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编号:10258686
BDNF、NGF对AD模型鼠脑移植区胚胆碱能神经元发育生长的调控
http://www.100md.com 《解剖学报》 1999年第2期
     作者:金国华 徐慧君 武义鸣 钟世镇

    单位:金国华 徐慧君 武义鸣 钟世镇 南通医学院神经生物学研究室,南通 226001;第一军医大学解剖学教研室,广州

    关键词:脑源性神经营养因子(BDNF);神经生长因子(NGF);胚胆碱能神经元;脑内移植;AD模型鼠;;

    解剖学报990204

    【摘要】 目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)对AD模型鼠脑植入胚基底前脑后行为改善和移植区胚胆碱能神经元发育生长的影响。 方法 用使君子酸损毁SD大鼠基底大细胞核制成AD模型,分成BDNF、NGF、BDNF+NGF及单纯移植对照4组。在额、顶叶皮质植入同种胚基底前脑细胞悬液,前3组含相应神经营养因子,移植后每2d向侧脑室灌注相应神经营养因子共7次。移植后1、2.5和4个月时行避暗回避试验和跳台试验,最后脑切片经AChE组织化学、ChAT和LNGFR免疫组织化学等染色,对移植区中的神经元及纤维作定量分析和图像处理。 结果 移植后应用神经营养因子的动物较对照组行为改善明显迅速,BDNF+NGF组行为改善又较BDNF组或NGF组明显。形态学证实,应用神经营养因子动物移植区中AChE阳性神经元数、16 900μm2网格中AChE阳性纤维交点数及AChE阳性神经元面积均优于对照组,BDNF+NGF组的结果又好于BDNF组或NGF组。 结论 BDNF与NGF一样能促进植入胚基底前脑的AD模型鼠行为改善和移植区胚胆碱能神经元的发育生长,BDNF和NGF联合使用比单独使用一种因子更为有效。
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    MODULATION OF BDNF AND NGF ON THE DEVELOPMENT OF EMBRYONIC CHOLINERGIC NEURONS IN BRAIN GRAFTS OF AD MODEL RATS

    Jin Guohua, Xu HuijunΔ, Wu Yiming,Zhong Shizheng

    (Department of Neurobiology,Nantong Medical College,Nantong;

     Department of Anatomy,The First Military Medical University,Guangzhou)

    【Abstract】 Objective The effects of BDNF and NGF on the behavioural improvement and the development of embryonic cholinergic neurons of grafts in AD model rats were studied.Methods AD model rats were obtained by injections of quisqualic acid into the nucleus basalis magnocellularis.The frontal and parietal cortex of AD model rats received the transplantation of the same species fetal basal forbrain suspensions with BDNF,NGF,BDNF+NGF and without neurotrophic factors.Moreover the neurothophic factors were injected into the cerebral ventricle every two days for seven times.Step-through passive avoidance and active avoidance tests were carried at 1,2.5 and 4 months after grafting.Brain sections were stained with AChE histochemistry and ChAT or LNGFR immunohistochemistry.The number of neurons and fibers in the grafts was analysed quantitatively with computer image system.Results The behaviour of animals infused with neurotrophic factors improved more obviously and quickly than the animals infused with no neurotrophic factors.The behavioural improvement of BDNF+NGF group was superior to that of BDNF or NGF group.The morphology demostrated that the number of AChE positive neurons,fibers' crossing points of 16 900μm2 grid and cell size in grafts of animals infused with neurothophic factors were also superior to that of the animals without neurotrophic factors,and the data of BDNF+NGF group were better than that of BDNF or NGF group.Conclusion BDNF,as same as NGF,could promote the behaviour function and the development of embryonic cholinergic neurons of grafts in AD model rats and the combined use of BDNF and NGF was more effective than one kind molecule alone.
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    【Key words】 BDNF; NGF; Embryonic cholinergic neurons; Brain transplantation; AD model rat

    老年性痴呆(Alzheimer disease,AD)的病理变化除在大脑皮质出现以β-淀粉样蛋白沉淀为主的老年斑和神经原纤维缠结外,基底前脑胆碱能神经元丧失、皮质胆碱能神经纤维支配减少是主要的病理改变。人们曾尝试用多种方法治疗AD,但效果均不理想。有报道用富含胆碱能神经元的胚基底前脑移植到宿主新皮质或海马能明显改善AD模型鼠的学习和记忆能力[1~3]。近年来研究表明,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)对体外培养的胚胆碱能神经元具有明显促进成活和分化作用[4,5],经侧脑室或脑实质应用NGF、BDNF亦能保护基底前脑胆碱能神经元免受隔海马离断而致的退变,并减轻痴呆程度[6,7]。本实验将BDNF、NGF加入富含胆碱能神经元的胚基底前脑细胞悬液中,植入AD模型鼠新皮质,并通过脑室灌注神经营养因子,观察BDNF、NGF以及它们联合使用对AD模型鼠脑移植区胚胆碱能神经元发育生长的调控,为将神经营养因子与脑移植相结合应用于临床治疗AD等神经系统退行性疾病提供实验和理论依据。
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    材料和方法

