烫伤大鼠室旁核和触液神经元中胆囊收缩素的变化
作者：李泽桂 陆振山 方一心 蔡文琴 欧可群
单位：李泽桂 蔡文琴 第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400038；陆振山 方一心 欧可群 华西医科大学，成都
关键词：烫伤；应激；胆囊收缩素；室旁核；触液神经元
解剖学报990104
【摘要】 目的 明确胆囊收缩素在烫伤应激中的确切作用。 方法 在大鼠清醒状态下给予标准的25%Ⅲ度皮肤烫伤，伤后24h杀动物，用免疫细胞化学ABC法显示PVN和CSF-CNs的CCK阳性神经元，结果用显微图像分析技术处理。 结果 (1)烫伤大鼠PVN代表平面CCK神经元的总面积增大，免疫染色无明显变化。(2)正中隆起(medin eminence,ME)的CCK免疫染色阳性纤维的面积密度无显著性差异而免疫染色减弱。(3)烫伤大鼠第三脑室室管膜内CCK免疫染色阳性的CSF-CNs数量、面积和免疫染色强度均高于对照组。 结论 烫伤应激使CCK在胞体的合成和末梢的释放均增加。烫伤后大量CSF-CNs的出现为CCK释放入脑脊液提供了一条新的途径。CCK可能通过脑脊液循环来调节控制垂体的肽能神经元活性以参与对烫伤应激的调节。
, 百拇医药
CHANGES OF CHOLECYSTOKININ IN THE PARAVENTRICULAR
NUCLEUS AND CEREBROSPINAL FLUID-CONTACTING
NEURONS AFTER SCALDING IN RAT
Li Zegui△，Lu Zhenshan*, Fang Yixin*，Cai Wenqin，Ou Kequn*
(Department of Histology and Embryology,The Third Military Medical University,Chongqing;
*West China University of Medical Science,Chengdu)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective The cholecystokinin (CCK) plays an important role in regulating various stress.The paraventriclar nucleus (PVN) and cerebrospinal fluid-contacting neurons(CSF-CNs),which may participate in the responding to scaled,contain some CCK.There have been hints that CCK is involved in scalding stress.The aim of the present study is to examine the role of CCK which is in the PVN and CSF-CNs during scalding stress.Methods Adult male Wistar rats were given a standard scald on 25% of the body surface or only a sham.They were sacrificed at the 24th hours after scald.The results were showed with ABC immunocytochemical method and examined with microscopic image analyse system at the light microscope level.Results It showed that there were some changes of CCK in the PVN and CSF-CNs.However there was no difference of the immunostaining intensity in PVN and no difference of area density in medin eminence (ME) between the burnt and the sham rats,the areas of CCK-positive neurons in PVN are larger and the CCK immunostaining intensity of the neurites in ME was lighter in burnt rats than that in control.In ependyma of the third ventricle the number,sectinal areas,and immunostaining intensity of CCK-positive CSF-CNs were more,larger,and heavier than that of the control respectively.Conclusion These implied that CCK synthesis in somas of the PVN and the releasing in terminals of the ME during scalding stress were increased.The emergence of CCK-containing CSF-CNs might provide their secretory products a new pathway to cerebrospinal fluid (CSF) after scald and the CCK,through the CSF pathway,might involve scald stress by modulating the metabolism and activity of the adjacent peptidergic system controlling the pituitary.
, 百拇医药
【Key words】 Scald;Stress;Cholecystokinin(CCK);Paraventricular nucleus(PVN);Cerebrospinal fluid-contacting neuron(CSF-CNS)
胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)是中枢神经系统含量最高的神经肽之一，广泛分布于大脑皮层、海马、杏仁核和丘脑下部，主要以硫化CCK-8的形式存在。已有文献报道，CCK参与多种应激反应[1，2]。较大面积的皮肤烫伤使机体进入严重的损伤性应激状态，发现丘脑下部对此反应十分强烈[3，4]，表现为烫伤后某些神经肽含量发生变化。但对丘脑下部室旁核(paraventricular nucleus,PVN)中CCK神经元是否参与烫伤应激反应鲜见文献报道。
