人鼻咽不同部位粘膜上皮PCNA表达的比较研究*
作者：黎众魁 姚开泰 王磊
单位：黎众魁 姚开泰 王磊(湖南医科大学肿瘤研究所，长沙 410078)
关键词：增殖细胞核抗原；图像分析；免疫组织化学；人鼻咽上皮
解剖学报990111
【摘要】 目的 探讨鼻咽部肿瘤发生位置差异性的机理。 方法 应用免疫组织化学与图像分析技术对人鼻咽粘膜上皮增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达状况进行了比较研究。 结果 鼻咽上皮的PCNA标记指数以及PCNA阳性细胞的分布状况均随发育时期及其所处鼻咽部位置的不同而变化，成人鼻咽的顶壁和侧壁粘膜上皮具有相对较高的PCNA标记指数，与人鼻咽癌的易感部位正好形成对应关系。 结论 鼻咽部不同部位的粘膜上皮在上皮细胞群体增殖活性上存在着差异，鼻咽部肿瘤发生的位置易感性很可能与其上皮细胞群体增殖活性的差异有关。
, 百拇医药
COMPARATIVE STUDIES OF PCNA EXPRESSION AMONG MUCOSAL
EPITHELIA IN DIFFERENT REGIONS OF HUMAN NASOPHARYNX
Li Zhougkui△，Yao Kaitai，Wang Lei
(Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha)
【Abstract】 Objective To research the mechanism of region differences in nasopharyngeal neoplasm development.Methods The state of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) expression in the human nasopharyngeal mucosal epithelium was investigated by means of immunohistochemical method and image analysis technique.Results The PCNA labeling index of the nasopharyngeal epithelium and the distribution of PCNA positive cells in the nasopharyngeal epithelium changed with the stages of development and the sites of the nasopharynx,and that the PCNA labeling index of the mucosal epithelia of the roof and lateral walls in the adult nasopharynx was comparatively higher than that of the others,which was consistent with the susceptible sites of nasopharyngeal carcinoma.Conclusions It suggested that the proliferating activity of epithelial cell populations among the different regions of human nasopharynx was different,and that the site susceptivity of nasopharyngeal neoplasm development might be related to the difference of the proliferating activity of epithelial cell populations.
, 百拇医药
【Key words】 PCNA; Image analysis; Immunohistochemistry;Human nasopharyngeal epithelium
人类鼻咽癌的发生不仅具有明显的种族性和地域性，而且还具有鼻咽部的位置差异性。原发性鼻咽癌最常见于鼻咽部的顶壁和侧壁[1]，而鼻咽上皮鳞状化生的好发部位也正好处于鼻咽部的顶壁和侧壁[2]。这是否反映了鼻咽部的顶壁和侧壁粘膜上皮本身具有某种不同于其他部位的特殊性呢?从细胞生物学的角度来看，癌实质上是一种细胞分裂与分化异常的“细胞性”疾病，只有具有分裂能力的干细胞才能发生肿瘤性转变；另一方面，致癌因子的致癌效应只有通过细胞分裂才能固定下来，因而发生活跃细胞增殖的部位也是对致癌因子最敏感的部位。所以，鼻咽部顶壁和侧壁粘膜上皮易发鼻咽癌的倾向性有可能是该处上皮细胞群体增殖活性相对较高的反映。基于这一推测，我们应用单克隆抗体免疫组织化学方法对鼻咽不同部位粘膜上皮增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达状况进行了较为系统的比较研究，得到了有意义的结果，现报道如下。
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材料和方法
1.组织来源及其处理
7例正常成人鼻咽标本取自突发性死亡病例，年龄25～50周岁，男女性别比为4∶3。15例胚胎鼻咽标本取自因故引产胚胎[顶臀长(crown-rump length,CRL)>100mm]，胚胎性别不拘。鼻咽标本沿纵向分割为顶、后、左侧、右侧、底壁5个区域，每1个区域又被横切分割为3等分，在10%中性缓冲福尔马林中固定12h，作定向石蜡包埋。切片(5μm)附贴于经3-aminopropyltriethoxysilane(APES)处理的玻片上，空气干燥过夜。
