大鼠大脑运动皮质与脑干面口部运动前神经元的突触联系*
作者：李云庆 王智明 施际武
单位：第四军医大学解剖学教研室，梁銶琚脑研究中心， 西安 710032
关键词：运动皮质；皮质脑干束；脑干面口部运动核；脑干运动前神经元；谷氨酸；大鼠
解剖学报990102
【摘要】 目的 观察大脑运动皮质发出的下行投射终末或谷氨酸能终末与脑干面口部运动核内运动神经元的间接突触联系。 方法 顺行与逆行追踪相结合及免疫组织化学染色与逆行追踪相结合的双重标记技术。 结果 将PHA-L电泳入大鼠额叶1区和/或2区和将HRP分别注入三叉神经运动核(Vm)、面神经核(Ⅶ)或舌下神经核(ⅩⅡ)，PHA-L顺标终末和HRP逆标神经元的重叠分布区主要见于臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、延髓中缝核簇和延髓网状结构外侧部，而在脑干面口运动核内则很少见到PHA-L顺标终末。上述区域内也有较密集的谷氨酸样阳性终末。在电镜下观察到除Vm、Ⅶ和ⅩⅡ以外的结构内PHA-L顺标终末或谷氨酸样阳性终末与HRP逆标神经元的胞体和树突形成以非对称性为主的轴-体和轴-树突触。 结论 本研究的结果为皮质脑干束的终止部位和运动皮质对脑干运动核的间接调控提供了直接的形态学依据。来自大脑运动皮质并呈谷氨酸样阳性锥体细胞的下行投射对脑干运动前神经元主要发挥兴奋性作用。
, 百拇医药
SYNAPTIC CONNECTIONS BETWEEN CEREBRAL MOTOR
CORTEX AND PREMOTOR NEURONS OF THE
BRAINSTEM OROFACIAL MOTONEURONS IN THE RAT
Li Yunqing△,Wang Zhiming,Shi Jiwu
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
【Abstract】 Objective To observe the direct synaptic connections between the descending axon terminals of the corticobulbar tract originated from cerebral motor cortex or glutamatergic axon terminals and the premotor neurons of the brainstem orofacial motor nuclei.Methods The double-labeling methods by combination of phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L) anterograde tracing with horseradish peroxidase (HRP) retrograde tracing or by combination of immunohistochemical staining for glutamate (Glu) with HRP retrograde tracing were used in the present study.Results After injection PHA-L into the area 1 and/or 2 of the frontal cortex and HRP into the trigeminal motor nucleus (Vm),facial nucleus(Ⅶ) or hypoglossal nucleus(Ⅹ Ⅱ),respectively,PHA-L anterogradely labeled fibers and terminals and HRP retrogradely labeled neurons overlapped mainly in the parabrachial nuclei,supratrigeminal nucleus,pontine reticular formation medial to the Vm,medullary raphe nuclei and lateral parvicellular part of the medullary reticular formation.Whereas within the brainstem orofacial motor nuclei,only few PHA-L anterogradely labeled fibers and terminals were observed.Quite dense Glu-like immunoreactive (Glu-LI) axon terminals were also found in those structures as mentioned above.PHA-L anterogradely labeled or Glu-LI axon terminals mainly formed asymmetrical axo-somatic and axo-dendritic synapses with HRP retrogradely labeled neuronal cell bodies and dendrites within the parabrachial nuclei,supratrigeminal nucleus,pontine reticular formation medial to the Vm,medullary raphe nuclei,and lateral parvicellular part of the medullary reticular formation.Conclusion The present results provide direct morphological evidence for the termination sites of the corticobulbar tract and the indirect regulation effects of the cerebral motor cortex on the brainstem orofacial motor nuclei,and indicate that glutamatergic descending projections from pyramidal neurons in the layer V of the cerebral motor cortex might have excitatory influence upon brainstem premotor neurons.