此外，在人和其他哺乳动物脑内存在接触脑脊液的神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF-CNs)，尤以第三脑室较多见[5]。Scott[6]用扫描电镜技术观察到大鼠60%皮肤烫伤后其第三脑室壁较之对照组附着更多的CSF-CNs,并用免疫组织化学证实这些CSF-CNs含酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase)。近来有文献报道大鼠CSF-CNs中还含有CCK。鉴于CSF-CNs处于脑组织和脑脊液之间的特殊位置，参与了正常情况下脑-脑脊液神经体液回路的调节[7]，是维持神经元微环境稳定不可缺少的成分。因此有理由认为含CCK的CSF-CNs也可能参与烫伤应激反应。为此，本实验用免疫细胞化学和显微图像分析技术研究烫伤大鼠PVN和第三脑室室管膜内CSF-CNs中CCK含量的变化，旨在探讨PVN中CCK是否参与烫伤应激反应，并为CSF-CNs在应激状态下如何平衡脑-脑脊液神经体液回路提供形态学依据。
, 百拇医药
材料和方法
1.动物与分组
成年雄性Wistar大鼠20只，按随机配对的原则分为4组。第1组于伤后24h经侧脑室按1mg/kg注入秋水仙素，用于观察PVN和第三脑室室管膜内的CCK阳性细胞；第3组不经秋水仙素处理，用于观察ME的CCK阳性纤维。第2、4组分别为第1、3组的对照组。动物模型制备按第三军医大学烧伤研究所提供的方法进行，即将实验组动物于清醒状态下捆绑固定，背部剃毛后浸入95℃恒温水浴锅15s，造成25%Ⅲ度皮肤烫伤，致伤时间均在上午10～12时进行，对照组动物捆绑固定剃毛后用温水浸泡背部。伤后24h取材(秋水仙素处理组于注射后12h取材)。
2.试剂
兔抗CCK血清购自美国Immune Nuclear公司，工作浓度1∶3 500；生物素化的羊抗兔IgG购自美国Vector公司，工作浓度1∶200；ABC复合物购自美国Vector公司，工作浓度1∶100。
, 百拇医药
3.免疫组织化学程序
动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉，经左心室插管至升主动脉，生理盐水冲洗血管，Zambonis液灌注固定。6h后剥脑修块，入相同固定液于4℃后固定6～8h，AO恒冷箱切片机切片，片厚30μm。经PBS洗涤后入兔抗CCK血清于37℃孵育2.5h，转4℃ 33h。然后进二抗37℃孵育2h，入ABC复合物37℃孵育1h。最后于新鲜配制的DAB-H2O2内显色。以上各步骤间均以PBS充分漂洗。
4.免疫组织化学对照实验
4.1 替代实验：用正常兔血清代替一抗孵育切片。
4.2 空白对照：用PBS代替一抗孵育切片。
5.显微图像分析和统计学处理
, 百拇医药
用显微图像分析仪(MIAS-200)检测，每只动物每一部位从前往后测5张切片，面积用象点数表示，免疫反应强度用灰度值表示。检测指标为：(1)PVN内CCK阳性细胞的平均总面积(PVN内阳性细胞面积之和)和平均灰度；(2)ME内CCK阳性纤维的平均密度(CCK纤维面积/ME总面积)和平均灰度；(3)接触脑脊液的神经元只计数胞体位于第三脑室室管膜上皮之间的CCK阳性细胞，检测其切面面积和灰度。PVN面积和灰度、ME面积密度和灰度用配对计量资料比较的t检验分析；室管膜CCK细胞的面积和灰度用等级资料的两样本比较的秩和检验分析。
结 果
1.CCK免疫反应阳性神经元在PVN的分布及在烫伤应激中的变化
PVN各亚区的划分参照Swanson[8]和Armstrong[9]报道的方法。观察到CCK存在于PVN大小两型细胞，大细胞CCK神经元主要分布于内侧大细胞亚部(medial magnocellular subdivision,mm)和外侧大细胞亚部(lateral magnocellular subdivision,lm)(图1)，在lm尾部排列成环状，包绕着CCK阴性的细胞(图2)。大细胞CCK多数为多极神经元，也可见少数双极神经元。小细胞CCK神经元主要分布于内侧小细胞亚部(medial parvicelluar subdivision,mp)和室周小细胞亚部(periventricular parvicellular subdivision,pv)，以双极或梭型细胞为主，亦可见多极细胞。显微图像分析结果显示见表1，烫伤大鼠PVN内CCK免疫反应性细胞的平均总面积大于对照组(图1，3)，有高度显著性差异，提示烫伤后PVN内合成的CCK增多；免疫染色强度无明显变化，提示合成的CCK又被迅速释放。
, 百拇医药
表1 PVN内CCK阳性神经元的面积和灰度比较
Table 1 Comparison of area and grey degree of CCK-positive neurons in PVN 动物数
animal
number
面积
area
灰度
grey degree
烫伤组
burned
, 百拇医药 对照组
control
烫伤组
burned
对照组
control
1
3983.0
3097.4
95.8
91.2
2
4094.6
, 百拇医药
2660.6
89.4
86.0
3
3590.8
1781.0
85.6
103.0
4
4424.4
1898.2
95.4
101.0
, 百拇医药
5
4390.6
1895.6
89.6
102.4
4096.7±152.1
2266.6±260.3
91.2±1.95
96.7±3.43
t=5.824
P<0.005
, http://www.100md.com
t=1.282
P>0.05
2.ME内CCK免疫反应性纤维的变化
观察到CCK免疫反应性纤维主要分布于ME外带，显微图像分析结果显示见表2，实验组与对照组ME内CCK阳性纤维的面积密度比较无显著性差异，但实验组动物的免疫染色强度低于对照组，提示烫伤后CCK在ME外带的释放增多。
表2 ME内CCK阳性纤维的面积密度和灰度比较
Table 2 Comparison of area density and grey degree of CCK-positive neurites in ME 动物数
animal
, http://www.100md.com number
面积密度
area density
灰度
grey degree
烫伤组
burned
对照组
control
烫伤组
burned
对照组
control
, 百拇医药
1
0.3930
0.3938
90
69
2
0.4855
0.4135
74
73
3
0.5162
0.3472
, http://www.100md.com
86
58
4
0.4512
0.2921
102
70
5
0.2527
0.4141
77
62
, 百拇医药
0.4197±0.047
0.3721±0.023
85.8±4.99
66.4±2.68
t=0.784
P>0.05
t=3.61
P<0.05
3.第三脑室室管膜内含CCK的触液神经元的变化