2. 抗体
PCNA免疫组织化学用鼠抗人PCNA单克隆抗体PC-10(IgG2a,DAKO)进行，该抗体可直接应用于甲醛固定的石蜡包埋标本。
3. 免疫组织化学
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切片经常规脱蜡、复水至蒸馏水，以3%H2O2溶液于室温处理5min以灭活内源性的过氧化物酶。蒸馏水洗后用标记链菌素-抗生物素系统(labelled streptavidin biotin,LSAB；DAKO公司产品)进行免疫染色。试验了各种不同稀释度一抗(PC-10)的反应效果，发现以1∶1 000稀释在4℃孵育过夜的效果最佳。Ni-DAB-H2O2为显色系统，核固红衬染。PCNA阳性核呈紫蓝至紫黑色。用TBS代替PC-10作阴性对照。
4.图像分析
在石蜡切片标本上用PC-10进行的免疫染色通常呈颗粒状，小部分呈弥散状，几乎完全局限于增殖细胞群体的核内，核着色深浅不一。本研究将所有核染色都看作阳性反应，而不管其染色反应的特征。用真彩色通用医学图像处理分析系统(TIPAS-98)对免疫染色结果进行图像处理和分析。在高倍镜(×400)下对每张切片各随机抽取10个视野，测量上皮区域内PCNA阳性细胞核所占的百分比。对每个鼻咽标本每个壁的3个横切等分段各取3张间隔50μm的连续切片进行分析，这样每个壁共计分析9张切片即90个视野，计算出每个鼻咽标本各个区域粘膜上皮的PCNA阳性细胞平均百分数(即PCNA标记指数)，以此来衡量鼻咽不同部位粘膜上皮的PCNA表达水平。用万道软件《统计设计与分析系统(SDAS)》对结果进行数据处理和统计分析。
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结 果
1.PCNA阳性细胞在鼻咽上皮中的整体分布特点
我们仔细研究了PCNA阳性细胞(以下简称为PCNA细胞)在人鼻咽上皮中的整体分布状态，发现其与胚胎发育进程密切相关。在CRL为105～162mm胚胎的鼻咽上皮中，高达87%的PCNA细胞分布于基底细胞层；在CRL长为175～234mm胚胎的鼻咽上皮中，PCNA细胞的分布没有明显的上皮层次差异；而在CRL长为253～347mm胚胎的鼻咽上皮中，有90%的PCNA细胞分布于下2/3到1/3的上皮层区域内，其基底细胞层的PCNA细胞较前两个时期有所下降，但仍比成年人鼻咽上皮中基底细胞区域内的PCNA细胞要多得多。在发生上皮类型转化的区域内，PCNA细胞主要分布于基底细胞层，而且其基底细胞层中PCNA细胞的比例(约80%)明显高于同一胚胎鼻咽的非转化上皮区的基底细胞层(约40%)。成人鼻咽上皮的PCNA细胞有92%分布于下1/5到1/6的上皮层中，其基底细胞层的PCNA细胞很少见，通常不到10%(图1～8)。
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图9 人胚鼻咽上皮在不同发育时期以及不同部位之间的PCNA表达比较
Fig.9 Comparison of PCNA expression in epithelium among different region walls of human fetal nasopharynx at different stages of development.
2. 胚胎鼻咽上皮的PCNA表达随胚胎发育进程与鼻咽部位置而变化
我们根据鼻咽上皮的发育分化与PCNA细胞整体分布状态的变化特点，将所有研究的胚胎按CRL的不同划分为早期(CRL105～162mm)、中期(CRL175～234mm)及晚期(CRL253～347mm)3个时期进行统计分析，结果如图9所示。鼻咽上皮的PCNA整体表达水平是随发育进程及其所处鼻咽部位置的不同而变化的。在鼻咽的底壁、两侧壁以及顶壁粘膜上皮，PCNA标记指数均随CRL的增加而下降。在所有3个时期，鼻咽底壁粘膜上皮的PCNA标记指数都是5个壁中最低的，两侧壁粘膜上皮的PCNA标记指数基本一致，无统计学差异(P>0.05)，两者均显著高于底壁而低于顶壁。鼻咽后壁粘膜上皮的PCNA标记指数随发育进程的变化过程与其余4个壁的变化显著不同：在早期的胚胎鼻咽中，其PCNA标纪指数在5个壁中是最高的；在中期的胚胎鼻咽中，其PCNA标记指数显著低于顶壁(P<0.001)而高于两侧壁(P<0.01)；而在晚期的胚胎鼻咽中，其PCNA标记指数又上升为5个壁中最高的。
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进一步的研究表明，胚胎鼻咽后壁粘膜上皮PCNA标记指数的变化过程与上皮发生类型转化密切相关。在早期胚胎鼻咽的后壁粘膜上皮中，假复层纤毛柱状上皮大量转变为过渡型上皮；当胚胎发展到中期时，其过渡型上皮的比例已超过50%；而在胚胎进一步发展到晚期时，过渡型上皮则进一步向复层鳞状上皮转变。例如，在已充分发育的347mm胚胎鼻咽中，后壁粘膜上皮中复层鳞状上皮的比例已高达(82±9)%。
我们把后壁粘膜上皮PCNA标记指数的变化过程与上皮发生类型转化的时期作一比较，便可知道上皮类型发生活跃转化的时期正好与其PCNA标记指数的两个高峰期形成对应关系。
图10 成人鼻咽不同部位上皮之间的PCNA表达比较
Fig.10 Comparison of PCNA expression in epithelium among
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different region walls of adult nasopharynx.