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral motor cortex;Corticobulber tract;Brainstem orofacial motor nuclei;Brainstem premotor neuron;Glutamate;Rat
经典神经解剖学所描述的大脑运动皮质发出的皮质脑干束(也称皮质核束)直接支配脑干运动核的理论受到了现代神经科学研究成果的挑战。大鼠的大脑运动皮质主要是额叶1区和2区[1]。近年来的机能学和形态学研究都证实大脑运动皮质发出的下行投射纤维主要先终止于脑干网状结构、臂旁核簇和中缝核簇等部位，这些部位的神经元被称为脑干运动神经元的运动前神经元(premotor neuron),再由这些中间神经元发出纤维终止于脑干运动核，对其功能活动进行调控[2～7]。大脑运动皮质发出下行投射的神经元主要是其V层的大型锥体细胞，这些锥体细胞主要含谷氨酸[8]。以往的研究对脑干运动前神经元的分布及其神经活性物质已有了较详细的阐述[9～15]，还观察了猫外侧丘系核[6]和网状结构小细胞部[7]的运动前神经元与Vm运动神经元间的突触联系。但运动皮质下行投射纤维的终末及谷氨酸能终末与脑干运动前神经元之间的突触联系尚缺乏系统研究。为了观察大脑运动皮质发出的皮质脑干束与脑干面口部运动核的间接联系，本研究分别用顺行与逆行追踪相结合及免疫组织化学染色与逆行追踪相结合的双标技术，对大鼠大脑运动皮质下行投射终末或谷氨酸能终末与运动前神经元的突触联系进行了观察。
, 百拇医药
材料和方法
表1 4组动物的示踪剂注射部位
Table 1 Injection sites of tracers in 4 aminal groups 示踪剂
tracer
第1组(n=10)
group 1
第2组(n=10)
group 2
第3组(n=10)
group 3
第4组(n=10)
, 百拇医药
group 4
PHA-L
额叶1区(n=3)
frontal area 1
额叶1区(n=3)
frontal area 1
额叶1区(n=3)
frontal area 1
额叶2区(n=3)
frontal area 2
额叶2区(n=3)
, http://www.100md.com
frontal area 2
额叶2区(n=3)
frontal area 2
额叶1区和2区(n=4)
frontal area 1 and 2
额叶1区和2区(n=4)
frontal area 1 and 2
额叶1区和2区(n=4)
frontal area 1 and 2
三叉神经运动核
, 百拇医药 HRP(n=10)
Vm
面神经核
(n=10)
Ⅶ
舌下神经核
(n=10)
ⅩⅡ
三叉神经运动核(Vm,n=4)
面神经核(Ⅶ,n=3)
舌下神经核(Ⅹ Ⅱ,n=30)
雄性SD大鼠40只，体重200～250g，分成4组，每组10只。戊巴比妥钠经腹腔麻醉(40 mg/kg)后，将5%PHA-L以正向间隙电流(4μA)分别电泳入第1～3组动物的额叶1区和/或2区；动物存活2周后再次麻醉，将0.1μl的30%HRP水溶液分别经压力缓慢定向注入各组动物的一侧面口部运动核(表1)。HRP注射后动物再存活3d，用戊巴比妥钠深麻、开胸，经心脏插管至升主动脉，先以100ml的生理盐水冲洗血液，再用含4%多聚甲醛和0.05%戊二醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)灌注固定1h以上，灌注完毕立即取脑，将脑先置入上述新鲜固定液中后固定6h(4℃)，再移入30%蔗糖中过夜(4℃)。振动切片机横切前脑和脑干，片厚50μm，隔3张取1张，分4套收集。全部动物的第1套切片用钨酸钠作稳定剂的四甲基联苯胺(TMB)呈色方法显示HRP的注射区及HRP逆行标记神经元(表2)。第1～3组动物的第2套切片用ABC法显示PHA-L的注射区及PHA-L顺行标记纤维和终末：切片先入兔抗PHA-L血清(1∶3 000，Sigma)孵育24h，次入Biotin标记的羊抗兔IgG(1∶100,Vector)孵育3h，再入ABC复合物(1∶200，Vector)孵育1h，最后用二氨基联苯胺(DAB)呈色(表2)。第1～4组动物的第3套切片先用钨酸钠作稳定剂的TMB呈色方法进行HRP呈色并用硫酸镍铵加强反应产物；将第1～3组的第3套切片用上述的ABC法显示PHA-L顺行标记纤维和终末；第4组的第3套切片用ABC法进行谷氨酸样免疫组织化学染色：切片先入兔抗谷氨酸血清(1∶1 000,Chemicon)孵育24h，次入Biotin标记的羊抗兔IgG(1∶100,Vector)孵育3h，再入ABC复合物(1∶200,Vector)孵育1h，最后用DAB呈色(表2)。经上述反应的全部第3套切片入1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，Epon812平板包埋，选择脑干运动前神经元分布区内有PHA-L顺行标记纤维和终末、谷氨酸样阳性终末及HRP逆行标记神经元的部位超薄切片、铅染、Philips-100电镜观察。第4套切片均行Nissl染色，以便对照观察结果(表2)。表2 4组动物各套切片的反应和染色
, 百拇医药
Table 2 Reaction and staining for sections of 4 animal groups 切片
