人酪氨酸羟化酶催化核心DNA片段的克隆与表达
作者：陈红 张澄波 徐群渊*郑少鹏* 赵春礼*
单位：首都医科大学生物化学教研室；*北京神经科学研究所，北京 100054
关键词：酪氨酸羟化酶；诱变；催化结构域
解剖学报990203 【摘要】 目的 获得编码人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)催化核心cDNA片段，并观察其表达。方法 采用人的全长THcDNA为模板，设计特定的引物进行PCR扩增反应并构建真核表达载体——质粒pCMVTHC。在对目的片段测序后，将重组质粒转染到大鼠原代培养骨骼肌细胞内，用免疫组织化学方法检测其表达。 结果 获得了编码N-端缺失145个氨基酸的酪氨酸羟化酶催化结构域的cDNA片段，其表达载体构建正确。插入片段的DNA序列与人THmRNA相应序列完全一致，将其转入肌细胞内测得有酪氨酸羟化酶表达。 结论 本研究结果为帕金森病的基因治疗提供了有价值的新工具。
, 百拇医药
CLONGING AND EXPRESSION FOR DNA FRAGMENT OF CATALYTICDOMAIN OF HUMAN TYROSINE HYDROXYLASE
Chen Hong, Zhang Chengbo, Xu Qunyuan*Δ， Zheng Shaopeng*，Zhao Chunli*
(Dapartment of Biochemistry,*Beijing Institute for Neurosciences,Capital University of Medical Sciences)
【Abstract】 Objective In order to obtain catalytic core of human tyrosine hydroxylase(TH) cDNA and observe its expression.Methods The full-length of cDNA from human TH was used as template and the specific oilgonucleotide primers were designed for Polymerase Chain Reaction(PCR).An eukaryotic vector,plasmid pCMVTHC was then constructed.The newly constructed pCMVTHC was transfected in vitro to the cultured primary muscle cells from the rat after DNA sequence analysis.The expression of TH was tested by using a method of immunocytochemistry.Results The cDNA fragment containing a catalytic domain of human TH(THC) with encoded N-terminal removal of 145 amino acid residues was harvested.An eukaryotic vector,plasmid pCMVTHC was then proved correct.DNA sequence analysis indicated that the inserted fragment was consistent with that of human TH mRNA.The expression of TH was shown in muscle cells by immunocytochemistry analysis.Conclusion The results of the present study may provide a new way for gene therapy of Parkinsonism.
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【Key words】 Tyrosine hydroxylase; Mutagenesis; Catalytic domain
酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH;EC 1、14、16、2)是儿茶酚胺类神经递质即多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素生物合成过程所需的限速酶，它以四氢生物喋呤啶(BH4)为辅酶，催化酪氨酸的羟化而生成多巴(DOPA)[1]。已知在患帕金森病(Parkinson disease,PD)时，脑内多巴胺(dopamine,DA)的减少与此酶活性低下有关[2]。因此对PD模型动物来说，若将TH基因植入脑内，便可以提高脑内DA水平而达到基因治疗目的[3]。
从上述机制可以看出，植入脑内的外源性TH基因能否高效表达酶的活性是基因治疗PD有无疗效的关键。近年来，Walker等[4]用突变法证实了大鼠TH分子是由N-端调节结构域和C-端催化结构域所组成的。他发现，如切去部分N-端，即剩下C-端催化核心蛋白，其活性比全酶可高出1.8～2.5倍。