观察到烫伤大鼠第三脑室室管膜(图5)较对照组(图4)分布着更多的CCK免疫反应性细胞，其胞体大小不一、形态各异。可见有的胞体位于室管膜上皮之间，部分与脑脊液接触(图6)；有的细胞籍突起伸入脑室腔与脑脊液接触(图7)；有的胞体位于室管膜内，突起走行于室管膜上皮之间(图8)。显微图像分析系统在实验组检测到133个细胞，在对照组检测到82个细胞。经统计学处理，实验组CCK触液神经元的切面面积高于对照组，灰度值低于对照组(表3)。
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表3 CCK阳性触液神经元面积和灰度比较
Table 3 Comparison of the sectional area and grey degree of CCK-positive CSF-CNs 切面面积
sectional
area
细胞数
cells
灰度
grey
degree
细胞数
, http://www.100md.com cells
烫伤组
burned
对照组
control
烫伤组
burned
对照组
control
<50
2
2
<30
, 百拇医药
7
10
50～
6
12
30～
23
8
70～
10
15
40～
33
16
, http://www.100md.com
90～
20
21
50～
31
21
110～
28
17
60～
20
14
130～
, 百拇医药 16
8
70～
9
10
150～
17
4
80～
8
3
170～
13
1
, http://www.100md.com
90～
2
190～
21
2
N=215
T1=16 647.5
T2=6 357.5
N=215
T1=12 495
T2=10 725
, 百拇医药 t=5.872
P<0.001
t=4.2814
P<0.001
讨 论
Kiss[10]报道，CCK阳性细胞存在于PVN大、小两类神经元。本实验观察到CCK大细胞神经元在PVN mm和lm的分布、在lm尾部形成的环状排列及小细胞CCK神经元的分布基本与Kiss的报道相符。已知分布于大细胞各亚部的CCK部分与催产素(oxytocin,OT)共存，其纤维投射至垂体后叶[11]；分布于小细胞亚部的CCK部分与促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasing factor,CRF)共存，其纤维主要投射到ME外带[10，14]。从CCK存在于PVN两类神经元的现象，提示CCK参与神经内分泌调节。而来自皮肤烫伤的传入刺激使丘脑下部控制的许多激素和神经肽的分泌发生异常，CCK作为一种重要的调质或整合肽(intergretive peptide)在其中必然发挥作用。Siegel RA[12]报道，电击足底造成大鼠应激状态，在丘脑下部背内侧区，应激后0～30min CCK量下降，30～60min不再下降；在丘脑下部腹内侧区，CCK量从应激开始一直持续下降。Siegel认为，CCK在背内侧区的先下降是由于发生了胞体运输至末梢的释放，以后趋于稳定是由于胞体开始合成以补充机体在应激状态下的需要；而在腹内侧区的持续下降是由于释放所致。但Siegel所用放射免疫法不能准确定位，观察的应激类型与本实验不同，而且仅仅观察了应激早期CCK的变化。本实验结果弥补了放射免疫法不能定位的不足，在Siegel早期观察的基础上，发现伤后24h CCK在胞体的合成和在末梢的释放仍在增加，为PVN内CCK神经元参与烫伤应激反应提供了形态学依据。
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传统观念认为，脑脊液内仅含一些无机离子、氨基酸等，对脑组织只起缓冲、保护、营养和运输代谢物质的作用。而近年研究表明，脑脊液内不仅含有神经递质和神经激素，而且还可能参与神经内分泌调节。因为在脑组织和脑脊液之间存在有参与这种调节的网络系统——CSF-CNs，它们在脑组织和脑脊液之间进行着信息交流，以维持神经元微环境的自稳。但目前对此系统在正常生理条件下的作用机制、特别是在异常情况下的变化知之甚少。本实验观察到烫伤后在第三脑室室管膜内出现大量含CCK的CSF-CNs，可能就是机体在应激状态下为达到新的平衡和自稳，将增多的CCK迅速释放入脑脊液提供的一条新途径。释放的CCK可借助脑脊液循环，调节控制垂体的室周器官肽能系统的代谢活性[6]；也可对远位靶区进行调节，完成脑-脑脊液神经体液回路[7]。本研究结果进一步更新了传统神经解剖学关于室管膜结构、脑脊液功能的概念，揭示CSF-CNs在烫伤应激条件下参与了神经和体液双重调节，为认识CSF-CNs在疾病发生、发展过程中的作用奠定了下一步的研究基础。
, 百拇医药
综合本实验结果和文献报道，我们认为在烫伤应激中PVN合成的CCK可能有3条去路：一是在ME外带释放入血，经垂体门脉系统作用于前叶细胞分泌促肾上腺皮质激素(adrenocoritcotropin hormone,ACTH)[13]；二是在垂体后叶水平调节血管加压素(vasopression,VP)和催产素(oxytocin,OT)的分泌[11，14]，而VP可调节烫伤引起的水代谢失衡，OT则可作用于肾内钠离子的分泌；三是通过CSF-CNs直接释放入脑脊液，通过脑脊液和脑组织之间的信息交流，调节控制垂体的室周肽能系统活性或作用于中枢各脑区发挥其整合调控功能。
本实验还观察到一个有趣的现象，即烫伤应激使PVN内VP、CRF和CCK均增加(见另文)的同时，却极少观察到含VP和CRF的CSF-CNs。虽然已有文献报道正常情况下CSF-CNs中亦含VP和CRF，但为什么在烫伤应激状态下经CSF-CNs释放入脑脊液的主要是CCK而不是VP或CRF?这是值得进一步研究的问题。
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图1 对照大鼠PVN内的CCK阳性细胞，ABC法(下同)×100 图2 对照大鼠PVN 1m尾部的CCK阳性细胞呈环状排列，包绕未着色的细胞×40 图3 烫伤大鼠PVN内的CCK阳性细胞×100 图4，5 大鼠第三脑室室管膜内CCK阳性的CSF-CNs，图4为对照大鼠；图5为烫伤大鼠×200 图6～8 示烫伤大鼠第三脑室室管膜内各种CCK阳性CSF-CNs，其中图7示CCK阳性CSF-CN的突起(↑)伸入第三脑室 ×400mm.内侧大细胞亚部 lm.外侧大细胞亚部 3V.第三脑室
Fig.1 The CCK-positive cells in the PVN of the control rat.ABC method (the same as follows).×100
Fig.2 The CCK-positive cells in the caudal lateral magnocellular subdivision of the the control rat,forming a ring around a zone of unstained cells.×40
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Fi.g.3 The CCK-positive cells in the PVN of the burnt rat.×100