sections
第1组
(n=10)
group 1
第2组
(n=10)
group 2
第3组
(n=10)
group 3
, 百拇医药
第4组
(n=10)
group 4
第1套(No.1 set)
HRP
HRP
HRP
HRP
第2套(No.2 set)
PHA-L
PHA-L
PHA-L
, http://www.100md.com 第3套(No.3 set)
HRP+PHA-L
HRP+PHA-L
HRP+PHA-L
HRP+Glu
第4套(No.4 set)
Nissal
Nissal
Nissal
Nissal
结 果
PHA-L的注射区主要位于大鼠大脑运动皮质的额叶1区和/或2区的深层(Ⅳ～Ⅵ层)。将PHA-L注入额叶1区和/或2区后，PHA-L顺行标记纤维和终末见于脑干的许多部位，但臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构和延髓网状结构外侧部内的PAH-L顺行标记纤维和终末较密集，而在脑干运动核内则很少见到PHA-L顺行标记纤维和终末。上述结构内的PHA-L顺行标记纤维较直，分支较多，其上多有较密集的膨体，外观呈串珠状，有较多以短柄连于纤维上并呈末端膨大的终末，此外还可见呈点状的PHA-L顺行标记终末。经对各组动物第1套切片的观察，仅选择HRP注射区局限于Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ的动物，用于本研究。将HRP分别注入Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ后，在臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、延髓中缝核簇和延髓网状结构外侧部均可见较多的HRP逆标神经元；但将HRP注入Vm或Ⅶ后，HRP逆行标记神经元主要见于臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构和延髓吻侧的网状结构；将HRP注入Ⅹ Ⅱ后，HRP逆行标记神经元主要见于臂旁核簇、延髓网状结构尾侧的外侧部。上述结构内的HRP逆行标记神经元多呈中型(16～34μm)梭形、三角形和多极形，偶见大型(≥35μm)多极形神经元和小型(≤15μm)梭形及圆形神经元。谷氨酸样阳性神经元的胞体、纤维和终末见于脑干的大多数核团，但臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、脑干中缝核簇和延髓网状结构外侧部内阳性胞体的数量较少，阳性纤维和终末却较密集。
, 百拇医药
在电镜下，HRP逆行标记神经元的胞浆和树突内有不规则针状并呈板层排列的TMB反应产物的结晶，由于经DAB和镍的加强，结晶的边缘不清晰，常呈斑块状(图1～6)；PHA-L顺行标记轴突及其终末内的PHA-L标记产物呈弥散性分布，为不定形状，位于突触小泡和线粒体膜外，突触小泡呈空泡状，线粒体内无PHA-L标记产物(图1～4)。谷氨酸样免疫反应产物位于轴突及其终末，产物也呈弥散性分布，为不定形状，主要位于突触小泡内(图5，6)。
在臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、延髓中缝核簇和延髓网状结构外侧部内，均可见PHA-L顺行标记终末与HRP逆行标记神经元的胞体和树突形成以非对称性为主的轴-树突触(图1，3，4)和轴-体突触(图2)，PHA-L顺行标记终末内主要含透明圆形突触小泡。此外，可见一些PHA-L顺行标记终末与未标记胞体和树突及未标记终末与HRP逆行标记神经元胞体和树突也形成以非对称性为主的突触联系。在臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、延髓中缝核簇和延髓网状结构尾段外侧部内，均可见谷氨酸样阳性终末与HRP逆行标记神经元的胞体和树突形成非对称性轴-体突触和轴-树突触(图5，6)，偶见谷氨酸样阳性终末与未标记胞体和树突形成非对称性为主的突触联系，谷氨酸样阳性终末内也主要含透明圆形突触小泡(图5，6)。在上述区域内，PHA-L顺行标记终末和谷氨酸样阳性终末与HRP逆行标记胞体间的突触联系明显少于与HRP逆行标记树突间的突触联系。
, 百拇医药
讨 论
脑干面口部运动核(Vm、Ⅶ和ⅩⅡ)支配咀嚼肌、表情肌、舌肌等，与咀嚼、吞咽、吸吮、表情和发音等复杂功能活动有密切关系，在完成这些活动的过程中，不同肌群间的协同和协调是必须的，这就要求大脑运动皮质对其的支配具有复杂多样的形式。大脑运动皮质发出传出投射的锥体细胞主要位于V层并含兴奋性神经递质谷氨酸[8]，对突触后神经元主要发挥兴奋性效应[2，3]，而在完成上述复杂功能活动过程中，不同肌群，如开口肌和闭口肌、提口角肌和降口角肌、伸舌肌和缩舌肌等机能相佐的肌肉间的协同和协调，仅仅依靠兴奋性效应是远远不够的，必须有抑制性的神经支配。以往的研究多集中在含经典递质和肽类神经递质的运动前神经元对脑干面口部运动神经元的支配[10，12]，我们最近的研究则观察到一些运动前神经元含抑制性神经递质γ-氨基丁酸和甘氨酸[14，15]。大脑运动皮质经脑干运动前神经元间接支配脑干的面口部运动神经元，运动前神经元所含神经递质和/或调质的多样性，为面口部不同肌群间的协同和协调，提供了物质基础。由此可见，研究大脑运动皮质与支配脑干面口部运动核的运动前神经元间的突触联系具有重要的意义。
, 百拇医药