    1. AD模型鼠的制备

    220~250g SD大鼠,性别不拘,用复合麻醉剂Chlorpent经腹腔麻醉(2ml/kg),固定于立体定位仪,参照Paxinos图谱,根据基底大细胞核(NBM)的位置,取左侧头尾2个注射点,每点注射0.14mol/L的使君子酸(QA,Sigma公司)0.5μl,速度0.1μl/min,留针5min。1周后进行避暗回避试验,若滞留时间小于300s(正常鼠大于900s)则为记忆能力低下,随机抽取其中10%的动物经AChE组织化学和ChAT免疫组织化学染色证实NBM被损毁,则该批鼠确定为AD模型成功鼠。

    2. 胚脑移植和神经营养因子的应用

    取24只AD模型鼠随机分成BDNF、NGF、BDNF+NGF和单纯移植对照(对照组)4组,每组6只。
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    取E15~17(头臀长12~16mm)的同种大鼠胚基底前脑原基,根据Bjorklund[8]的方法制成每10μl含1块胚基底前脑原基的细胞悬液,按分组要求,在悬液中分别加入重组人BDNF(美国Saint Louis大学徐晓明博士惠赠)和NGF(7s,宝灵曼公司),浓度为0.25g/L,对照组不加神经营养因子。

    AD模型鼠麻醉固定于立体定位仪,取左侧额、顶叶皮质为移植点。额叶坐标为A=1.7mm,L=3.0mm,V=2.2mm(脑膜下);顶叶坐标为A=-1.3mm,L=4.6mm,V=2.8mm(脑膜下)。每点在10min内用微量进样器注入7.5μl细胞悬液,留针10min,缓慢退针。移植完毕,将长5mm带芯套管插入同侧侧脑室,用聚甲基丙烯酸甲酯将其快速固定于颅骨,按分组将用人工脑脊液配制的相应神经营养因子4μl(5g/L)注入侧脑室,1次/2d,共7次。于最后1次灌注的次日拔管。对照组灌注同量人工脑脊液。

    3. 行为测试
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    测试仪器和方法同施碧涛报道[9]

    3.1 避暗回避试验:在注射QA后1周及移植后1、2.5及4个月时进行,移植后进行时增设正常对照组(6只动物),记录试验第3d的探索次数和第6d的滞留时间。

    3.2 跳台试验:在移植后1、2.5及4个月避暗回避试验结束后进行,记录第7d的主动及总回避(主动+被动)反应阳性率。

    4. 形态学检测

    行为测试完毕,动物麻醉后经升主动脉灌注100ml生理盐水和400ml 4%多聚甲醛0.1mol/L PBS(pH7.4),在立体定位仪上取前囟前后4mm一段脑,后固定4h,入4℃、20%庶糖0.1mol/L PBS(pH7.4)中,次日行冰冻连续切片,厚40μm,共收集4套。第1套尼氏染色;第2套乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)组织化学染色;从第3、4套中挑选部分有移植区的切片作胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)和低亲和力神经生长因子受体(low affinity nerve growth factor receptor,LNGFR)免疫组织化学染色,一抗为购自宝灵曼公司的小鼠ChAT和LNGFR单克隆抗体,工作浓度分别为10mg/L和5mg/L,二抗为Vector公司生物素化的兔抗小鼠IgG,1∶200稀释,用ABC法、DAB硫酸镍铵加强法呈色。AChE组织化学染色切片进行(1)计数移植区AChE阳性神经元数;(2)参照Lewis[10]方法,在×600显微镜下,有移植区的切片随机抽取3个视野,计数移植区中AChE阳性纤维在16 900μm2网格中与纵横线的平均交点数;(3)每张有移植区的切片随机抽取4只AChE阳性神经元,每只动物共40个细胞,用MIAS-300计算机图像处理系统进行细胞面积分析。
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    5. 统计分析

    探索次数、滞留时间和AChE阳性神经元的细胞数、纤维交点数及面积进行方差分析和SNK检验,各组数据先行方差齐性检验,若方差不齐,平方根变换后再行检验。主动及总回避反应阳性率进行χ2检验。