3.成年人鼻咽上皮PCNA表达随鼻咽部位置的变化特点
在了解了人胚鼻咽上皮PCNA表达的变化特点之后，我们进一步对成年人鼻咽各个壁粘膜上皮的PCNA表达状况进行了比较研究，结果如图10所示。与人胚鼻咽上皮一样，成年人鼻咽上皮的PCNA表达也具有鼻咽部的位置差异性，鼻咽不同壁的粘膜上皮在PCNA标记指数上存在着显著差异。其中底壁粘膜上皮的PCNA标记指数在5个壁中是最低的；左右两侧壁粘膜上皮的PCNA标记指数基本一致，无统计学差异(P>0.05)，两者均显著高于底壁而低于顶壁。这些特点与人胚鼻咽上皮是一致的。然而，成人鼻咽上皮的PCNA表达状况与人胚鼻咽上皮之间也存在着差异，主要表现在所研究的年龄段中，不同年龄不同性别的鼻咽标本之间，鼻咽各部分粘膜上皮PCNA标记指标的相对高低是一致的，都表现为顶壁>侧壁>后壁>底壁。成年人鼻咽顶壁的PCNA标记指数在鼻咽5个壁中是最高的。
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讨 论
PCNA是一个细胞周期相关的36kD酸性核蛋白，在进化上高度保守，广泛存在于高等真核生物细胞之中，作为DNA聚合酶δ的一个辅助因子发挥作用，为DNA复制起始所必需。PCNA在细胞周期中有两种存在形式，其一是位于核基质中的PCNA，相当于低水平地存在于静止期细胞之中的那部分PCNA，能被有机溶剂抽提，因此不存在于经有机溶剂固定后的标本之中；其二是与染色质上的DNA复制位点相结合的PCNA，只存在于处于分裂周期的细胞之中，不能被有机溶剂提取。目前已有多种针对PCNA的单克隆抗体，包括19A2、19F4以及PC-10等，其中PC-10由于可以很方便地直接应用于甲醛固定的石蜡包埋标本，无须进行抗原修复，因而受到更多的关注。有研究表明，在正常的增殖组织细胞以及多数肿瘤组织细胞中，PC-10免疫染色反应与其他的细胞增殖指标如3H-TdR脉冲标记、溴脱氧尿苷标记以及Ki-67免疫染色反应之间具有很好的相关性[3，4]。我们把上皮层作为整体来考虑，以上皮区域内PC-10阳性反应细胞的百分数作为PCNA标记指数，研究了鼻咽上皮细胞群体增殖活性的变化过程。
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从我们的研究结果来看，无论是在胚胎期还是在成年期，鼻咽不同部位粘膜上皮在PCNA标记指数上都存在着显著差异，这实际上反映了鼻咽不同部位粘膜上皮在上皮细胞群体增殖活性上的差异。如何解释这种因鼻咽上皮所处鼻咽部位置的不同而造成的细胞群体增殖活性上的差异呢?众所周知，细胞的发育分化过程是受到细胞自身的基因表达特性及其与周围环境的相互作用过程所调控的。上皮生长于间质之上，发育的时空差异可能使鼻咽不同部位的粘膜上皮产生基因表达上的差异，影响间质的结构与组成，鼻咽上皮间质内淋巴细胞的大量聚集与不均匀分布可能就是这种作用过程的反映。另一方面，间质结构与组成的变化又反过来作用于上皮的发育分化过程，影响其形态发生与基因表达特性[5，6]。就人鼻咽上皮而言，鼻咽粘膜间质内含有大量的淋巴细胞，而且其分布很不均匀，在鼻咽顶、鼻咽顶与后壁交界处以及后侧壁上可见大量的淋巴细胞聚集成咽扁桃体，在鼻咽顶和两侧壁粘膜上皮内常可见大量淋巴细胞侵入(并非炎症反应)，而在鼻咽底壁则很少见到淋巴组织。因此，鼻咽不同部位的粘膜上皮实际上是处在不同的间质环境之中，也就不难理解它们在生长分化的差异了。另一方面，在成年人鼻咽中也有可能由于呼吸气流冲击的作用而使鼻咽不同部位的粘膜上皮具有不同的上皮更新速度，更新速度快的上皮增殖活性高，而更新速度慢的上皮则增殖活性低。
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谢志光等[1]根据大量的临床观察，发现原发性鼻咽癌的发生具有明显的鼻咽部位置差异性，顶壁是原发性鼻咽癌最常见的部位，其次为侧壁。祝家镇[2]在鼻咽粘膜上皮鳞状化生的研究中，发现鼻咽粘膜上皮鳞状化生是鼻咽癌重要癌前病变特征之一，其好发部位正好与鼻咽癌的好发部位一致，从我们对成年人鼻咽上皮PCNA表达的研究结果来看，鼻咽上皮细胞群体增殖活性以鼻咽顶壁为最高，其次为侧壁，与原发性鼻咽癌的好发部位以及鼻咽粘膜上皮鳞状化生的好发部位惊人地相似。这证实了我们的推测，鼻咽部的顶壁和侧壁粘膜上皮在上皮细胞群体增殖活性上确实有其特殊性。那么，这种细胞增殖活性上的差异与鼻咽癌易感性又有什么关系呢?众所周知，癌最基本的特征之一就是细胞分裂失控，任何致癌因子的致癌效应只有通过细胞分裂才能固定和传递下去并最终实现恶性转化。也就是说，致癌因子只能对有分裂能力的细胞发挥作用，因此，细胞增殖活性高的部位也就是最容易受到致癌因子作用的部位。所以，在间质成分以及其他因素的综合作用下，鼻咽部具有高的上皮细胞群体增殖活性的顶壁与侧壁粘膜上皮可能成为鼻咽癌的易感部位。