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因此我们设想，如果能获得人TH催化核心的cDNA片段，将其克隆到表达载体并转入真核细胞内，使其能表达出酶的催化核心序列，则应得到高催化活性的酪氨酸羟化酶；若将转有此类基因的细胞引入脑内，就会比通常所用的TH全酶基因更有效。
材料和方法
1. 获取人TH催化结构域cDNA片段
根据大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列[4～6]，推导出人TH所对应的催化结构域的碱基部位，并设计出特定的引物，包括：(1)5’端引物(25bp)为：5’CGAAGCTTATGGCCGCCCTGC-TCAG 3'，其中含有限制性内切酶Hind Ⅲ位点、起始密码子及人TH2146～150氨基酸残基密码子；(2)3’端引物(26bp)为：5’CCTCTAGACTAGCCAATGGCACTCAG 3’，含有限制性内切酶XbaⅠ位点、终止密码子及人TH2终止密码子前面5个氨基酸残基的密码子。上述引物寡聚核苷酸由赛百盛生物工程公司合成。
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以质粒pRrchTH(Somatix Therapy Corporation 提供)上人的全长TH2cDNA为模板，用耐热多聚酶DyNAzyme NDA Polymerase (Finnzymes Oy 提供)催化PCR扩增反应，共进行25次循环(包括94℃下变性1min和68℃下退火及延伸1.5min)，从而获得N-端缺失145个氨基酸的人TH催化结构域(catalytic domain of TH,THC)的cDNA片段(THCcDNA)。
2. 构建表达质粒pCMVTHC
先将PCR扩增后获得的产物进行乙醇沉淀，再经过PURIGEN试剂盒(天象人生物工程公司)回收，得到纯化的目的基因THCcDNA，定向插入质粒载体pRcCMV(购自Invitrogen Co)内以构建表达质粒pCMVTHC。构建方法如图1所示：
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图1 质粒pCMVTHC的构建路径 H.Hind Ⅲ X.Xba Ⅰ S.ScaⅠ
Fig.1 A Strategy of pCMVTHC reconstruction . H:Hind Ⅲ, X:XbaⅠ, S:ScaⅠ
进行定向连接反应后，用质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞；经转化后的大肠杆菌置于含AmpR的LB琼脂板上，在37℃中生长16h。从中随机挑选12个克隆，用煮沸法小量提取质粒DNA[5]，用限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ和ScaⅠ进行酶切和电泳分析，以验证重组质粒是否携带有目的基因及基因插入方向；经确认正确后，用碱裂法大量制备质粒pCMVTHC以用于基因转移及插入DNA序列分析。
3. 分析THcCDNA序列
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已确认正确的重组质粒pCMVTHC，用双脱氧法对外源性目的基因进行DNA序列分析(由赛百盛生物工程公司测定)。
4. 原代骨骼肌细胞的培养及基因转移
取新生SD大鼠四肢部的骨骼肌按已报道的方法[3]进行原代细胞培养，培养到第2～3d时用于DNA转移。
用脂质体Lipofectin (Gibco/BRL)介导转染外源性目的基因。即于转染前24h，将原代骨骼肌细胞接种于培养皿中，使40%～60%的细胞融合；再将新构建的质粒pCMVTHC和Lipofectin分别用无血清培养基Opti-MEM(Gibco/BRL)稀释至100μl；将两种溶液逐滴混合后，加到原代培养骨骼肌细胞中，置于37℃、5%CO2条件下培养4～6h后，再换入含15%小牛血清和85%MEM的正常鼠肌细胞培养基内，放入培养箱内培养。
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用与上述相同的方法和程序将质粒pRcCMV转入大鼠原代骨骼肌细胞内作为对照。
5. 检测培养细胞THC的表达
转染48～72h后，用免疫组织化学方法检测培养细胞的TH\-C表达。即用小鼠抗人TH2单克隆抗体(1∶5 000，Sigma Bio Science)、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶300，中山生物技术公司)和HRP标记的抗生物素复合物(1∶300，中山生物技术公司)，按照SP法显示THC免疫活性。
结 果
1. 人THCcDNA的获得
在对所设计的特定引物进行PCR扩增后，得到了编码N-端缺失145个氨基酸的人TH催化结构域的cDNA(THCcDNA)，其片段长度为1.05kb(图2)，片段两端含有HindⅢ和XbaⅠ酶的识别位点。
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2. 质粒pCMVTHC的构建及鉴定