本研究观察到从大鼠大脑运动皮质下行投射纤维的终末和谷氨酸样阳性终末与向脑干面口部运动核(Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ)投射的运动前神经元间形成以非对称性为主的轴-体突触和轴-树突触。这些结果为以往机能学和形态学研究所观察到的大脑运动皮质下行投射纤维的终止部位、大脑运动皮质经脑干运动前神经元对脑干面口部运动核的间接调控提供了直接的形态学依据。本研究中，虽然无法判断来自大脑运动皮质的PHA-L顺行标记轴突终末和谷氨酸样阳性轴突终末内突触小泡的形状，但从部分终末呈谷氨酸样阳性和两种终末均主要形成非对称性轴-体突触和轴-树突触来看，本研究的结果也提示大脑运动皮质发出的下行投射纤维对突触后的运动前神经元可能主要发挥兴奋性效应，这种兴奋性作用在完成大脑运动皮质所发出的运动指令方面可能非常重要；而面口部不同肌群的协同和协调所依赖的不仅仅是兴奋性效应，这些复杂运动的调控，可能主要由受大脑运动皮质支配和含不同神经递质和/或调质的运动前神经元完成。应当指出的是本研究所观察到的谷氨酸样阳性轴突终末除来自大脑运动皮质外，还可能来自中枢神经系统的其他部位，尤其是脑干的谷氨酸能神经元，脑干运动前神经元所在的区域不仅仅只投射向脑干面口部运动核。本研究还观察到大脑运动皮质下行投射纤维的终末和谷氨酸能终末与脑干运动前神经元所在区域内，不向脑干面口部运动核投射的神经元形成以非对称性为主的突触联系，HRP逆行标记的脑干运动前神经元与非标记的阴性轴突终末形成以非对称性为主的突触联系，这些结果说明大脑运动皮质下行投射纤维可能还终止在非运动前神经元，运动前神经元也受大脑运动皮质以外的传入和非谷氨酸能传入的调控。当然也不能排除HRP注射区未占据各脑干面口部运动核的全部，致使HRP标记运动前神经元的数量少于向这些运动核投射的运动前神经元的真实数量的可能性。
, 百拇医药
感谢张淼丽、王丹和原悦萍同志在电镜标本制备和图片制作过程中的帮助。
图版说明
图1 来自大脑额叶2区的PHA-L顺行标记轴突终末(AP)与臂旁外侧核向Vm投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触。HRP典型的HPR反应产物 图1～6标尺示1.6μm
图2 PHA-L顺行标记轴突终末(AP)与三叉上核向Vm投射的HRP逆行标记运动前神经元的胞体(SH)形成轴-体突触
图3 PHA-L顺行标记轴突终末(AP)与臂旁外侧核向Ⅶ投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触
图4 PHA-L顺行标记轴突终末(AP)与延髓网状结构尾段外侧部向ⅩⅡ投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触
, 百拇医药
图5 谷氨酸样阳性轴突终末(AG)与三叉上核向Vm投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触
图6 谷氨酸样阳性轴突终末(AG)与延髓网状结构尾段外侧部向ⅩⅡ投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触。图1～6中的黑三角示突触活性区
Fig.1 A PHA-L anterogradely labeled axon terminal (AP) originated from area 2 of the frontal cortex makes an axo-dendritic synapes with a dendrite of an HRP retrogradely labeled neuron(DH) in the lateral parabrachial nucleus which projected to the trigeminal motor nucleus(Vm).HRP:typical HRP reaction productsFig.2 A PHA-L labeled axon terminal (AP) forms an axo-somatic synapse with an HRP labeled neuronal cell body(SH)in the superatrigeminal nucleus which projected to the Vm.Fig.3 A PHA-L labeled axon terminal (AP) makes an axo-dendritic synapse with a dendrite(DH) of an HRP labeled neuron in the lateral parabrachial nucleus which projected to the facial nucleus(Ⅶ).Fig.4 A PHA-L labeled axon terminal(AP) forms an axo-dendritic synapse with a dendrite of an HRP labeled neuron at the caudal segment of the lateral medullary parvicellular reticular formation which projected to the hypolossal nucleus(ⅩⅡ).Fig.5 A glutamate-like immunoreactive(Glu-LI) axon terminal(AG) made an axo-dendritie synapse with a dendrite of an HRP labeled neuron in the superatrigeminal nucleus which projected to the Vm.Fig.6 A Glu-LI axon terminal (AG) formed an axo-dendritic synapese with d dendrite of an HRP labeled neuron at the caudal segment of the lateral medullary parvicellular reticular formation which projected to the ⅩⅡ.Black triangles in Fig. 1-6 indicate active zones of the synapses.Bar in Fig.6=1.6μm and also for Fig. 1-5.
