人肿瘤转移抑制基因真核细胞表达质粒的构建
作者：文杰* 张世馥 李守柔
单位：文杰* 张世馥 李守柔 中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所细胞生物室，*白求恩医科大学第二临床医院妇产科，长春，130021
关键词：人肿瘤转移抑制基因；基因重组
解剖学报990221 【摘要】 目的 构建人肿瘤转移抑制基因NM23-H1与真核表达载体PcDNA3.1/Zero的重组体。 方法 利用分子生物学克隆技术从质粒puc18中酶切回收900bp的人NM23-H1基因片段，与PcDNA3.1/Zero构成重组体，并根据表达载体与克隆基因核苷酸序列中酶切位点分析、鉴定插入片段的正反连接。 结果 酶切得到900bp的NM23-H1基因片段，5.0kb质粒载体，两者相连构建成重组体PcDNA.NM23，利用Pst Ⅰ酶切位点确认PstI酶切后得到4条带的重组体为正向连接。 结论 人真核细胞表达质粒PcDNA.NM23成功构建，为卵巢癌基因治疗提供了部分实验基础。
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STRUCTURE OF RECOMBINANT FROM HUMAN
NON-METASTATIC GENE AND MAMMALIAN
EXPRESSING VECTOR PcDNA3.1/Zero
Wen Jie*, Zhang ShifuΔ, Li Shourou*
(Department of Cell Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing;*Department of Gynecology and Obstetrics, The Second Clinical Hospital, Bethune Medical College, Changchun)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To develop a somatic gene therapy system for ovarian carcinoma treatment, we constructed a human non-metastatic gene(NM23-H1) expressing vector in ovarian carcinoma cells. Methods PUC18-NM23-H1 was treated with BamH1 to release the 900bp fragment. PcDNA3.1/Zero was digested with BamH1, releasing a 5.0kb fragment, NM23-H1(0.9kb) fragment was ligated to the vector PcDNA3.1/Zero(5.0kb). Results 900bp fragment and 5.0kb vector obtained by BamH1 digesting were connected with T4 DNA ligase to produce recombinant PcDNA.NM23. According to the enzymatic site PstⅠ, the positive oriention of the recombinant could be digested into four different fragments by PstⅠ. Conclusion The successful construction of PcDNA*NM could provide a rational basis for the gene therapy of ovarian carcinoma.
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【Key words】 Human non-metastatic gene; DNA recombination
卵巢癌是难于早期诊断的妇科恶性肿瘤，大部分病例诊断时已存在广泛的微小转移，给手术、化疗带来很大困难，以致死亡率居高不下。随着分子生物学技术的发展，人们设想利用肿瘤抑制基因治疗卵巢癌。NM23-H1基因是近几年来克隆出的与肿瘤转移相关的抑癌基因[1]。国外已有报道转染人NM23-H1的乳腺癌细胞有抑制肿瘤转移的能力[2]。本研究策略是利用分子生物学技术将带有人NM23-H1基因的表达质粒转染高转移卵巢癌细胞HO-8910[3]，探讨其对肿瘤转移的抑制作用，为卵巢癌基因治疗提供实验依据。本文报道NM23-H1表达质粒的构建及其鉴定。
材料和方法
1.质粒、菌株和试剂
, 百拇医药
质粒puc18含有人NM23-H1全长cDNA序列基因，由北京医科大学病理室赠送，质粒pcDNA3.1/Zero(中国医学科学院基础所生物化学实验室黄炳仁教授赠送)，大肠杆菌DH5α由中国医学科学院基础医学研究所提供，各种限制性内切酶，T4DNA连接酶等分别购自Promega公司、Sigma公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
2.重组体的构建
2.1 质粒的制备：按本实验室常规方法小量或大量提取，并用聚已二醇纯化质粒。
(1)质粒的小量提取 取1.5ml菌液置于1.5ml Eppendorf管中，10 000g×30s，弃上清，控尽，加溶液I(50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)100μl，重悬菌体，加溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH、1%SDS)200μl倒转混匀，加溶液Ⅲ150μl(5mol/L KAc 60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml)，10 000g×5min，转移上清至另一Ep管中，加等体积平衡酚混匀，室温离心，5 000g×5min，小心吸取上清，并转移至另一Ep管，勿将蛋白层吸出。等体积氯仿：酚抽提1次，离心，5 000g×5min，转移上清至另一Ep管中，加2.5体积的无水乙醇，混匀，置-20℃ 1h，离心，10 000g×15min，弃上清，留沉淀，70%乙醇洗1次，离心，8 000g×10min，弃上清，留沉淀，加TE(pH8.0)20μl，溶解沉淀。加RNase A(10mg/ml)3～5μl，混匀，37℃水浴30min，置-20℃保存待用。