分别将质粒载体pRcCMV(5.446kb)和目的基因THCcDNA(1.05kb)用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行消化，产生带有酶切末端相匹配的5.34kb的质粒载体片段及1.05kb的目的基因片段(图3)；经琼脂糖凝胶电泳分离及PURIGENE试剂盒纯化后定向连接、转化，得到重组的质粒pCMVTHC，长度为6.40kb(用HindⅢ单酶切显示)；用HindⅢ、XbaⅠ双酶切分析，显示有5.34kb和1.05kb片段，说明质粒含有THcCDNA片段的插入；再用XbaⅠ、ScaⅠ双酶切鉴定基因插入方向，产生4.0kb和2.4kb两个片段，证明重组质粒中THC基因插入方向正确(图4)。
3. THcCDNA序列分析
, 百拇医药 由于质粒载体pRcCMV中的polylinker两侧具有T7和Sp6通用序列，因此在切去polylinker、插入THC基因后所形成的重组质粒pCMVTHC可以直接作为测序质粒，用双脱氧法对插入片段进行DNA序列分析，再与人THmRNA相应序列(genebank 91120)比较，测序结果与THmRNA相应序列完全一致。
4. 被转染肌细胞的基因表达
用脂质体Lipofectin介导转染新构建的pCMVTHC后，继续培养48～72h，所有原代培养肌细胞分化成肌管细胞。它们中间30%～40%细胞免疫组织化学染色呈棕色，提示有THC序列的表达(图5)，未转染上外源基因的肌管细胞在同一张片子上呈淡粉色(本底)。
同期转染不含THC基因的质粒pRCCMV于肌细胞内，继续培养48～72h后，进行免疫组织化学染色，所有肌细胞均未被染色(图6)，证明检测基因表达的方法是可靠的。
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图2 电泳鉴定PCR产物：2.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker);1、3、4、PCR产物：1.05kb片段
Fig.2 The electrophoretic analysis for PCR product:2. λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker);1,3,4.PCR products:1.05kb fragment
图3 纯化后质粒载体pRcCMV片段和目的基因片段：1.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；2.目的基因THCcDNA/HindⅢ，XbaⅠ双酶切产生1.05kb片段；3.质粒载体pRcCMV/HindⅢ，XbaⅠ双酶切产生5.34kb片段；4.λ DNA/HindⅢ(Marker)
Fig.3 Purified fragment of pRcCMV vector and target gene:1.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ (Marker);2.THCcDNA/HindⅢ，XbaⅠ 1.05kb purified fragment;3.pRcCMV/HindⅢ,XbaⅠ 5.34kb purified fragment;4.λ DNA/HindⅢ (Marker)
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图4 酶切图谱鉴定重组体 1.pCMVTHC质粒；2.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；3.pRcCMV/HindⅢ单酶切，产生5.45kb片段；4.pCMVTHC/XbaⅠ,Sca Ⅰ双酶切，正向插入产生4.0和2.4kb片段；5.pCMVTHC/HindⅢ,XbaⅠ双酶切，产生5.34和1.05kb片段；6.pCMVTHC/HindⅢ单酶切，产生6.40kb片段
Fig.4 The electrophoretic analysis for reconstruction:1.plasmid pCMVTHC;2.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker);3.pRcCMV/HindⅢ 5.45kb fragment 4.pCMVTHC/XbaⅠ,ScaⅠ 4.0 and 2.4kb fragment;5.pCMVTHC.HindⅢ,XbaⅠ 5.34 and 1.05kb fragments; 6.pCMVTHC/Hind Ⅲ 6.40kb fragment
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图5 用含TH催化核心序列的pCMVTHC转染骨骼肌细胞，进行免疫组织化学染色后，表达THC序列的细胞呈棕色
Fig.5 The cultured muscle cells were transfected by plasmid pCMVTHC.The cells appeared brown showing THC expression with immunohistochemical staining.
图6 用质粒pRcCMV转染骨骼肌细胞，进行免疫组织化学染色后，肌细胞未被染色
Fig.6 The cultured muscle cells were transfected by plasmid pRCCMV.There were no dyeing in cells with immunohistochemical staining.