Fig.4,5 The CCK-positive CSF-CNs in the ependyma of rat third ventricle.Fig.4:In the control rat.Fig.5:In the burnt rat.×200
Fig.6-8 Showing various CCK-positive CSF-CNs in the ependyma of the third ventricule in the burnt rat.Fig.7： showing the CCK-positive CSF-CN with a process extending into the third ventricle(↑)×400
mm:medial magnocellular;1m:lateral magnocellular;3V:the third ventricle
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△ Department of Histology and Embryology,The Third Military Medical Univeristy,Chongqing 400038,China
参考文献
[1]Harro J,Lofberg C,Rehfeld JF,et al.Cholecystokinin peptides and receptors in the rat brain during stress.Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmocol,1996,354(1):59
[2]Gue M,Tekamp A,Tabis N,et al.Cholecystokinin blockade of emotional stress and CRF-induced colonic motor alterations in rats:role of the amygdola.Brain Res,1994,658(1-2):232
, http://www.100md.com
[3]洪新如，王成海.下丘脑室旁核β内啡肽在大鼠烫伤休克中的作用.生理学报，1995，46(1)：19
[4]范溥生，何润昌，汪定涛，等.烫伤对大鼠下丘脑室旁核AVP阳性细胞的影响.解剖学杂志，1990，13(2)：106
[5]朱长庚.化学神经解剖学.上海：上海科学技术出版社，1992：84-96
[6]Scott DE,Vaughan GM,Pruitt BA.Hypothalamic neuroendocrine correlates of cutaneous burn injury in the rat:Ⅰ.Scanning electron microscopy.Brain Research Bull,1986,17(3):367
[7]朱长庚.脑-脑脊液神经体液回路.神经解剖学杂志，1988，4(1)：125
, 百拇医药
[8]Swanson LW,Kuypers HGJM.The paraventricular nucleus of the hypothalamus:Cytoarchitecture subdivisions and the organization of projections to the pituitary,dorsal vagal complex and spinal cord as demonstrated by retrograde fluorescence double-labeling method.J Comparative Neurology,1980,194(3):555
[9]Armstrong WE,Warach S,Hatton GI,et al.Subnuclei in the rat hypothalamic paraventricular nucleus:A cytoarchitectural,horseradish peroxidase and immunocytochemical analysis.Neuroscience,1980,5(11):1931
, http://www.100md.com
[10]Kiss JZ,Williams TH,Palkovits M.Distribution and projection of cholecystokinin-immunoreactive neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus of rat.J of Comparative Neurology,1984,227(2):173
[11]Meister B,Broberger C,Villar MJ,et al.Cholecystokinin B receptor gene expression in hypothalamic neurosecretory neurons after experimental manipulations.Neuroendocrinology,1994,60(5):458
[12]Sigel RA,Duker Em,Pahnke U,et al.Stress-induced changes in CCK and substance P concentrations in discrete regions of the rat hypothalamus.Neuroendocrinology,1987,46(1):75
, http://www.100md.com
[13]Reisine T,Jensen R.Cholecystokinin-8 stimulates adrenocorticotropin release from anterior pituitary cells.J Pharmocol.Exp Ther,1986,236(3):621
[14]Deschepper C,Lotstra F,Vandesande F,et al.Cholecystokinin varies in the posterior pituitary and external median eminence of the rat according to factors affecting vasopressin and oxytocin.Life Science,1983,32(22):2571
收稿1997-01 修回1998-07, http://www.100md.com
单位：李泽桂 蔡文琴 第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400038；陆振山 方一心 欧可群 华西医科大学，成都
关键词：烫伤；应激；胆囊收缩素；室旁核；触液神经元
解剖学报990104