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Kanagasuntheram等[7]的研究表明，人鼻咽粘膜的上皮类型转化现象实际上早在胚胎时期就已发生，我们对人胚鼻咽上皮的研究证实了他们的结果，并进一步发现这种人胚鼻咽上皮的类型转化主要发生在后壁粘膜。从CRL105mm的胚胎到CRL347mm已充分发育的胚胎，鼻咽后壁粘膜上皮发生两次显著的上皮类型转化，从最早的全为假复层纤毛柱状上皮发展到以过渡型上皮为主，然后进一步发展到复层鳞状上皮占绝对优势(达到82%)。伴随着这种上皮类型的转化过程，PCNA的表达也发生相应的变化，出现两个表达高峰时期。从PCNA细胞的分布状况来看，在人胚鼻咽上皮发生类型转化的早期，PCNA细胞主要分布于上皮的基底细胞层，说明这种上皮类型的自然转化过程是从上皮的基底层干细胞向上逐渐发展的。这也与我们所观察到的鼻咽上皮类型转化只从假复层纤毛柱状上皮→过渡型上皮→复层鳞状上皮单向发生的事实相吻合。因为上皮是从基底层细胞发育分化而来，所以只有源自基底层细胞的转化才是最稳定的转化。鼻咽的上皮类型转化现象从胚胎期一直到成年期都有发生，伴随着上皮类型转化而发生的上皮增殖与分化特性的改变可能大大增加鼻咽上皮对致癌物质的敏感性。因此，对鼻咽的上皮类型转化现象进行广泛的综合研究，尤其是探讨鼻咽上皮的基因表达特性对进一步阐明鼻咽癌的发病机理可能具有十分重要的意义。目前，我们正在利用mRNA差异展示法对鼻咽上皮的基因表达特性进行比较研究，有关结果将在后续文章中继续报道。
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图1～8 人鼻咽上皮抗PCNA单克隆抗体(PC-10)免疫组织化学染色
图1～4 人胚鼻咽上皮。1.底壁 2.侧壁 3.顶鼻 4.后壁 ×500
图5～8 成人鼻咽上皮。5.底壁 6.侧壁 7.顶鼻 4.后壁 ×200
Fig.1～8 Immunohistochemical staining of human nasopharyngeal epithelium with a monoclonal antibody against PCNA(PC-10)
Fig.1～4 Human fetal nasopharyngeal epithelium:1.Floor 2.Lateral walls 3.Roof 4.Posterior wall ×500
, 百拇医药 Fig.5～8 Adult nasopharyngeal epithelium:5.Floor 6.Lateral walls 7.Roof 8.Posterior wall ×200
* 国家自然科学基金重点资助课题(No.39730200)和美国中华医学基金会基金资助课题(No.96-655)
△ Cancer Research Institute,Human Medical University,Changsha 410078,China
参考文献
[1]Hsieh CK,Li CC,Min HC,et al.Clinical analysis of 1 000 cases of nasopharyngeal carcinoma.Chin Med J,1965,84(12):767
, http://www.100md.com
[2]祝家镇.鼻咽粘膜上皮鳞状化生及其与鼻咽癌的关系.中华病理学杂志，1966，10(2)：93
[3]Hall PA,Levison DA,Woods AL,et al.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)immunolocalization in paraffin sections:an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms J Pathol,1990,162(2):285
[4]Carmen CW,Yu M,Isabel F.Update on proliferation-associated antibodies applicable to formalin-fixed paraffin-embedded tissue and their clinical applications.Histochem J,1993,25(5):843
, 百拇医药
[5]Yasugi S.Role of epithelial-Mesenchymal interactions in differentiation of epithelium of vertebrate digestive organs.Develop Growth and Differ,1993,35(1):1
[6]Suematsu N,Mizuno T.Analysis of epithelial protein profiles of prostatic glands induced heterotypically in the bladder epithelium of the rat.Develop Growth and Differ,1991,33(4):379
[7]Kanagasuntheram R,Ramsbotham M.Development of the human nasopharyngeal epithelium.Acta Anat,1968,70(1):1
收稿1997-11 修回1998-04, 百拇医药
单位：黎众魁 姚开泰 王磊(湖南医科大学肿瘤研究所，长沙 410078)
关键词：增殖细胞核抗原；图像分析；免疫组织化学；人鼻咽上皮
解剖学报990111
【摘要】 目的 探讨鼻咽部肿瘤发生位置差异性的机理。 方法 应用免疫组织化学与图像分析技术对人鼻咽粘膜上皮增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达状况进行了比较研究。 结果 鼻咽上皮的PCNA标记指数以及PCNA阳性细胞的分布状况均随发育时期及其所处鼻咽部位置的不同而变化，成人鼻咽的顶壁和侧壁粘膜上皮具有相对较高的PCNA标记指数，与人鼻咽癌的易感部位正好形成对应关系。 结论 鼻咽部不同部位的粘膜上皮在上皮细胞群体增殖活性上存在着差异，鼻咽部肿瘤发生的位置易感性很可能与其上皮细胞群体增殖活性的差异有关。