, http://www.100md.com
* 国家杰出青年科学基金资助课题(No.39625011)
△ Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
参考文献
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收稿1997-08 修回1998-04, 百拇医药
单位：第四军医大学解剖学教研室，梁銶琚脑研究中心， 西安 710032
关键词：运动皮质；皮质脑干束；脑干面口部运动核；脑干运动前神经元；谷氨酸；大鼠
解剖学报990102
【摘要】 目的 观察大脑运动皮质发出的下行投射终末或谷氨酸能终末与脑干面口部运动核内运动神经元的间接突触联系。 方法 顺行与逆行追踪相结合及免疫组织化学染色与逆行追踪相结合的双重标记技术。 结果 将PHA-L电泳入大鼠额叶1区和/或2区和将HRP分别注入三叉神经运动核(Vm)、面神经核(Ⅶ)或舌下神经核(ⅩⅡ)，PHA-L顺标终末和HRP逆标神经元的重叠分布区主要见于臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、延髓中缝核簇和延髓网状结构外侧部，而在脑干面口运动核内则很少见到PHA-L顺标终末。上述区域内也有较密集的谷氨酸样阳性终末。在电镜下观察到除Vm、Ⅶ和ⅩⅡ以外的结构内PHA-L顺标终末或谷氨酸样阳性终末与HRP逆标神经元的胞体和树突形成以非对称性为主的轴-体和轴-树突触。 结论 本研究的结果为皮质脑干束的终止部位和运动皮质对脑干运动核的间接调控提供了直接的形态学依据。来自大脑运动皮质并呈谷氨酸样阳性锥体细胞的下行投射对脑干运动前神经元主要发挥兴奋性作用。
, 百拇医药
SYNAPTIC CONNECTIONS BETWEEN CEREBRAL MOTOR
CORTEX AND PREMOTOR NEURONS OF THE
BRAINSTEM OROFACIAL MOTONEURONS IN THE RAT
Li Yunqing△,Wang Zhiming,Shi Jiwu
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
【Abstract】 Objective To observe the direct synaptic connections between the descending axon terminals of the corticobulbar tract originated from cerebral motor cortex or glutamatergic axon terminals and the premotor neurons of the brainstem orofacial motor nuclei.Methods The double-labeling methods by combination of phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L) anterograde tracing with horseradish peroxidase (HRP) retrograde tracing or by combination of immunohistochemical staining for glutamate (Glu) with HRP retrograde tracing were used in the present study.Results After injection PHA-L into the area 1 and/or 2 of the frontal cortex and HRP into the trigeminal motor nucleus (Vm),facial nucleus(Ⅶ) or hypoglossal nucleus(Ⅹ Ⅱ),respectively,PHA-L anterogradely labeled fibers and terminals and HRP retrogradely labeled neurons overlapped mainly in the parabrachial nuclei,supratrigeminal nucleus,pontine reticular formation medial to the Vm,medullary raphe nuclei and lateral parvicellular part of the medullary reticular formation.Whereas within the brainstem orofacial motor nuclei,only few PHA-L anterogradely labeled fibers and terminals were observed.Quite dense Glu-like immunoreactive (Glu-LI) axon terminals were also found in those structures as mentioned above.PHA-L anterogradely labeled or Glu-LI axon terminals mainly formed asymmetrical axo-somatic and axo-dendritic synapses with HRP retrogradely labeled neuronal cell bodies and dendrites within the parabrachial nuclei,supratrigeminal nucleus,pontine reticular formation medial to the Vm,medullary raphe nuclei,and lateral parvicellular part of the medullary reticular formation.Conclusion The present results provide direct morphological evidence for the termination sites of the corticobulbar tract and the indirect regulation effects of the cerebral motor cortex on the brainstem orofacial motor nuclei,and indicate that glutamatergic descending projections from pyramidal neurons in the layer V of the cerebral motor cortex might have excitatory influence upon brainstem premotor neurons.