【摘要】 目的 明确胆囊收缩素在烫伤应激中的确切作用。 方法 在大鼠清醒状态下给予标准的25%Ⅲ度皮肤烫伤，伤后24h杀动物，用免疫细胞化学ABC法显示PVN和CSF-CNs的CCK阳性神经元，结果用显微图像分析技术处理。 结果 (1)烫伤大鼠PVN代表平面CCK神经元的总面积增大，免疫染色无明显变化。(2)正中隆起(medin eminence,ME)的CCK免疫染色阳性纤维的面积密度无显著性差异而免疫染色减弱。(3)烫伤大鼠第三脑室室管膜内CCK免疫染色阳性的CSF-CNs数量、面积和免疫染色强度均高于对照组。 结论 烫伤应激使CCK在胞体的合成和末梢的释放均增加。烫伤后大量CSF-CNs的出现为CCK释放入脑脊液提供了一条新的途径。CCK可能通过脑脊液循环来调节控制垂体的肽能神经元活性以参与对烫伤应激的调节。
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CHANGES OF CHOLECYSTOKININ IN THE PARAVENTRICULAR
NUCLEUS AND CEREBROSPINAL FLUID-CONTACTING
NEURONS AFTER SCALDING IN RAT
Li Zegui△，Lu Zhenshan*, Fang Yixin*，Cai Wenqin，Ou Kequn*
(Department of Histology and Embryology,The Third Military Medical University,Chongqing;
*West China University of Medical Science,Chengdu)
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【Abstract】 Objective The cholecystokinin (CCK) plays an important role in regulating various stress.The paraventriclar nucleus (PVN) and cerebrospinal fluid-contacting neurons(CSF-CNs),which may participate in the responding to scaled,contain some CCK.There have been hints that CCK is involved in scalding stress.The aim of the present study is to examine the role of CCK which is in the PVN and CSF-CNs during scalding stress.Methods Adult male Wistar rats were given a standard scald on 25% of the body surface or only a sham.They were sacrificed at the 24th hours after scald.The results were showed with ABC immunocytochemical method and examined with microscopic image analyse system at the light microscope level.Results It showed that there were some changes of CCK in the PVN and CSF-CNs.However there was no difference of the immunostaining intensity in PVN and no difference of area density in medin eminence (ME) between the burnt and the sham rats,the areas of CCK-positive neurons in PVN are larger and the CCK immunostaining intensity of the neurites in ME was lighter in burnt rats than that in control.In ependyma of the third ventricle the number,sectinal areas,and immunostaining intensity of CCK-positive CSF-CNs were more,larger,and heavier than that of the control respectively.Conclusion These implied that CCK synthesis in somas of the PVN and the releasing in terminals of the ME during scalding stress were increased.The emergence of CCK-containing CSF-CNs might provide their secretory products a new pathway to cerebrospinal fluid (CSF) after scald and the CCK,through the CSF pathway,might involve scald stress by modulating the metabolism and activity of the adjacent peptidergic system controlling the pituitary.
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【Key words】 Scald;Stress;Cholecystokinin(CCK);Paraventricular nucleus(PVN);Cerebrospinal fluid-contacting neuron(CSF-CNS)
胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)是中枢神经系统含量最高的神经肽之一，广泛分布于大脑皮层、海马、杏仁核和丘脑下部，主要以硫化CCK-8的形式存在。已有文献报道，CCK参与多种应激反应[1，2]。较大面积的皮肤烫伤使机体进入严重的损伤性应激状态，发现丘脑下部对此反应十分强烈[3，4]，表现为烫伤后某些神经肽含量发生变化。但对丘脑下部室旁核(paraventricular nucleus,PVN)中CCK神经元是否参与烫伤应激反应鲜见文献报道。