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COMPARATIVE STUDIES OF PCNA EXPRESSION AMONG MUCOSAL
EPITHELIA IN DIFFERENT REGIONS OF HUMAN NASOPHARYNX
Li Zhougkui△，Yao Kaitai，Wang Lei
(Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha)
【Abstract】 Objective To research the mechanism of region differences in nasopharyngeal neoplasm development.Methods The state of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) expression in the human nasopharyngeal mucosal epithelium was investigated by means of immunohistochemical method and image analysis technique.Results The PCNA labeling index of the nasopharyngeal epithelium and the distribution of PCNA positive cells in the nasopharyngeal epithelium changed with the stages of development and the sites of the nasopharynx,and that the PCNA labeling index of the mucosal epithelia of the roof and lateral walls in the adult nasopharynx was comparatively higher than that of the others,which was consistent with the susceptible sites of nasopharyngeal carcinoma.Conclusions It suggested that the proliferating activity of epithelial cell populations among the different regions of human nasopharynx was different,and that the site susceptivity of nasopharyngeal neoplasm development might be related to the difference of the proliferating activity of epithelial cell populations.
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【Key words】 PCNA; Image analysis; Immunohistochemistry;Human nasopharyngeal epithelium
人类鼻咽癌的发生不仅具有明显的种族性和地域性，而且还具有鼻咽部的位置差异性。原发性鼻咽癌最常见于鼻咽部的顶壁和侧壁[1]，而鼻咽上皮鳞状化生的好发部位也正好处于鼻咽部的顶壁和侧壁[2]。这是否反映了鼻咽部的顶壁和侧壁粘膜上皮本身具有某种不同于其他部位的特殊性呢?从细胞生物学的角度来看，癌实质上是一种细胞分裂与分化异常的“细胞性”疾病，只有具有分裂能力的干细胞才能发生肿瘤性转变；另一方面，致癌因子的致癌效应只有通过细胞分裂才能固定下来，因而发生活跃细胞增殖的部位也是对致癌因子最敏感的部位。所以，鼻咽部顶壁和侧壁粘膜上皮易发鼻咽癌的倾向性有可能是该处上皮细胞群体增殖活性相对较高的反映。基于这一推测，我们应用单克隆抗体免疫组织化学方法对鼻咽不同部位粘膜上皮增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达状况进行了较为系统的比较研究，得到了有意义的结果，现报道如下。
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材料和方法
1.组织来源及其处理
7例正常成人鼻咽标本取自突发性死亡病例，年龄25～50周岁，男女性别比为4∶3。15例胚胎鼻咽标本取自因故引产胚胎[顶臀长(crown-rump length,CRL)>100mm]，胚胎性别不拘。鼻咽标本沿纵向分割为顶、后、左侧、右侧、底壁5个区域，每1个区域又被横切分割为3等分，在10%中性缓冲福尔马林中固定12h，作定向石蜡包埋。切片(5μm)附贴于经3-aminopropyltriethoxysilane(APES)处理的玻片上，空气干燥过夜。
2. 抗体
PCNA免疫组织化学用鼠抗人PCNA单克隆抗体PC-10(IgG2a,DAKO)进行，该抗体可直接应用于甲醛固定的石蜡包埋标本。