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讨 论
已有报道，对TH用蛋白酶进行限制性水解(limited proteolysis)可以提高酶的活性[5]。近年来，Abate等[6，7]用胰蛋白酶对大鼠和牛的TH从N-端进行部分水解，得到了比全酶催化活性更高的34kD催化活性片段，同时他们发现此片段具有催化结构域但不含N-端磷酸化调节位点。这说明，野生型酶一旦切去了包含磷酸化位点的N-端调节区域，TH酶就将被解除抑制作用而成为有活性的形式。
Walker和Daubner等[4，8]通过大肠杆菌表达系统及PCR扩增技术，构建并克隆了一系列N-端缺失和C-端缺失的大鼠TH突变体蛋白基因，从而精确地界定了大鼠TH调节结构域和催化结构域的位置。通过对转基因细胞的表达产物进行研究发现，仅含N-端的突变体蛋白具有依赖PKA的磷酸化位点，但没有催化活性；相反，切去部分N-端(NΔ165)的突变体蛋白不能被磷酸化，但其催化活性比全酶高1.8～2.5倍、Km降低50%、Ki上升10倍左右[4，9]。由此可见，TH分子是由N-端调节结构域和C-端催化结构域组成。Kaufman等[1，9，10]提出了真核生物中存在有TH的翻译后调控(post-translational regulation)机制，推测TH的N-端调节结构域对酶活性起抑制作用。即TH全酶可与其反馈抑制剂儿茶酚胺类化合物紧密结合，从而限制了酶与底物的结合，使酶处于很低的活性状态；相反，如切去包括磷酸化位点在内的调节结构域，可引起酶的构象改变，有利于底物进入酶的活性中心，激活酶的催化活性。
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Nagatsu[11]将人TH与其他哺乳动物TH的分子结构进行比较，发现不同动物的TH氨基酸顺序存在着高度保守性，它们都包含着可被蛋白激酶磷酸化的调节结构域以及可与底物酪氨酸、分子氧和辅因子四氢喋啶(BH4)结合并具有催化活性的催化结构域。我们在已知大鼠TH催化结构域的氨基酸序列及其对应的DNA碱基序列基础上，推导出人TH所对应的催化结构域的碱基部位，设计出特定的引物，再以人TH2cDNA作为模板进行PCR扩增，得到具有活性的编码N-端缺失的人TH催化结构域DNA片段，测序结果也证明了这一看法的正确性。
与其他哺乳动物只含有1种TH不同，人的TH含有4种亚型，即TH1、TH2、TH3和TH4。与TH1cDNA相比，其他3种THcDNA在90～91碱基之间分别具有12、81和93bp的插入序列，在4种同功酶中以TH1催化活性最高，另外3种只及其0.3～0.4倍。其原因据推测是由于这些插入序列的存在抑制了酶的活性[12]，而4种同功酶的催化核心序列则可能完全相同。本实验以TH2cDNA为模板进行PCR扩增所得到的N-端缺失145个氨基酸的TH催化核心序列，由于消除了插入序列的抑制作用，所以应较能激活酶的活性。
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我们选择了质粒pRcCMV作为载体，克隆TH催化核心，即新构建的重组体pCMVTHC内含有巨细胞病毒(CMV)启动子。已有证据表明，CMV可以增强TH基因在哺乳类细胞中的表达[13]，我们的研究说明，CMV启动子与THC基因可以结合在一起共同发挥作用。
同样，在我们的实验中，脂质体Lipofectin也可用作转染介质，将重组体pCMVTHC转入原代培养肌细胞内，而原代培养骨骼肌细胞已被证明可以在脑内存活并高效表达所转入的基因[14，15]。由此可见，改变了结构的外源性基因并没有影响到其在真核细胞内的转染效率。
本实验采用免疫组织化学法对转基因肌细胞的表达产物进行检测，这虽能在免疫学上检测到外源性目的基因的表达，但还不能说明表达的产物一定具有生物学功能——酶的催化活性。为此，我们将采用酶学方法对TH催化核心蛋白进行检测并与转有TH全酶基因的肌细胞表达产物进行对照，以确定此种突变体蛋白是否具有酶的催化活性及活性的高低，为基因治疗PD提供更可靠的手段。
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本实验得到了田竟生、张进禄、鲁强、刘玉军同志的指导和帮助，特此致谢。
参考文献
[1]Kaufman S.Tyrosine hydroxylase.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1995,70:103
[2]Goldstein M,Lieberman A.The role of the regulatory enzymes of catecholamine synthesis in Parkinson disease.Neurology,1992,42(4 supple 4):8
[3]徐群渊，田竟生，张进禄,等.体外转基因肌细胞植入帕金森病模型大鼠脑内的研究.中华外科杂志，1997，35(1)：5
[4]Walker SJ,Liu X,Roskoski R,et al.Catalytic core of rat tyrosine hydroxylase:terminal deletion analysis of bacterially expressed enzyme.Biochim Biophs Acta,1994,1206(1):113
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[5]Kuczenski R.Rat brain tyrosine hydroxylase:Activation by limited tryptic proteolysis.J Biol Chem,1973,248(7):2261
[6]Abate C,Joh TH.Limited proteolysis of rat brain tyrosine hydroxylase defines and N-terminal region required for regulation of cofactor binding and directing substrate specificity.J Mol Neurosci,1992,2(4):203
[7]Abate C,Smith JA,Joh TH.Charaterization of the catalytic domain of bovine adrenal tyrosine hydroxylase.Biochem Biophys Res Comm,1988,151(3):1446