此外，在人和其他哺乳动物脑内存在接触脑脊液的神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF-CNs)，尤以第三脑室较多见[5]。Scott[6]用扫描电镜技术观察到大鼠60%皮肤烫伤后其第三脑室壁较之对照组附着更多的CSF-CNs,并用免疫组织化学证实这些CSF-CNs含酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase)。近来有文献报道大鼠CSF-CNs中还含有CCK。鉴于CSF-CNs处于脑组织和脑脊液之间的特殊位置，参与了正常情况下脑-脑脊液神经体液回路的调节[7]，是维持神经元微环境稳定不可缺少的成分。因此有理由认为含CCK的CSF-CNs也可能参与烫伤应激反应。为此，本实验用免疫细胞化学和显微图像分析技术研究烫伤大鼠PVN和第三脑室室管膜内CSF-CNs中CCK含量的变化，旨在探讨PVN中CCK是否参与烫伤应激反应，并为CSF-CNs在应激状态下如何平衡脑-脑脊液神经体液回路提供形态学依据。
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材料和方法
1.动物与分组
成年雄性Wistar大鼠20只，按随机配对的原则分为4组。第1组于伤后24h经侧脑室按1mg/kg注入秋水仙素，用于观察PVN和第三脑室室管膜内的CCK阳性细胞；第3组不经秋水仙素处理，用于观察ME的CCK阳性纤维。第2、4组分别为第1、3组的对照组。动物模型制备按第三军医大学烧伤研究所提供的方法进行，即将实验组动物于清醒状态下捆绑固定，背部剃毛后浸入95℃恒温水浴锅15s，造成25%Ⅲ度皮肤烫伤，致伤时间均在上午10～12时进行，对照组动物捆绑固定剃毛后用温水浸泡背部。伤后24h取材(秋水仙素处理组于注射后12h取材)。
2.试剂
兔抗CCK血清购自美国Immune Nuclear公司，工作浓度1∶3 500；生物素化的羊抗兔IgG购自美国Vector公司，工作浓度1∶200；ABC复合物购自美国Vector公司，工作浓度1∶100。
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3.免疫组织化学程序
动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉，经左心室插管至升主动脉，生理盐水冲洗血管，Zambonis液灌注固定。6h后剥脑修块，入相同固定液于4℃后固定6～8h，AO恒冷箱切片机切片，片厚30μm。经PBS洗涤后入兔抗CCK血清于37℃孵育2.5h，转4℃ 33h。然后进二抗37℃孵育2h，入ABC复合物37℃孵育1h。最后于新鲜配制的DAB-H2O2内显色。以上各步骤间均以PBS充分漂洗。
4.免疫组织化学对照实验
4.1 替代实验：用正常兔血清代替一抗孵育切片。
4.2 空白对照：用PBS代替一抗孵育切片。
5.显微图像分析和统计学处理
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用显微图像分析仪(MIAS-200)检测，每只动物每一部位从前往后测5张切片，面积用象点数表示，免疫反应强度用灰度值表示。检测指标为：(1)PVN内CCK阳性细胞的平均总面积(PVN内阳性细胞面积之和)和平均灰度；(2)ME内CCK阳性纤维的平均密度(CCK纤维面积/ME总面积)和平均灰度；(3)接触脑脊液的神经元只计数胞体位于第三脑室室管膜上皮之间的CCK阳性细胞，检测其切面面积和灰度。PVN面积和灰度、ME面积密度和灰度用配对计量资料比较的t检验分析；室管膜CCK细胞的面积和灰度用等级资料的两样本比较的秩和检验分析。
结 果
1.CCK免疫反应阳性神经元在PVN的分布及在烫伤应激中的变化
PVN各亚区的划分参照Swanson[8]和Armstrong[9]报道的方法。观察到CCK存在于PVN大小两型细胞，大细胞CCK神经元主要分布于内侧大细胞亚部(medial magnocellular subdivision,mm)和外侧大细胞亚部(lateral magnocellular subdivision,lm)(图1)，在lm尾部排列成环状，包绕着CCK阴性的细胞(图2)。大细胞CCK多数为多极神经元，也可见少数双极神经元。小细胞CCK神经元主要分布于内侧小细胞亚部(medial parvicelluar subdivision,mp)和室周小细胞亚部(periventricular parvicellular subdivision,pv)，以双极或梭型细胞为主，亦可见多极细胞。显微图像分析结果显示见表1，烫伤大鼠PVN内CCK免疫反应性细胞的平均总面积大于对照组(图1，3)，有高度显著性差异，提示烫伤后PVN内合成的CCK增多；免疫染色强度无明显变化，提示合成的CCK又被迅速释放。
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表1 PVN内CCK阳性神经元的面积和灰度比较
Table 1 Comparison of area and grey degree of CCK-positive neurons in PVN 动物数
animal
number
面积
area
灰度
grey degree
烫伤组
burned
, 百拇医药 对照组
control
烫伤组
burned
对照组
control
1
3983.0
3097.4
95.8
91.2
2
4094.6
, 百拇医药
2660.6
89.4
86.0
3
3590.8
1781.0
85.6
103.0
4
4424.4
1898.2
95.4
101.0
, 百拇医药
5
4390.6
1895.6
89.6
102.4
4096.7±152.1
2266.6±260.3
91.2±1.95
96.7±3.43
t=5.824
P<0.005
, http://www.100md.com
t=1.282
P>0.05
2.ME内CCK免疫反应性纤维的变化
观察到CCK免疫反应性纤维主要分布于ME外带，显微图像分析结果显示见表2，实验组与对照组ME内CCK阳性纤维的面积密度比较无显著性差异，但实验组动物的免疫染色强度低于对照组，提示烫伤后CCK在ME外带的释放增多。
表2 ME内CCK阳性纤维的面积密度和灰度比较
Table 2 Comparison of area density and grey degree of CCK-positive neurites in ME 动物数
animal
, http://www.100md.com number
面积密度
area density
灰度
grey degree
烫伤组
burned
对照组
control
烫伤组
burned
对照组
control
, 百拇医药
1
0.3930
0.3938
90
69
2
0.4855
0.4135
74
73
3
0.5162
0.3472
, http://www.100md.com
86
58
4
0.4512
0.2921
102
70
5
0.2527
0.4141
77
62
, 百拇医药
0.4197±0.047
0.3721±0.023
85.8±4.99