3. 免疫组织化学
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切片经常规脱蜡、复水至蒸馏水，以3%H2O2溶液于室温处理5min以灭活内源性的过氧化物酶。蒸馏水洗后用标记链菌素-抗生物素系统(labelled streptavidin biotin,LSAB；DAKO公司产品)进行免疫染色。试验了各种不同稀释度一抗(PC-10)的反应效果，发现以1∶1 000稀释在4℃孵育过夜的效果最佳。Ni-DAB-H2O2为显色系统，核固红衬染。PCNA阳性核呈紫蓝至紫黑色。用TBS代替PC-10作阴性对照。
4.图像分析
在石蜡切片标本上用PC-10进行的免疫染色通常呈颗粒状，小部分呈弥散状，几乎完全局限于增殖细胞群体的核内，核着色深浅不一。本研究将所有核染色都看作阳性反应，而不管其染色反应的特征。用真彩色通用医学图像处理分析系统(TIPAS-98)对免疫染色结果进行图像处理和分析。在高倍镜(×400)下对每张切片各随机抽取10个视野，测量上皮区域内PCNA阳性细胞核所占的百分比。对每个鼻咽标本每个壁的3个横切等分段各取3张间隔50μm的连续切片进行分析，这样每个壁共计分析9张切片即90个视野，计算出每个鼻咽标本各个区域粘膜上皮的PCNA阳性细胞平均百分数(即PCNA标记指数)，以此来衡量鼻咽不同部位粘膜上皮的PCNA表达水平。用万道软件《统计设计与分析系统(SDAS)》对结果进行数据处理和统计分析。
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结 果
1.PCNA阳性细胞在鼻咽上皮中的整体分布特点
我们仔细研究了PCNA阳性细胞(以下简称为PCNA细胞)在人鼻咽上皮中的整体分布状态，发现其与胚胎发育进程密切相关。在CRL为105～162mm胚胎的鼻咽上皮中，高达87%的PCNA细胞分布于基底细胞层；在CRL长为175～234mm胚胎的鼻咽上皮中，PCNA细胞的分布没有明显的上皮层次差异；而在CRL长为253～347mm胚胎的鼻咽上皮中，有90%的PCNA细胞分布于下2/3到1/3的上皮层区域内，其基底细胞层的PCNA细胞较前两个时期有所下降，但仍比成年人鼻咽上皮中基底细胞区域内的PCNA细胞要多得多。在发生上皮类型转化的区域内，PCNA细胞主要分布于基底细胞层，而且其基底细胞层中PCNA细胞的比例(约80%)明显高于同一胚胎鼻咽的非转化上皮区的基底细胞层(约40%)。成人鼻咽上皮的PCNA细胞有92%分布于下1/5到1/6的上皮层中，其基底细胞层的PCNA细胞很少见，通常不到10%(图1～8)。
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图9 人胚鼻咽上皮在不同发育时期以及不同部位之间的PCNA表达比较
Fig.9 Comparison of PCNA expression in epithelium among different region walls of human fetal nasopharynx at different stages of development.
2. 胚胎鼻咽上皮的PCNA表达随胚胎发育进程与鼻咽部位置而变化
我们根据鼻咽上皮的发育分化与PCNA细胞整体分布状态的变化特点，将所有研究的胚胎按CRL的不同划分为早期(CRL105～162mm)、中期(CRL175～234mm)及晚期(CRL253～347mm)3个时期进行统计分析，结果如图9所示。鼻咽上皮的PCNA整体表达水平是随发育进程及其所处鼻咽部位置的不同而变化的。在鼻咽的底壁、两侧壁以及顶壁粘膜上皮，PCNA标记指数均随CRL的增加而下降。在所有3个时期，鼻咽底壁粘膜上皮的PCNA标记指数都是5个壁中最低的，两侧壁粘膜上皮的PCNA标记指数基本一致，无统计学差异(P>0.05)，两者均显著高于底壁而低于顶壁。鼻咽后壁粘膜上皮的PCNA标记指数随发育进程的变化过程与其余4个壁的变化显著不同：在早期的胚胎鼻咽中，其PCNA标纪指数在5个壁中是最高的；在中期的胚胎鼻咽中，其PCNA标记指数显著低于顶壁(P<0.001)而高于两侧壁(P<0.01)；而在晚期的胚胎鼻咽中，其PCNA标记指数又上升为5个壁中最高的。
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进一步的研究表明，胚胎鼻咽后壁粘膜上皮PCNA标记指数的变化过程与上皮发生类型转化密切相关。在早期胚胎鼻咽的后壁粘膜上皮中，假复层纤毛柱状上皮大量转变为过渡型上皮；当胚胎发展到中期时，其过渡型上皮的比例已超过50%；而在胚胎进一步发展到晚期时，过渡型上皮则进一步向复层鳞状上皮转变。例如，在已充分发育的347mm胚胎鼻咽中，后壁粘膜上皮中复层鳞状上皮的比例已高达(82±9)%。
我们把后壁粘膜上皮PCNA标记指数的变化过程与上皮发生类型转化的时期作一比较，便可知道上皮类型发生活跃转化的时期正好与其PCNA标记指数的两个高峰期形成对应关系。
图10 成人鼻咽不同部位上皮之间的PCNA表达比较
Fig.10 Comparison of PCNA expression in epithelium among
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different region walls of adult nasopharynx.