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[8]Daubner SC,Lohse DL,Fitzpatrick PF.Expression and characterization of catalytic and regulatory domain of rat tyrosine hydroxylase.Protein Sci,1993,2(9):1452
[9]Ribeiro P,Wang Y,Citron BA,et al.Deletion mutagenesis of rat PC12 tyrosine hydroxylase regulatory and catalytic domains.J Mol Neurosci,1993,4(2):125
[10]Kumer SC,Vrana KE.Intricate regulation of tyrosine hydroxylase activity and gene expression.J Neurochem,1996,67(2):443
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[11]Nagatsu T,Ichinose H.Comparative studies on the structure of human tyrosine hydroxylase with those of the enzyme of various mammals.Comp Biochem Physical,1991,98(1):203
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[13]MacGregor GR,Caskey CT.Construction of plasmids that express E.Coli galactosidase in mammalian cell.Nucleic Acid Res,1989,17(6):2365
[14]张进禄，徐群渊，郑少鹏,等.体外培养骨骼肌细胞脑内存活的研究.解剖学报，1996，27(1)：7
[15]田竟生，郑少鹏.基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用.中华医学杂志，1997，77(7)：556, http://www.100md.com(陈红 张澄波 徐群渊*郑少鹏* 赵春礼*)
单位：首都医科大学生物化学教研室；*北京神经科学研究所，北京 100054
关键词：酪氨酸羟化酶；诱变；催化结构域
解剖学报990203 【摘要】 目的 获得编码人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)催化核心cDNA片段，并观察其表达。方法 采用人的全长THcDNA为模板，设计特定的引物进行PCR扩增反应并构建真核表达载体——质粒pCMVTHC。在对目的片段测序后，将重组质粒转染到大鼠原代培养骨骼肌细胞内，用免疫组织化学方法检测其表达。 结果 获得了编码N-端缺失145个氨基酸的酪氨酸羟化酶催化结构域的cDNA片段，其表达载体构建正确。插入片段的DNA序列与人THmRNA相应序列完全一致，将其转入肌细胞内测得有酪氨酸羟化酶表达。 结论 本研究结果为帕金森病的基因治疗提供了有价值的新工具。
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CLONGING AND EXPRESSION FOR DNA FRAGMENT OF CATALYTICDOMAIN OF HUMAN TYROSINE HYDROXYLASE
Chen Hong, Zhang Chengbo, Xu Qunyuan*Δ， Zheng Shaopeng*，Zhao Chunli*
(Dapartment of Biochemistry,*Beijing Institute for Neurosciences,Capital University of Medical Sciences)
【Abstract】 Objective In order to obtain catalytic core of human tyrosine hydroxylase(TH) cDNA and observe its expression.Methods The full-length of cDNA from human TH was used as template and the specific oilgonucleotide primers were designed for Polymerase Chain Reaction(PCR).An eukaryotic vector,plasmid pCMVTHC was then constructed.The newly constructed pCMVTHC was transfected in vitro to the cultured primary muscle cells from the rat after DNA sequence analysis.The expression of TH was tested by using a method of immunocytochemistry.Results The cDNA fragment containing a catalytic domain of human TH(THC) with encoded N-terminal removal of 145 amino acid residues was harvested.An eukaryotic vector,plasmid pCMVTHC was then proved correct.DNA sequence analysis indicated that the inserted fragment was consistent with that of human TH mRNA.The expression of TH was shown in muscle cells by immunocytochemistry analysis.Conclusion The results of the present study may provide a new way for gene therapy of Parkinsonism.