66.4±2.68
t=0.784
P>0.05
t=3.61
P<0.05
3.第三脑室室管膜内含CCK的触液神经元的变化
观察到烫伤大鼠第三脑室室管膜(图5)较对照组(图4)分布着更多的CCK免疫反应性细胞，其胞体大小不一、形态各异。可见有的胞体位于室管膜上皮之间，部分与脑脊液接触(图6)；有的细胞籍突起伸入脑室腔与脑脊液接触(图7)；有的胞体位于室管膜内，突起走行于室管膜上皮之间(图8)。显微图像分析系统在实验组检测到133个细胞，在对照组检测到82个细胞。经统计学处理，实验组CCK触液神经元的切面面积高于对照组，灰度值低于对照组(表3)。
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表3 CCK阳性触液神经元面积和灰度比较
Table 3 Comparison of the sectional area and grey degree of CCK-positive CSF-CNs 切面面积
sectional
area
细胞数
cells
灰度
grey
degree
细胞数
, http://www.100md.com cells
烫伤组
burned
对照组
control
烫伤组
burned
对照组
control
<50
2
2
<30
, 百拇医药
7
10
50～
6
12
30～
23
8
70～
10
15
40～
33
16
, http://www.100md.com
90～
20
21
50～
31
21
110～
28
17
60～
20
14
130～
, 百拇医药 16
8
70～
9
10
150～
17
4
80～
8
3
170～
13
1
, http://www.100md.com
90～
2
190～
21
2
N=215
T1=16 647.5
T2=6 357.5
N=215
T1=12 495
T2=10 725
, 百拇医药 t=5.872
P<0.001
t=4.2814
P<0.001
讨 论
Kiss[10]报道，CCK阳性细胞存在于PVN大、小两类神经元。本实验观察到CCK大细胞神经元在PVN mm和lm的分布、在lm尾部形成的环状排列及小细胞CCK神经元的分布基本与Kiss的报道相符。已知分布于大细胞各亚部的CCK部分与催产素(oxytocin,OT)共存，其纤维投射至垂体后叶[11]；分布于小细胞亚部的CCK部分与促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasing factor,CRF)共存，其纤维主要投射到ME外带[10，14]。从CCK存在于PVN两类神经元的现象，提示CCK参与神经内分泌调节。而来自皮肤烫伤的传入刺激使丘脑下部控制的许多激素和神经肽的分泌发生异常，CCK作为一种重要的调质或整合肽(intergretive peptide)在其中必然发挥作用。Siegel RA[12]报道，电击足底造成大鼠应激状态，在丘脑下部背内侧区，应激后0～30min CCK量下降，30～60min不再下降；在丘脑下部腹内侧区，CCK量从应激开始一直持续下降。Siegel认为，CCK在背内侧区的先下降是由于发生了胞体运输至末梢的释放，以后趋于稳定是由于胞体开始合成以补充机体在应激状态下的需要；而在腹内侧区的持续下降是由于释放所致。但Siegel所用放射免疫法不能准确定位，观察的应激类型与本实验不同，而且仅仅观察了应激早期CCK的变化。本实验结果弥补了放射免疫法不能定位的不足，在Siegel早期观察的基础上，发现伤后24h CCK在胞体的合成和在末梢的释放仍在增加，为PVN内CCK神经元参与烫伤应激反应提供了形态学依据。
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传统观念认为，脑脊液内仅含一些无机离子、氨基酸等，对脑组织只起缓冲、保护、营养和运输代谢物质的作用。而近年研究表明，脑脊液内不仅含有神经递质和神经激素，而且还可能参与神经内分泌调节。因为在脑组织和脑脊液之间存在有参与这种调节的网络系统——CSF-CNs，它们在脑组织和脑脊液之间进行着信息交流，以维持神经元微环境的自稳。但目前对此系统在正常生理条件下的作用机制、特别是在异常情况下的变化知之甚少。本实验观察到烫伤后在第三脑室室管膜内出现大量含CCK的CSF-CNs，可能就是机体在应激状态下为达到新的平衡和自稳，将增多的CCK迅速释放入脑脊液提供的一条新途径。释放的CCK可借助脑脊液循环，调节控制垂体的室周器官肽能系统的代谢活性[6]；也可对远位靶区进行调节，完成脑-脑脊液神经体液回路[7]。本研究结果进一步更新了传统神经解剖学关于室管膜结构、脑脊液功能的概念，揭示CSF-CNs在烫伤应激条件下参与了神经和体液双重调节，为认识CSF-CNs在疾病发生、发展过程中的作用奠定了下一步的研究基础。
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综合本实验结果和文献报道，我们认为在烫伤应激中PVN合成的CCK可能有3条去路：一是在ME外带释放入血，经垂体门脉系统作用于前叶细胞分泌促肾上腺皮质激素(adrenocoritcotropin hormone,ACTH)[13]；二是在垂体后叶水平调节血管加压素(vasopression,VP)和催产素(oxytocin,OT)的分泌[11，14]，而VP可调节烫伤引起的水代谢失衡，OT则可作用于肾内钠离子的分泌；三是通过CSF-CNs直接释放入脑脊液，通过脑脊液和脑组织之间的信息交流，调节控制垂体的室周肽能系统活性或作用于中枢各脑区发挥其整合调控功能。
本实验还观察到一个有趣的现象，即烫伤应激使PVN内VP、CRF和CCK均增加(见另文)的同时，却极少观察到含VP和CRF的CSF-CNs。虽然已有文献报道正常情况下CSF-CNs中亦含VP和CRF，但为什么在烫伤应激状态下经CSF-CNs释放入脑脊液的主要是CCK而不是VP或CRF?这是值得进一步研究的问题。
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图1 对照大鼠PVN内的CCK阳性细胞，ABC法(下同)×100 图2 对照大鼠PVN 1m尾部的CCK阳性细胞呈环状排列，包绕未着色的细胞×40 图3 烫伤大鼠PVN内的CCK阳性细胞×100 图4，5 大鼠第三脑室室管膜内CCK阳性的CSF-CNs，图4为对照大鼠；图5为烫伤大鼠×200 图6～8 示烫伤大鼠第三脑室室管膜内各种CCK阳性CSF-CNs，其中图7示CCK阳性CSF-CN的突起(↑)伸入第三脑室 ×400mm.内侧大细胞亚部 lm.外侧大细胞亚部 3V.第三脑室
Fig.1 The CCK-positive cells in the PVN of the control rat.ABC method (the same as follows).×100