3.成年人鼻咽上皮PCNA表达随鼻咽部位置的变化特点
在了解了人胚鼻咽上皮PCNA表达的变化特点之后，我们进一步对成年人鼻咽各个壁粘膜上皮的PCNA表达状况进行了比较研究，结果如图10所示。与人胚鼻咽上皮一样，成年人鼻咽上皮的PCNA表达也具有鼻咽部的位置差异性，鼻咽不同壁的粘膜上皮在PCNA标记指数上存在着显著差异。其中底壁粘膜上皮的PCNA标记指数在5个壁中是最低的；左右两侧壁粘膜上皮的PCNA标记指数基本一致，无统计学差异(P>0.05)，两者均显著高于底壁而低于顶壁。这些特点与人胚鼻咽上皮是一致的。然而，成人鼻咽上皮的PCNA表达状况与人胚鼻咽上皮之间也存在着差异，主要表现在所研究的年龄段中，不同年龄不同性别的鼻咽标本之间，鼻咽各部分粘膜上皮PCNA标记指标的相对高低是一致的，都表现为顶壁>侧壁>后壁>底壁。成年人鼻咽顶壁的PCNA标记指数在鼻咽5个壁中是最高的。
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讨 论
PCNA是一个细胞周期相关的36kD酸性核蛋白，在进化上高度保守，广泛存在于高等真核生物细胞之中，作为DNA聚合酶δ的一个辅助因子发挥作用，为DNA复制起始所必需。PCNA在细胞周期中有两种存在形式，其一是位于核基质中的PCNA，相当于低水平地存在于静止期细胞之中的那部分PCNA，能被有机溶剂抽提，因此不存在于经有机溶剂固定后的标本之中；其二是与染色质上的DNA复制位点相结合的PCNA，只存在于处于分裂周期的细胞之中，不能被有机溶剂提取。目前已有多种针对PCNA的单克隆抗体，包括19A2、19F4以及PC-10等，其中PC-10由于可以很方便地直接应用于甲醛固定的石蜡包埋标本，无须进行抗原修复，因而受到更多的关注。有研究表明，在正常的增殖组织细胞以及多数肿瘤组织细胞中，PC-10免疫染色反应与其他的细胞增殖指标如3H-TdR脉冲标记、溴脱氧尿苷标记以及Ki-67免疫染色反应之间具有很好的相关性[3，4]。我们把上皮层作为整体来考虑，以上皮区域内PC-10阳性反应细胞的百分数作为PCNA标记指数，研究了鼻咽上皮细胞群体增殖活性的变化过程。
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从我们的研究结果来看，无论是在胚胎期还是在成年期，鼻咽不同部位粘膜上皮在PCNA标记指数上都存在着显著差异，这实际上反映了鼻咽不同部位粘膜上皮在上皮细胞群体增殖活性上的差异。如何解释这种因鼻咽上皮所处鼻咽部位置的不同而造成的细胞群体增殖活性上的差异呢?众所周知，细胞的发育分化过程是受到细胞自身的基因表达特性及其与周围环境的相互作用过程所调控的。上皮生长于间质之上，发育的时空差异可能使鼻咽不同部位的粘膜上皮产生基因表达上的差异，影响间质的结构与组成，鼻咽上皮间质内淋巴细胞的大量聚集与不均匀分布可能就是这种作用过程的反映。另一方面，间质结构与组成的变化又反过来作用于上皮的发育分化过程，影响其形态发生与基因表达特性[5，6]。就人鼻咽上皮而言，鼻咽粘膜间质内含有大量的淋巴细胞，而且其分布很不均匀，在鼻咽顶、鼻咽顶与后壁交界处以及后侧壁上可见大量的淋巴细胞聚集成咽扁桃体，在鼻咽顶和两侧壁粘膜上皮内常可见大量淋巴细胞侵入(并非炎症反应)，而在鼻咽底壁则很少见到淋巴组织。因此，鼻咽不同部位的粘膜上皮实际上是处在不同的间质环境之中，也就不难理解它们在生长分化的差异了。另一方面，在成年人鼻咽中也有可能由于呼吸气流冲击的作用而使鼻咽不同部位的粘膜上皮具有不同的上皮更新速度，更新速度快的上皮增殖活性高，而更新速度慢的上皮则增殖活性低。
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谢志光等[1]根据大量的临床观察，发现原发性鼻咽癌的发生具有明显的鼻咽部位置差异性，顶壁是原发性鼻咽癌最常见的部位，其次为侧壁。祝家镇[2]在鼻咽粘膜上皮鳞状化生的研究中，发现鼻咽粘膜上皮鳞状化生是鼻咽癌重要癌前病变特征之一，其好发部位正好与鼻咽癌的好发部位一致，从我们对成年人鼻咽上皮PCNA表达的研究结果来看，鼻咽上皮细胞群体增殖活性以鼻咽顶壁为最高，其次为侧壁，与原发性鼻咽癌的好发部位以及鼻咽粘膜上皮鳞状化生的好发部位惊人地相似。这证实了我们的推测，鼻咽部的顶壁和侧壁粘膜上皮在上皮细胞群体增殖活性上确实有其特殊性。那么，这种细胞增殖活性上的差异与鼻咽癌易感性又有什么关系呢?众所周知，癌最基本的特征之一就是细胞分裂失控，任何致癌因子的致癌效应只有通过细胞分裂才能固定和传递下去并最终实现恶性转化。也就是说，致癌因子只能对有分裂能力的细胞发挥作用，因此，细胞增殖活性高的部位也就是最容易受到致癌因子作用的部位。所以，在间质成分以及其他因素的综合作用下，鼻咽部具有高的上皮细胞群体增殖活性的顶壁与侧壁粘膜上皮可能成为鼻咽癌的易感部位。