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【Key words】 Tyrosine hydroxylase; Mutagenesis; Catalytic domain
酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH;EC 1、14、16、2)是儿茶酚胺类神经递质即多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素生物合成过程所需的限速酶，它以四氢生物喋呤啶(BH4)为辅酶，催化酪氨酸的羟化而生成多巴(DOPA)[1]。已知在患帕金森病(Parkinson disease,PD)时，脑内多巴胺(dopamine,DA)的减少与此酶活性低下有关[2]。因此对PD模型动物来说，若将TH基因植入脑内，便可以提高脑内DA水平而达到基因治疗目的[3]。
从上述机制可以看出，植入脑内的外源性TH基因能否高效表达酶的活性是基因治疗PD有无疗效的关键。近年来，Walker等[4]用突变法证实了大鼠TH分子是由N-端调节结构域和C-端催化结构域所组成的。他发现，如切去部分N-端，即剩下C-端催化核心蛋白，其活性比全酶可高出1.8～2.5倍。
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因此我们设想，如果能获得人TH催化核心的cDNA片段，将其克隆到表达载体并转入真核细胞内，使其能表达出酶的催化核心序列，则应得到高催化活性的酪氨酸羟化酶；若将转有此类基因的细胞引入脑内，就会比通常所用的TH全酶基因更有效。
材料和方法
1. 获取人TH催化结构域cDNA片段
根据大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列[4～6]，推导出人TH所对应的催化结构域的碱基部位，并设计出特定的引物，包括：(1)5’端引物(25bp)为：5’CGAAGCTTATGGCCGCCCTGC-TCAG 3'，其中含有限制性内切酶Hind Ⅲ位点、起始密码子及人TH2146～150氨基酸残基密码子；(2)3’端引物(26bp)为：5’CCTCTAGACTAGCCAATGGCACTCAG 3’，含有限制性内切酶XbaⅠ位点、终止密码子及人TH2终止密码子前面5个氨基酸残基的密码子。上述引物寡聚核苷酸由赛百盛生物工程公司合成。
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以质粒pRrchTH(Somatix Therapy Corporation 提供)上人的全长TH2cDNA为模板，用耐热多聚酶DyNAzyme NDA Polymerase (Finnzymes Oy 提供)催化PCR扩增反应，共进行25次循环(包括94℃下变性1min和68℃下退火及延伸1.5min)，从而获得N-端缺失145个氨基酸的人TH催化结构域(catalytic domain of TH,THC)的cDNA片段(THCcDNA)。
2. 构建表达质粒pCMVTHC
先将PCR扩增后获得的产物进行乙醇沉淀，再经过PURIGEN试剂盒(天象人生物工程公司)回收，得到纯化的目的基因THCcDNA，定向插入质粒载体pRcCMV(购自Invitrogen Co)内以构建表达质粒pCMVTHC。构建方法如图1所示：
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图1 质粒pCMVTHC的构建路径 H.Hind Ⅲ X.Xba Ⅰ S.ScaⅠ
Fig.1 A Strategy of pCMVTHC reconstruction . H:Hind Ⅲ, X:XbaⅠ, S:ScaⅠ
进行定向连接反应后，用质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞；经转化后的大肠杆菌置于含AmpR的LB琼脂板上，在37℃中生长16h。从中随机挑选12个克隆，用煮沸法小量提取质粒DNA[5]，用限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ和ScaⅠ进行酶切和电泳分析，以验证重组质粒是否携带有目的基因及基因插入方向；经确认正确后，用碱裂法大量制备质粒pCMVTHC以用于基因转移及插入DNA序列分析。
3. 分析THcCDNA序列
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已确认正确的重组质粒pCMVTHC，用双脱氧法对外源性目的基因进行DNA序列分析(由赛百盛生物工程公司测定)。
4. 原代骨骼肌细胞的培养及基因转移
取新生SD大鼠四肢部的骨骼肌按已报道的方法[3]进行原代细胞培养，培养到第2～3d时用于DNA转移。
用脂质体Lipofectin (Gibco/BRL)介导转染外源性目的基因。即于转染前24h，将原代骨骼肌细胞接种于培养皿中，使40%～60%的细胞融合；再将新构建的质粒pCMVTHC和Lipofectin分别用无血清培养基Opti-MEM(Gibco/BRL)稀释至100μl；将两种溶液逐滴混合后，加到原代培养骨骼肌细胞中，置于37℃、5%CO2条件下培养4～6h后，再换入含15%小牛血清和85%MEM的正常鼠肌细胞培养基内，放入培养箱内培养。
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用与上述相同的方法和程序将质粒pRcCMV转入大鼠原代骨骼肌细胞内作为对照。
5. 检测培养细胞THC的表达
转染48～72h后，用免疫组织化学方法检测培养细胞的TH\-C表达。即用小鼠抗人TH2单克隆抗体(1∶5 000，Sigma Bio Science)、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶300，中山生物技术公司)和HRP标记的抗生物素复合物(1∶300，中山生物技术公司)，按照SP法显示THC免疫活性。