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral motor cortex;Corticobulber tract;Brainstem orofacial motor nuclei;Brainstem premotor neuron;Glutamate;Rat
经典神经解剖学所描述的大脑运动皮质发出的皮质脑干束(也称皮质核束)直接支配脑干运动核的理论受到了现代神经科学研究成果的挑战。大鼠的大脑运动皮质主要是额叶1区和2区[1]。近年来的机能学和形态学研究都证实大脑运动皮质发出的下行投射纤维主要先终止于脑干网状结构、臂旁核簇和中缝核簇等部位，这些部位的神经元被称为脑干运动神经元的运动前神经元(premotor neuron),再由这些中间神经元发出纤维终止于脑干运动核，对其功能活动进行调控[2～7]。大脑运动皮质发出下行投射的神经元主要是其V层的大型锥体细胞，这些锥体细胞主要含谷氨酸[8]。以往的研究对脑干运动前神经元的分布及其神经活性物质已有了较详细的阐述[9～15]，还观察了猫外侧丘系核[6]和网状结构小细胞部[7]的运动前神经元与Vm运动神经元间的突触联系。但运动皮质下行投射纤维的终末及谷氨酸能终末与脑干运动前神经元之间的突触联系尚缺乏系统研究。为了观察大脑运动皮质发出的皮质脑干束与脑干面口部运动核的间接联系，本研究分别用顺行与逆行追踪相结合及免疫组织化学染色与逆行追踪相结合的双标技术，对大鼠大脑运动皮质下行投射终末或谷氨酸能终末与运动前神经元的突触联系进行了观察。
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材料和方法
表1 4组动物的示踪剂注射部位
Table 1 Injection sites of tracers in 4 aminal groups 示踪剂
tracer
第1组(n=10)
group 1
第2组(n=10)
group 2
第3组(n=10)
group 3
第4组(n=10)
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group 4
PHA-L
额叶1区(n=3)
frontal area 1
额叶1区(n=3)
frontal area 1
额叶1区(n=3)
frontal area 1
额叶2区(n=3)
frontal area 2
额叶2区(n=3)
, http://www.100md.com
frontal area 2
额叶2区(n=3)
frontal area 2
额叶1区和2区(n=4)
frontal area 1 and 2
额叶1区和2区(n=4)
frontal area 1 and 2
额叶1区和2区(n=4)
frontal area 1 and 2
三叉神经运动核
, 百拇医药 HRP(n=10)
Vm
面神经核
(n=10)
Ⅶ
舌下神经核
(n=10)
ⅩⅡ
三叉神经运动核(Vm,n=4)
面神经核(Ⅶ,n=3)
舌下神经核(Ⅹ Ⅱ,n=30)
雄性SD大鼠40只，体重200～250g，分成4组，每组10只。戊巴比妥钠经腹腔麻醉(40 mg/kg)后，将5%PHA-L以正向间隙电流(4μA)分别电泳入第1～3组动物的额叶1区和/或2区；动物存活2周后再次麻醉，将0.1μl的30%HRP水溶液分别经压力缓慢定向注入各组动物的一侧面口部运动核(表1)。HRP注射后动物再存活3d，用戊巴比妥钠深麻、开胸，经心脏插管至升主动脉，先以100ml的生理盐水冲洗血液，再用含4%多聚甲醛和0.05%戊二醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)灌注固定1h以上，灌注完毕立即取脑，将脑先置入上述新鲜固定液中后固定6h(4℃)，再移入30%蔗糖中过夜(4℃)。振动切片机横切前脑和脑干，片厚50μm，隔3张取1张，分4套收集。全部动物的第1套切片用钨酸钠作稳定剂的四甲基联苯胺(TMB)呈色方法显示HRP的注射区及HRP逆行标记神经元(表2)。第1～3组动物的第2套切片用ABC法显示PHA-L的注射区及PHA-L顺行标记纤维和终末：切片先入兔抗PHA-L血清(1∶3 000，Sigma)孵育24h，次入Biotin标记的羊抗兔IgG(1∶100,Vector)孵育3h，再入ABC复合物(1∶200，Vector)孵育1h，最后用二氨基联苯胺(DAB)呈色(表2)。第1～4组动物的第3套切片先用钨酸钠作稳定剂的TMB呈色方法进行HRP呈色并用硫酸镍铵加强反应产物；将第1～3组的第3套切片用上述的ABC法显示PHA-L顺行标记纤维和终末；第4组的第3套切片用ABC法进行谷氨酸样免疫组织化学染色：切片先入兔抗谷氨酸血清(1∶1 000,Chemicon)孵育24h，次入Biotin标记的羊抗兔IgG(1∶100,Vector)孵育3h，再入ABC复合物(1∶200,Vector)孵育1h，最后用DAB呈色(表2)。经上述反应的全部第3套切片入1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，Epon812平板包埋，选择脑干运动前神经元分布区内有PHA-L顺行标记纤维和终末、谷氨酸样阳性终末及HRP逆行标记神经元的部位超薄切片、铅染、Philips-100电镜观察。第4套切片均行Nissl染色，以便对照观察结果(表2)。表2 4组动物各套切片的反应和染色
, 百拇医药
Table 2 Reaction and staining for sections of 4 animal groups 切片
sections
第1组
(n=10)
group 1
第2组
(n=10)
group 2
第3组
(n=10)
group 3