    结 果

    1. 行为测试结果

    1.1 避暗回避试验:移植前4组模型鼠避暗回避试验的探索次数和滞留时间方差分析P均>0.05,说明4组模型动物行为无显著性差异。移植后1个月,各实验组的探索次数和滞留时间与正常对照组相比有较大差距;在4组实验动物中,应用神经营养因子的3组动物与单纯移植对照组相比,探索次数明显减少,滞留时间明显延长。至2.5和4个月时,各实验组的探索次数和滞留时间逐渐接近正常对照组,但以BDNF+NGF组较为明显,单纯移植对照组与正常对照组仍有差距;4个实验组的探索次数进一步减少,但单纯移植对照组在4个月时才接近使用神经营养因子的动物;滞留时间在应用神经营养因子的动物进一步延长,单纯移植对照组虽有延长,但至4个月时与其他组相比仍有差距。移植后1、2.5和4个月时4组实验动物和正常对照组动物避暗回避试验和方差分析结果分别见表1,2。
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    表1 移植后1、2.5和4个月时4组实验动物和正常对照组动物避暗回避试验结果()

    Table 1 The results of step-through passive avoidance testing in four experimental group and normal group animals 1 month,2.5 and 4 months after grafting ()

    BDNF组BDNF group

    NGF组

    NGF group

, http://www.100md.com     BDNG+NGF组

    BDNG+NGF group

    对照组

    control group

    正常对照组

    normal group

    1个月

    2.5个月

    4个月

    1个月

    2.5个月

    4个月
, 百拇医药
    1个月

    2.5个月

    4个月

    1个月

    2.5个月

    4个月

    1个月

    2.5个月

    4个月

    探索次数

    acquisition frequency

    2.2

    1.8
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    1.3

    2.0

    1.5

    1.5

    1.8

    1.3

    1.3

    3.7

    2.8

    1.8

    1.0

    0.8

    0.7
, 百拇医药
    滞留时间(秒)

    retention time(s)

    330

    530

    800

    333

    517

    760

    445

    892

    1040

    146

    330
, 百拇医药
    543

    930

    1020

    1137

    表2 移植后1、2.5和4个月时4组实验动物和正常对照组动物避暗回避试验方差分析结果

    Table 2 The results of ANOV for step-through passiveavoidance testing in four experimental group and normalgroup animals one month,2.5 and 4 months after grafting

    探索次数acquisition frequency

    滞留时间
, 百拇医药
    retention time

    F4.25

    P

    F4.25

    P

    1个月(months)

    10.62

    <0.01

    15.82

    <0.01

    2.5个月(months)

    7.05
, 百拇医药
    <0.01

    16.89

    <0.01

    4个月(months)

    4.49

    <0.01

    8.71

    <0.01

    SNK检验结果表明,移植后1个月的探索次数和滞留时间,各实验组与正常对照组之间的差异均有显著性(P<0.05或0.01);在实验组中,应用神经营养因子的各组间无显著性差异,而它们与对照组之间均有显著性差异(P<0.05或0.01);移植后2.5个月和4个月时,4个实验组的探索次数与正常对照组比较,其差异均有显著性(P<0.05或0.01);滞留时间除BDNF+NGF组外的其余3个实验组与正常对照组间的差异仍具显著性(P<0.05或0.01)。而在各实验组中,移植后2.5个月时,探索次数和滞留时间除应用神经营养因子的各组与单纯移植对照组间存在显著性差异(P<0.05或0.01)外,应用神经营养因子的各组滞留时间比较,BDNF+NGF组与BDNF组或NGF组间均具有显著性差异(P<0.01);移植后4个月时,仅BDNF+NGF组与单纯移植对照组间的滞留时间仍存在显著性差异(P<0.01)。
, 百拇医药
    1.2 跳台试验:移植后1个月,应用神经营养因子的3组动物主动和总回避反应阳性率均明显提高,而对照组主动回避反应阳性率几乎为0,总回避反应阳性率也较低。至2.5和4个月时,应用神经营养因子的3组动物主动和总回避反应阳性率均呈较大幅度增加,对照组虽有增加,但幅度较小,跳台试验第7d,主动和总回避反应阳性率结果见表3。χ2检验结果表明,移植后3个时期,主动回避反应阳性率应用神经营养因子的3组动物间差异均无显著性(P>0.05),而它们和单纯移植对照组间的差异均有显著性(P<0.05或0.01);总回避反应阳性率在应用神经营养因子的3组动物间除移植后1个月BDNF+NGF组与BDNF组之间差异有显著性(P<0.05)外,其余各个时期均无显著性差异(P>0.05),而它们和单纯移植对照组间的差异各个时期均有显著性(P均<0.01)。