结 果
1. 人THCcDNA的获得
在对所设计的特定引物进行PCR扩增后，得到了编码N-端缺失145个氨基酸的人TH催化结构域的cDNA(THCcDNA)，其片段长度为1.05kb(图2)，片段两端含有HindⅢ和XbaⅠ酶的识别位点。
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2. 质粒pCMVTHC的构建及鉴定
分别将质粒载体pRcCMV(5.446kb)和目的基因THCcDNA(1.05kb)用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行消化，产生带有酶切末端相匹配的5.34kb的质粒载体片段及1.05kb的目的基因片段(图3)；经琼脂糖凝胶电泳分离及PURIGENE试剂盒纯化后定向连接、转化，得到重组的质粒pCMVTHC，长度为6.40kb(用HindⅢ单酶切显示)；用HindⅢ、XbaⅠ双酶切分析，显示有5.34kb和1.05kb片段，说明质粒含有THcCDNA片段的插入；再用XbaⅠ、ScaⅠ双酶切鉴定基因插入方向，产生4.0kb和2.4kb两个片段，证明重组质粒中THC基因插入方向正确(图4)。
3. THcCDNA序列分析
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4. 被转染肌细胞的基因表达
用脂质体Lipofectin介导转染新构建的pCMVTHC后，继续培养48～72h，所有原代培养肌细胞分化成肌管细胞。它们中间30%～40%细胞免疫组织化学染色呈棕色，提示有THC序列的表达(图5)，未转染上外源基因的肌管细胞在同一张片子上呈淡粉色(本底)。
同期转染不含THC基因的质粒pRCCMV于肌细胞内，继续培养48～72h后，进行免疫组织化学染色，所有肌细胞均未被染色(图6)，证明检测基因表达的方法是可靠的。
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图2 电泳鉴定PCR产物：2.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker);1、3、4、PCR产物：1.05kb片段
Fig.2 The electrophoretic analysis for PCR product:2. λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker);1,3,4.PCR products:1.05kb fragment
图3 纯化后质粒载体pRcCMV片段和目的基因片段：1.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；2.目的基因THCcDNA/HindⅢ，XbaⅠ双酶切产生1.05kb片段；3.质粒载体pRcCMV/HindⅢ，XbaⅠ双酶切产生5.34kb片段；4.λ DNA/HindⅢ(Marker)
Fig.3 Purified fragment of pRcCMV vector and target gene:1.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ (Marker);2.THCcDNA/HindⅢ，XbaⅠ 1.05kb purified fragment;3.pRcCMV/HindⅢ,XbaⅠ 5.34kb purified fragment;4.λ DNA/HindⅢ (Marker)
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图4 酶切图谱鉴定重组体 1.pCMVTHC质粒；2.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；3.pRcCMV/HindⅢ单酶切，产生5.45kb片段；4.pCMVTHC/XbaⅠ,Sca Ⅰ双酶切，正向插入产生4.0和2.4kb片段；5.pCMVTHC/HindⅢ,XbaⅠ双酶切，产生5.34和1.05kb片段；6.pCMVTHC/HindⅢ单酶切，产生6.40kb片段
Fig.4 The electrophoretic analysis for reconstruction:1.plasmid pCMVTHC;2.λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker);3.pRcCMV/HindⅢ 5.45kb fragment 4.pCMVTHC/XbaⅠ,ScaⅠ 4.0 and 2.4kb fragment;5.pCMVTHC.HindⅢ,XbaⅠ 5.34 and 1.05kb fragments; 6.pCMVTHC/Hind Ⅲ 6.40kb fragment
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图5 用含TH催化核心序列的pCMVTHC转染骨骼肌细胞，进行免疫组织化学染色后，表达THC序列的细胞呈棕色
Fig.5 The cultured muscle cells were transfected by plasmid pCMVTHC.The cells appeared brown showing THC expression with immunohistochemical staining.
图6 用质粒pRcCMV转染骨骼肌细胞，进行免疫组织化学染色后，肌细胞未被染色
Fig.6 The cultured muscle cells were transfected by plasmid pRCCMV.There were no dyeing in cells with immunohistochemical staining.