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第4组
(n=10)
group 4
第1套(No.1 set)
HRP
HRP
HRP
HRP
第2套(No.2 set)
PHA-L
PHA-L
PHA-L
, http://www.100md.com 第3套(No.3 set)
HRP+PHA-L
HRP+PHA-L
HRP+PHA-L
HRP+Glu
第4套(No.4 set)
Nissal
Nissal
Nissal
Nissal
结 果
PHA-L的注射区主要位于大鼠大脑运动皮质的额叶1区和/或2区的深层(Ⅳ～Ⅵ层)。将PHA-L注入额叶1区和/或2区后，PHA-L顺行标记纤维和终末见于脑干的许多部位，但臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构和延髓网状结构外侧部内的PAH-L顺行标记纤维和终末较密集，而在脑干运动核内则很少见到PHA-L顺行标记纤维和终末。上述结构内的PHA-L顺行标记纤维较直，分支较多，其上多有较密集的膨体，外观呈串珠状，有较多以短柄连于纤维上并呈末端膨大的终末，此外还可见呈点状的PHA-L顺行标记终末。经对各组动物第1套切片的观察，仅选择HRP注射区局限于Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ的动物，用于本研究。将HRP分别注入Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ后，在臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、延髓中缝核簇和延髓网状结构外侧部均可见较多的HRP逆标神经元；但将HRP注入Vm或Ⅶ后，HRP逆行标记神经元主要见于臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构和延髓吻侧的网状结构；将HRP注入Ⅹ Ⅱ后，HRP逆行标记神经元主要见于臂旁核簇、延髓网状结构尾侧的外侧部。上述结构内的HRP逆行标记神经元多呈中型(16～34μm)梭形、三角形和多极形，偶见大型(≥35μm)多极形神经元和小型(≤15μm)梭形及圆形神经元。谷氨酸样阳性神经元的胞体、纤维和终末见于脑干的大多数核团，但臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、脑干中缝核簇和延髓网状结构外侧部内阳性胞体的数量较少，阳性纤维和终末却较密集。
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在电镜下，HRP逆行标记神经元的胞浆和树突内有不规则针状并呈板层排列的TMB反应产物的结晶，由于经DAB和镍的加强，结晶的边缘不清晰，常呈斑块状(图1～6)；PHA-L顺行标记轴突及其终末内的PHA-L标记产物呈弥散性分布，为不定形状，位于突触小泡和线粒体膜外，突触小泡呈空泡状，线粒体内无PHA-L标记产物(图1～4)。谷氨酸样免疫反应产物位于轴突及其终末，产物也呈弥散性分布，为不定形状，主要位于突触小泡内(图5，6)。
在臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、延髓中缝核簇和延髓网状结构外侧部内，均可见PHA-L顺行标记终末与HRP逆行标记神经元的胞体和树突形成以非对称性为主的轴-树突触(图1，3，4)和轴-体突触(图2)，PHA-L顺行标记终末内主要含透明圆形突触小泡。此外，可见一些PHA-L顺行标记终末与未标记胞体和树突及未标记终末与HRP逆行标记神经元胞体和树突也形成以非对称性为主的突触联系。在臂旁核簇、三叉上核、Vm内侧的脑桥网状结构、延髓中缝核簇和延髓网状结构尾段外侧部内，均可见谷氨酸样阳性终末与HRP逆行标记神经元的胞体和树突形成非对称性轴-体突触和轴-树突触(图5，6)，偶见谷氨酸样阳性终末与未标记胞体和树突形成非对称性为主的突触联系，谷氨酸样阳性终末内也主要含透明圆形突触小泡(图5，6)。在上述区域内，PHA-L顺行标记终末和谷氨酸样阳性终末与HRP逆行标记胞体间的突触联系明显少于与HRP逆行标记树突间的突触联系。
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讨 论
脑干面口部运动核(Vm、Ⅶ和ⅩⅡ)支配咀嚼肌、表情肌、舌肌等，与咀嚼、吞咽、吸吮、表情和发音等复杂功能活动有密切关系，在完成这些活动的过程中，不同肌群间的协同和协调是必须的，这就要求大脑运动皮质对其的支配具有复杂多样的形式。大脑运动皮质发出传出投射的锥体细胞主要位于V层并含兴奋性神经递质谷氨酸[8]，对突触后神经元主要发挥兴奋性效应[2，3]，而在完成上述复杂功能活动过程中，不同肌群，如开口肌和闭口肌、提口角肌和降口角肌、伸舌肌和缩舌肌等机能相佐的肌肉间的协同和协调，仅仅依靠兴奋性效应是远远不够的，必须有抑制性的神经支配。以往的研究多集中在含经典递质和肽类神经递质的运动前神经元对脑干面口部运动神经元的支配[10，12]，我们最近的研究则观察到一些运动前神经元含抑制性神经递质γ-氨基丁酸和甘氨酸[14，15]。大脑运动皮质经脑干运动前神经元间接支配脑干的面口部运动神经元，运动前神经元所含神经递质和/或调质的多样性，为面口部不同肌群间的协同和协调，提供了物质基础。由此可见，研究大脑运动皮质与支配脑干面口部运动核的运动前神经元间的突触联系具有重要的意义。