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Kanagasuntheram等[7]的研究表明，人鼻咽粘膜的上皮类型转化现象实际上早在胚胎时期就已发生，我们对人胚鼻咽上皮的研究证实了他们的结果，并进一步发现这种人胚鼻咽上皮的类型转化主要发生在后壁粘膜。从CRL105mm的胚胎到CRL347mm已充分发育的胚胎，鼻咽后壁粘膜上皮发生两次显著的上皮类型转化，从最早的全为假复层纤毛柱状上皮发展到以过渡型上皮为主，然后进一步发展到复层鳞状上皮占绝对优势(达到82%)。伴随着这种上皮类型的转化过程，PCNA的表达也发生相应的变化，出现两个表达高峰时期。从PCNA细胞的分布状况来看，在人胚鼻咽上皮发生类型转化的早期，PCNA细胞主要分布于上皮的基底细胞层，说明这种上皮类型的自然转化过程是从上皮的基底层干细胞向上逐渐发展的。这也与我们所观察到的鼻咽上皮类型转化只从假复层纤毛柱状上皮→过渡型上皮→复层鳞状上皮单向发生的事实相吻合。因为上皮是从基底层细胞发育分化而来，所以只有源自基底层细胞的转化才是最稳定的转化。鼻咽的上皮类型转化现象从胚胎期一直到成年期都有发生，伴随着上皮类型转化而发生的上皮增殖与分化特性的改变可能大大增加鼻咽上皮对致癌物质的敏感性。因此，对鼻咽的上皮类型转化现象进行广泛的综合研究，尤其是探讨鼻咽上皮的基因表达特性对进一步阐明鼻咽癌的发病机理可能具有十分重要的意义。目前，我们正在利用mRNA差异展示法对鼻咽上皮的基因表达特性进行比较研究，有关结果将在后续文章中继续报道。
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图1～8 人鼻咽上皮抗PCNA单克隆抗体(PC-10)免疫组织化学染色
图1～4 人胚鼻咽上皮。1.底壁 2.侧壁 3.顶鼻 4.后壁 ×500
图5～8 成人鼻咽上皮。5.底壁 6.侧壁 7.顶鼻 4.后壁 ×200
Fig.1～8 Immunohistochemical staining of human nasopharyngeal epithelium with a monoclonal antibody against PCNA(PC-10)
Fig.1～4 Human fetal nasopharyngeal epithelium:1.Floor 2.Lateral walls 3.Roof 4.Posterior wall ×500
, 百拇医药 Fig.5～8 Adult nasopharyngeal epithelium:5.Floor 6.Lateral walls 7.Roof 8.Posterior wall ×200
* 国家自然科学基金重点资助课题(No.39730200)和美国中华医学基金会基金资助课题(No.96-655)
△ Cancer Research Institute,Human Medical University,Changsha 410078,China
参考文献
[1]Hsieh CK,Li CC,Min HC,et al.Clinical analysis of 1 000 cases of nasopharyngeal carcinoma.Chin Med J,1965,84(12):767
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[2]祝家镇.鼻咽粘膜上皮鳞状化生及其与鼻咽癌的关系.中华病理学杂志，1966，10(2)：93
[3]Hall PA,Levison DA,Woods AL,et al.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)immunolocalization in paraffin sections:an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms J Pathol,1990,162(2):285
[4]Carmen CW,Yu M,Isabel F.Update on proliferation-associated antibodies applicable to formalin-fixed paraffin-embedded tissue and their clinical applications.Histochem J,1993,25(5):843
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[5]Yasugi S.Role of epithelial-Mesenchymal interactions in differentiation of epithelium of vertebrate digestive organs.Develop Growth and Differ,1993,35(1):1
[6]Suematsu N,Mizuno T.Analysis of epithelial protein profiles of prostatic glands induced heterotypically in the bladder epithelium of the rat.Develop Growth and Differ,1991,33(4):379
[7]Kanagasuntheram R,Ramsbotham M.Development of the human nasopharyngeal epithelium.Acta Anat,1968,70(1):1
收稿1997-11 修回1998-04, 百拇医药