    表3 4组实验动物移植后1、2.5和4个月时跳台试验第7d主动和总回避反应阳性率(%)

    Table 3 The positive rate of active and total avoidance reaction in four experimental groupanimals one month,2.5 and 4 months after grafting(%)
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    BDNF组BDNF group

    NGF组

    NGF group

    BDNF+NGF组

    BDNF+NGF group

    对照组

    control group

    1个月

    2.5个月

    4个月

    1个月

    2.5个月
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    4个月

    1个月

    2.5个月

    4个月

    1个月

    2.5个月

    4个月

    主动回避

    active avoidance

    23.3

    38.3

    43.3

    25.0
, 百拇医药
    36.7

    45.0

    33.3

    46.7

    58.3

    0.1

    13.3

    23.3

    总回避

    total avoidance

    58.3

    85.0

    93.3
, 百拇医药
    73.3

    83.3

    91.7

    88.3

    88.3

    93.3

    30.0

    56.7

    71.7

    2. 形态学结果

    2.1 正常NBM及NBM损毁后的形态学结果:尼氏片见正常NBM区以中到大细胞为主,组织化学和免疫组织化学见AChE和ChAT阳性细胞呈梭形或三角形(图1A)。QA损毁后,AChE或ChAT阳性神经元基本消失(图1B)。正常额、顶叶皮质AChE阳性纤维密度较高(图2A),NBM损毁后,皮质的AChE阳性纤维终末大部分消失(图2B)。
, 百拇医药
    2.2 移植区形态学结果:尼氏片见4组动物移植区细胞均能存活,移植区镶嵌在皮质中。移植区细胞成群分布,以中等大小细胞多见。和单纯移植对照组相比,可看出应用神经营养因子动物移植区细胞有向宿主迁移的趋势,胶质细胞减少,部分边界消失(图3)。

    AChE组织化学染色片中,各组移植区AChE阳性神经元散在或成群分布,以移植区和宿主交界处多见;深染的纤维成网状或斑片状,部分AChE阳性纤维伸入到宿主皮质,以应用神经营养因子的动物较多见。应用神经营养因子的各组和单纯移植对照组比较,AChE阳性神经元较多,纤维密度较高,面积较大,应用神经营养因子的各组中又以BDNF+NGF组的结果较好(图4~6)。4组实验动物移植区AChE阳性神经元有关统计指标结果见表4。表4 4组实验动物移植区AChE阳性神经元有关指标统计结果(±s)

    Table 4 The statistical results of AChE positive neurons in graft areas of four experimental group animals(±s)
, 百拇医药
    BDNF组BDNF group

    NGF组

    NGF group

    BDNF+NGF组

    BDNF+NGF group

    对照组

    control group

    方差分析ANOV

    F3.20

    P

    AChE神经元数

    number of AChE neurons
, 百拇医药
    205±31

    252±27

    295±42

    158±28

    17.20

    <0.01

    AChE神经元面积(μm2)

    size of AChE neurons(μm2)

    1 762±168

    1 960±129

    2 181±279
, 百拇医药
    1 410±167

    16.03

    <0.01

    AChE纤维交点数

    number of AChE fibers' crossing points

    60±9

    61±8

    76±13

    44±7

    11.79

    <0.01

    SNK检验结果显示,AChE阳性神经元数各组间比较,其差异均有显著性(P<0.05或0.01),AChE阳性神经元面积和AChE阳性纤维交点数各组间比较,除BDNF组与NGF组之间无显著性差异外,其余各组间均有显著性差异(P<0.05或0.01)。
, 百拇医药
    免疫组织化学染色片,见移植区中ChAT或LNGFR阳性神经元大多亦分布在移植物和宿主交界处,LNGFR和ChAT阳性神经元数量两者相比较,以LNGFR阳性神经元略多。应用神经营养因子动物移植区中免疫反应阳性神经元生长相对较好(图7,8)。

    图1 A.正常侧基底大细胞核的ChAT阳性神经元;B.QA损毁侧基底大细胞核未见ChAT阳性神经元 ↑示QA注射区;C.胼胝体 ×10

    Fig.1 A:Normal side ChAT positive neurons in nucleus basalis magnocellularis;B:ChAT positive neurons disappeared in QA lesioned side nucleus basalis magnocellularis.Arrow indicated the destroyed areas,C:corpus callosum ×10
, 百拇医药
    图2 A.正常侧大脑皮质AChE阳性纤维;B.QA损毁侧大脑皮质AChE阳性纤维减少 ×10