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本研究观察到从大鼠大脑运动皮质下行投射纤维的终末和谷氨酸样阳性终末与向脑干面口部运动核(Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ)投射的运动前神经元间形成以非对称性为主的轴-体突触和轴-树突触。这些结果为以往机能学和形态学研究所观察到的大脑运动皮质下行投射纤维的终止部位、大脑运动皮质经脑干运动前神经元对脑干面口部运动核的间接调控提供了直接的形态学依据。本研究中，虽然无法判断来自大脑运动皮质的PHA-L顺行标记轴突终末和谷氨酸样阳性轴突终末内突触小泡的形状，但从部分终末呈谷氨酸样阳性和两种终末均主要形成非对称性轴-体突触和轴-树突触来看，本研究的结果也提示大脑运动皮质发出的下行投射纤维对突触后的运动前神经元可能主要发挥兴奋性效应，这种兴奋性作用在完成大脑运动皮质所发出的运动指令方面可能非常重要；而面口部不同肌群的协同和协调所依赖的不仅仅是兴奋性效应，这些复杂运动的调控，可能主要由受大脑运动皮质支配和含不同神经递质和/或调质的运动前神经元完成。应当指出的是本研究所观察到的谷氨酸样阳性轴突终末除来自大脑运动皮质外，还可能来自中枢神经系统的其他部位，尤其是脑干的谷氨酸能神经元，脑干运动前神经元所在的区域不仅仅只投射向脑干面口部运动核。本研究还观察到大脑运动皮质下行投射纤维的终末和谷氨酸能终末与脑干运动前神经元所在区域内，不向脑干面口部运动核投射的神经元形成以非对称性为主的突触联系，HRP逆行标记的脑干运动前神经元与非标记的阴性轴突终末形成以非对称性为主的突触联系，这些结果说明大脑运动皮质下行投射纤维可能还终止在非运动前神经元，运动前神经元也受大脑运动皮质以外的传入和非谷氨酸能传入的调控。当然也不能排除HRP注射区未占据各脑干面口部运动核的全部，致使HRP标记运动前神经元的数量少于向这些运动核投射的运动前神经元的真实数量的可能性。
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感谢张淼丽、王丹和原悦萍同志在电镜标本制备和图片制作过程中的帮助。
图版说明
图1 来自大脑额叶2区的PHA-L顺行标记轴突终末(AP)与臂旁外侧核向Vm投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触。HRP典型的HPR反应产物 图1～6标尺示1.6μm
图2 PHA-L顺行标记轴突终末(AP)与三叉上核向Vm投射的HRP逆行标记运动前神经元的胞体(SH)形成轴-体突触
图3 PHA-L顺行标记轴突终末(AP)与臂旁外侧核向Ⅶ投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触
图4 PHA-L顺行标记轴突终末(AP)与延髓网状结构尾段外侧部向ⅩⅡ投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触
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图5 谷氨酸样阳性轴突终末(AG)与三叉上核向Vm投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触
图6 谷氨酸样阳性轴突终末(AG)与延髓网状结构尾段外侧部向ⅩⅡ投射的HRP逆行标记运动前神经元的树突(DH)形成轴-树突触。图1～6中的黑三角示突触活性区
Fig.1 A PHA-L anterogradely labeled axon terminal (AP) originated from area 2 of the frontal cortex makes an axo-dendritic synapes with a dendrite of an HRP retrogradely labeled neuron(DH) in the lateral parabrachial nucleus which projected to the trigeminal motor nucleus(Vm).HRP:typical HRP reaction productsFig.2 A PHA-L labeled axon terminal (AP) forms an axo-somatic synapse with an HRP labeled neuronal cell body(SH)in the superatrigeminal nucleus which projected to the Vm.Fig.3 A PHA-L labeled axon terminal (AP) makes an axo-dendritic synapse with a dendrite(DH) of an HRP labeled neuron in the lateral parabrachial nucleus which projected to the facial nucleus(Ⅶ).Fig.4 A PHA-L labeled axon terminal(AP) forms an axo-dendritic synapse with a dendrite of an HRP labeled neuron at the caudal segment of the lateral medullary parvicellular reticular formation which projected to the hypolossal nucleus(ⅩⅡ).Fig.5 A glutamate-like immunoreactive(Glu-LI) axon terminal(AG) made an axo-dendritie synapse with a dendrite of an HRP labeled neuron in the superatrigeminal nucleus which projected to the Vm.Fig.6 A Glu-LI axon terminal (AG) formed an axo-dendritic synapese with d dendrite of an HRP labeled neuron at the caudal segment of the lateral medullary parvicellular reticular formation which projected to the ⅩⅡ.Black triangles in Fig. 1-6 indicate active zones of the synapses.Bar in Fig.6=1.6μm and also for Fig. 1-5.
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* 国家杰出青年科学基金资助课题(No.39625011)
△ Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
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收稿1997-08 修回1998-04, 百拇医药