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讨 论
已有报道，对TH用蛋白酶进行限制性水解(limited proteolysis)可以提高酶的活性[5]。近年来，Abate等[6，7]用胰蛋白酶对大鼠和牛的TH从N-端进行部分水解，得到了比全酶催化活性更高的34kD催化活性片段，同时他们发现此片段具有催化结构域但不含N-端磷酸化调节位点。这说明，野生型酶一旦切去了包含磷酸化位点的N-端调节区域，TH酶就将被解除抑制作用而成为有活性的形式。
Walker和Daubner等[4，8]通过大肠杆菌表达系统及PCR扩增技术，构建并克隆了一系列N-端缺失和C-端缺失的大鼠TH突变体蛋白基因，从而精确地界定了大鼠TH调节结构域和催化结构域的位置。通过对转基因细胞的表达产物进行研究发现，仅含N-端的突变体蛋白具有依赖PKA的磷酸化位点，但没有催化活性；相反，切去部分N-端(NΔ165)的突变体蛋白不能被磷酸化，但其催化活性比全酶高1.8～2.5倍、Km降低50%、Ki上升10倍左右[4，9]。由此可见，TH分子是由N-端调节结构域和C-端催化结构域组成。Kaufman等[1，9，10]提出了真核生物中存在有TH的翻译后调控(post-translational regulation)机制，推测TH的N-端调节结构域对酶活性起抑制作用。即TH全酶可与其反馈抑制剂儿茶酚胺类化合物紧密结合，从而限制了酶与底物的结合，使酶处于很低的活性状态；相反，如切去包括磷酸化位点在内的调节结构域，可引起酶的构象改变，有利于底物进入酶的活性中心，激活酶的催化活性。
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Nagatsu[11]将人TH与其他哺乳动物TH的分子结构进行比较，发现不同动物的TH氨基酸顺序存在着高度保守性，它们都包含着可被蛋白激酶磷酸化的调节结构域以及可与底物酪氨酸、分子氧和辅因子四氢喋啶(BH4)结合并具有催化活性的催化结构域。我们在已知大鼠TH催化结构域的氨基酸序列及其对应的DNA碱基序列基础上，推导出人TH所对应的催化结构域的碱基部位，设计出特定的引物，再以人TH2cDNA作为模板进行PCR扩增，得到具有活性的编码N-端缺失的人TH催化结构域DNA片段，测序结果也证明了这一看法的正确性。
与其他哺乳动物只含有1种TH不同，人的TH含有4种亚型，即TH1、TH2、TH3和TH4。与TH1cDNA相比，其他3种THcDNA在90～91碱基之间分别具有12、81和93bp的插入序列，在4种同功酶中以TH1催化活性最高，另外3种只及其0.3～0.4倍。其原因据推测是由于这些插入序列的存在抑制了酶的活性[12]，而4种同功酶的催化核心序列则可能完全相同。本实验以TH2cDNA为模板进行PCR扩增所得到的N-端缺失145个氨基酸的TH催化核心序列，由于消除了插入序列的抑制作用，所以应较能激活酶的活性。
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我们选择了质粒pRcCMV作为载体，克隆TH催化核心，即新构建的重组体pCMVTHC内含有巨细胞病毒(CMV)启动子。已有证据表明，CMV可以增强TH基因在哺乳类细胞中的表达[13]，我们的研究说明，CMV启动子与THC基因可以结合在一起共同发挥作用。
同样，在我们的实验中，脂质体Lipofectin也可用作转染介质，将重组体pCMVTHC转入原代培养肌细胞内，而原代培养骨骼肌细胞已被证明可以在脑内存活并高效表达所转入的基因[14，15]。由此可见，改变了结构的外源性基因并没有影响到其在真核细胞内的转染效率。
本实验采用免疫组织化学法对转基因肌细胞的表达产物进行检测，这虽能在免疫学上检测到外源性目的基因的表达，但还不能说明表达的产物一定具有生物学功能——酶的催化活性。为此，我们将采用酶学方法对TH催化核心蛋白进行检测并与转有TH全酶基因的肌细胞表达产物进行对照，以确定此种突变体蛋白是否具有酶的催化活性及活性的高低，为基因治疗PD提供更可靠的手段。
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本实验得到了田竟生、张进禄、鲁强、刘玉军同志的指导和帮助，特此致谢。
参考文献
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