头和尾部分离，不能进入卵细胞质内，给操作带来一定困难。本实验表明，针尖内径在4～5 μm之间、斜面在35～40度较为合适，此时，整个精子头部正位于管口，进针容易，且带入操作液较少，对卵细胞机械损伤小，可获得较高的受精率。
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3.不同体外培养液的选择
M16、WM及CZB培养液为小鼠体外受精常用培养液，3者组成成分的最大差别在于：WM含乳酸钙，CZB液含谷氨酰胺及EDTA，其余成分类似。本实验CBZ组卵裂率明显高于其他各组，WM组卵裂最低，提示培养液组成成分的不同对小鼠卵胞质内显微注精的结果有很大影响。
CZB液提高小鼠卵细胞质内显微注精卵裂率的机理可能是以下几个方面：(1) 谷氨酰胺的作用：研究提示，体外受精的早期小鼠胚胎，不能有效利用葡萄糖提供能量，而谷氨酰胺可补充其能量的供给[8，11]。1～2细胞小鼠胚胎中，谷氨酰胺的聚集超过其他氨基酸。此外，谷氨酰胺在核苷酸的合成方面也起着重要作用。这些对小鼠胚胎的早期发育都是有利的。(2) EDTA的作用：报告表明[12]，具有细胞毒性的重金属离子，对早期胚胎是极为不利的，可导致胚胎发育完全停止。而EDTA可与重金属离子形成螯合物，起到清除及中和重金属离子的作用，有利于胚胎的体外发育。(3) 培养液中其他成分在量方面的平衡，也会对胚胎的发育产生影响[13]。CZB液中NaCl浓度明显低于其他两种培养液，而WM中含乳酸钙，其显微注精后培养结果明显低于其他两组，可能和培养液中各成分间量的不同组合有关。最后，大部分品系的小鼠体外受精胚胎发育阻滞发生在较早时期，即受精卵发育停止在2细胞期。而小鼠卵细胞质内显微注精的卵裂率一般较低(15%左右)这一事实是否提示，胞质内显微注精更多地干扰了卵细胞的正常受精过程，从而可能使胚胎发育的阻滞期提前到2细胞前。而CZB液是否由于上述原因，可能突破胚胎发育2细胞期前的阻滞，使卵裂率提高，还有待进一步研究。
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本研究得到湖北省农业科学院动物生物工程实验室魏庆信研究员、樊俊华副研究员、郑新民副研究员、赵浩斌博士协助，特此感谢。
参考文献
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EXPERIMENTAL STUDY ON INTRACYTOPLASMIC SPERM
INJECTION IN THE MOUSE EGG
Yang Yishou△, Xiong Shufang, Long Wen, Li Ming,Xia Mingzhu Wang Changje
(First Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan)
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To study methods raising average percentage of fertilization by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in muose eggs. Methods: Kunming white mice (12-14 weeks of age) were use as donors of sperms or eggs. The presentation of 2-cell blastomere was considered a success of fertilization. The influence of different parameter of micropipette,phases of collecting eggs and media on ICSI was investigated. Results: The results showed that the average percentage of 2-cell stage was clearly higher (28.10%) than that of other groups while using micropipette tip with internal diameter 4-5 μm and angle of incline plane 35-40, collecting eggs on 18-19 h after injecting human chorionic gonadotrophin、 application of Chatot-Ziomek-Bavister medium. Conclusion: Results suggest that proper parameter of micropipette,phases of collecting eggs and selected medium were closely related to percentage of fertilization during ICSI course.
KEY WORDS Intracytoplasmic sperm injection; Micropipette; Medium; Phase of collecting eggs; Kunming white mouse
△First Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430060, China, 百拇医药