    Fig.2 A:AChE positive fibers in normal side cerebral cortex;B:AChE positive fibers decreased in QA lesioned side cerebral cortex ×10

    图3 尼氏染色,↑处示BDNF组移植区(G)与宿主皮质(H)间界限已不明显 ×10

    Fig.3 Nissl staining, showing the boundary(↑) between the graft(G)and host cortex(H) was not obvious ×10
, 百拇医药
    图4 NGF组移植区中AChE阳性神经元胞体较大 ×100

    Fig.4 AChE positive neurons with larger cell body in the graft area of NGF group ×100

    图5 BDNF+NGF组移植区中AChE阳性神经元胞体较大,突起丰富 ×100

    Fig.5 AChE positive neurons with larger cell body and richer processes in the graft area of BDNF+NGF group ×100

, 百拇医药     图6 对照组移植区中AChE阳性神经元胞体较小、突起较少、较短 ×100

    Fig.6 AChE positive neurons with smaller cell body,fewer and shorter processes in the graft area of control group ×100

    图7 LNGFR免疫组织化学染色,示BDNF+NGF组移植区中的LNGFR阳性神经元 ×50

    Fig.7 LNGFR immunohistochemical staining,showing LNGFR positive neurons distributed in the graft area of BDNF+NGF group ×50
, 百拇医药
    图8 ChAT免疫组织化学染色,示NGF组移植区与宿主交界处的ChAT阳性神经元(↑) ×50

    Fig.8 ChAT immunohistochemical staining,ChAT positive neurons (↑) situated in the border between the graft area and host cortex ×50

    讨 论

    本实验表明,应用神经营养因子和单纯脑移植的动物移植后行为均得到改善,但应用神经营养因子各组移植后早期即见行为明显改善,而对照组到4个月时其改善程度仍不及应用神经营养因子的各组,这与Sinson[11]在皮质损伤的模型中植入胚16d皮质,用微泵直接灌注NGF至移植区,14d后就发现记忆缺损和运动功能明显改善的结果类似。形态学也证实,应用神经营养因子动物的移植区中AChE阳性神经元数目明显增多,胞体面积和纤维密度也明显增大,这与Mouton[12]将NGF直接灌注于AD模型鼠皮质移植区导致移植物体积明显增大、胆碱能神经元增多、纤维密度增加的结果相同。这些结果的取得可能是由于胚脑细胞悬液中加入神经营养因子,能保护因取胚脑、制备悬液时受到损伤的神经元免于死亡,并且提供有利于移植物存活的微环境,从而提高了胚脑细胞的存活率。加之本研究在移植后早期,通过脑室灌注神经营养因子,使移植入宿主的胚脑神经元可继续得到神经营养因子的营养作用,亦可保护宿主神经元免受移植而导致的损害,表现为胶质反应减轻,有利于移植物与宿主的整合。BDNF+NGF组行为和形态学结果均较单独使用BDNF或NGF为好,这和我们[5]在体外培养中证实BDNF与NGF联合使用对胚胆碱能神经元能发挥协同作用的结果相一致,表明BDNF和NGF的协同作用不仅在体外有效,在体内也产生同样的效应。
, 百拇医药
    Mouton[12]的在体研究表明,NGF具有明显促进移植的胚胆碱能神经元发育生长的作用,而BDNF对移植的胚胆碱能神经元的作用尚未见报道。本实验证实,BDNF和NGF一样,对移植的胚基底前脑胆碱能神经元具有明显提高细胞存活率,促进胞体和突起发育生长的作用。

    本实验的移植物是富含胆碱能神经元的胚基底前脑,但在移植物中,作为胆碱能神经元特异性标志物的ChAT阳性神经元却较少。Ridley[13]也观察到类似结果。究其原因,可能与体内复杂的微环境影响了ChAT的表达有关。而应用神经营养因子的动物ChAT免疫组织化学染色结果好于对照组,可能与神经营养因子对胆碱能神经元的营养作用及促进ChAT的表达不无关系。虽然基底前脑大部分胆碱能神经元ChAT与LNGFR共存[14],但新近的研究[15]提示,NGF和BDNF对胚胆碱能神经元的营养作用可能是分别通过它们的高亲和力受体trkA和trkB介导而实现的。
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    * 国家自然科学基金资助课题(No.39170278)

    参考文献

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