Fig.2 The CCK-positive cells in the caudal lateral magnocellular subdivision of the the control rat,forming a ring around a zone of unstained cells.×40
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Fi.g.3 The CCK-positive cells in the PVN of the burnt rat.×100
Fig.4,5 The CCK-positive CSF-CNs in the ependyma of rat third ventricle.Fig.4:In the control rat.Fig.5:In the burnt rat.×200
Fig.6-8 Showing various CCK-positive CSF-CNs in the ependyma of the third ventricule in the burnt rat.Fig.7： showing the CCK-positive CSF-CN with a process extending into the third ventricle(↑)×400
mm:medial magnocellular;1m:lateral magnocellular;3V:the third ventricle
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△ Department of Histology and Embryology,The Third Military Medical Univeristy,Chongqing 400038,China
参考文献
[1]Harro J,Lofberg C,Rehfeld JF,et al.Cholecystokinin peptides and receptors in the rat brain during stress.Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmocol,1996,354(1):59
[2]Gue M,Tekamp A,Tabis N,et al.Cholecystokinin blockade of emotional stress and CRF-induced colonic motor alterations in rats:role of the amygdola.Brain Res,1994,658(1-2):232
, http://www.100md.com
[3]洪新如，王成海.下丘脑室旁核β内啡肽在大鼠烫伤休克中的作用.生理学报，1995，46(1)：19
[4]范溥生，何润昌，汪定涛，等.烫伤对大鼠下丘脑室旁核AVP阳性细胞的影响.解剖学杂志，1990，13(2)：106
[5]朱长庚.化学神经解剖学.上海：上海科学技术出版社，1992：84-96
[6]Scott DE,Vaughan GM,Pruitt BA.Hypothalamic neuroendocrine correlates of cutaneous burn injury in the rat:Ⅰ.Scanning electron microscopy.Brain Research Bull,1986,17(3):367
[7]朱长庚.脑-脑脊液神经体液回路.神经解剖学杂志，1988，4(1)：125
, 百拇医药
[8]Swanson LW,Kuypers HGJM.The paraventricular nucleus of the hypothalamus:Cytoarchitecture subdivisions and the organization of projections to the pituitary,dorsal vagal complex and spinal cord as demonstrated by retrograde fluorescence double-labeling method.J Comparative Neurology,1980,194(3):555
[9]Armstrong WE,Warach S,Hatton GI,et al.Subnuclei in the rat hypothalamic paraventricular nucleus:A cytoarchitectural,horseradish peroxidase and immunocytochemical analysis.Neuroscience,1980,5(11):1931
, http://www.100md.com
[10]Kiss JZ,Williams TH,Palkovits M.Distribution and projection of cholecystokinin-immunoreactive neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus of rat.J of Comparative Neurology,1984,227(2):173
[11]Meister B,Broberger C,Villar MJ,et al.Cholecystokinin B receptor gene expression in hypothalamic neurosecretory neurons after experimental manipulations.Neuroendocrinology,1994,60(5):458
[12]Sigel RA,Duker Em,Pahnke U,et al.Stress-induced changes in CCK and substance P concentrations in discrete regions of the rat hypothalamus.Neuroendocrinology,1987,46(1):75
, http://www.100md.com
[13]Reisine T,Jensen R.Cholecystokinin-8 stimulates adrenocorticotropin release from anterior pituitary cells.J Pharmocol.Exp Ther,1986,236(3):621
[14]Deschepper C,Lotstra F,Vandesande F,et al.Cholecystokinin varies in the posterior pituitary and external median eminence of the rat according to factors affecting vasopressin and oxytocin.Life Science,1983,32(22):2571
收稿1997-01 修回1998-07, http://www.100md.com