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(2)质粒的大量提取及纯化 将已扩增好的菌液500ml 4℃离心，4 000g×10min，弃上清，沉淀加10ml溶液Ⅰ和20mg溶菌酶，充分振摇，混匀。加溶液Ⅱ20ml，缓慢颠倒离心管数次以充分混匀内容物，室温放置5～10min，加15ml用冰预冷的溶液Ⅲ，摇动离心管数次以混匀内容物，置冰浴10min，4℃离心，8 000g×10min。将上清转移至一50ml离心管中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置20min。4℃离心，10 000g×10min，弃上清，加2ml TE溶解沉淀。加2ml用冰预冷的5ml 5 mol/L LiCL溶液混匀。4℃离心，10 000g×10min。弃上清，70%乙醇洗1次，控干液体，沉淀溶于4mlTE(pH8.0)中，加RNase A 30μl，37℃水浴30min，加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG8 000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，4℃ 12 000g×5min，回收质粒DNA，吸出上清，加400μl TE溶解质粒DNA沉淀，加等体积氯仿：酚抽提，离心5 000g×5min，回收上层水相，加1/10体积10mol/L NaAc，充分混匀，加2倍体积乙醇，室温放置10min，4℃离心，12 000g×5min，回收沉淀的质粒DNA。吸出上清，加70%乙醇200μl，稍加振荡，4℃离心，12 000g×2，用500μl TE溶解沉淀，置-20℃保存。
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2.2 质粒的限制性内切酶解及片段回收：
酶解缓冲体系为50～100μl，DNA<100ng，限制性内切酶为3～5IU/μl，置37水浴反应1h。酶解后在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，并用DEAE纤维素纸插片法回收DNA片段。
3.DNA重组
3.1 带有插入片段的重组体筛选：感受态菌的制备、转化实验按常规方法进行[4]。随机挑选转化单菌落培养后小量制备质粒DNA，采用限制性内切酶结合质粒酶切图谱筛选阳性克隆。
3.2 重组体正反向连接鉴定：选择插入片段及表达质粒上共有的，且不同于连接位点的酶切点PstⅠ对重组进行酶切，根据酶切片段大小，鉴定正、反向连接。
结果和讨论
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1.重组体的构建及筛选
从puc18上用BamH1切下0.9kb左右的人NM23-H1基因片段，DEAE纤维素纸插片法回收0.9kb基因片段，再以BamH1酶切表达质粒PcDNA3.1/Zero。将上述两酶切产物进行连接，重组体命名为PcDNA.NM。(图1)
图1 质粒PcDNA.NM构建示意
Fig.1 Construction of the plasmid PcDNA.NM
将此重组体PcDNA.NM转化大肠杆菌DH5α，用BamH1对重组体进行酶切鉴定，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳可得2条大小分别为5.0kb、0.9kb片段，与原质粒插入片段大小一致。结果见图2。
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图2 质粒PcDNA.NM酶切鉴定
Fig.2 Identification of the plasmid PcDNA.NM
1.DNA marker λDNA/Hind Ⅲ
2.PcDNA3.1/Zero
3.PcDNA.NM/BamH1
4.PUC18-NM23-H1
5.PUC18-NM23-H1/BamH1
2.重组体正、反向连接的鉴定
分析人NM23-H1核苷酸序列及表达载体PcDNA3.1/Zero的多克隆酶切位点，选择Pst Ⅰ酶切鉴定。人重组体插入片段中含有3个 Pst Ⅰ酶切位点，正向连接酶切后可得4条大小分别为5.0kb、66bp、324bp、508bp左右4个片段，结果见图3，反向连接酶切后可得大小为5.3kb、324bp、66bp、183bp4个片段，与理论相符。测定正向重组序列与文献一致[5]，未发现碱基缺失或突变。然后大量制备质粒，以便下一步转染卵巢癌细胞。
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图3 质粒PcDNA.NM酶切鉴定正向连接
Fig.2 Identification of the orientation of the
recombinant with restriction enzymes
1.DNA marker λDNA/Hind Ⅲ
2.PcDNA.NM/Pst Ⅰ
3.PcDNA.NM
4.pBR322/BstN Ⅰ
本课题目的是获得能够在人卵巢癌细胞中高表达的NM23-H1质粒。因此我们选择了带有CMV启动子的高表达载体PcDNA 3.1/Zero用于重组体的构建。从Puc18上获得的nm23\|H1基因片段两端均为BamH1酶切位点，因此构建中存在正反连接问题。本研究根据目的基因核苷酸序列酶切位点分析发现该序列中存在另外一个与PcDNA3.1/Zero表达质粒相同的酶切位点PstI，所以选择再一次酶切，根据酶切片段数目、大小即可鉴定正向性连接。就本实验研究中所用载体及目的基因来看，两次选用两种不同的酶酶切重组体筛选克隆，鉴定正反连接简便快捷。同时本实验也体会到重组体构建中，表达质粒PcDNA/Zero BamH1酶切后为线状质粒DNA，先用牛小肠碱性磷酸酶(ALP)去磷酸化，然后与目的基因片段连接，可以减少载体自连，提高连接效率。
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卵巢癌是高转移肿瘤，临床上化疗、手术等方法都不能彻底根治转移。研究与卵巢癌转移相关的基因，可以从分子水平更深入探讨转移机制、抑制转移的方法，进而改变卵巢癌治疗。含有转移抑制基因NM23-H1的重组体的构建是这一研究的基础。本研究成功地构建了表达载体PcDNA.NM，为卵巢癌基因治疗提供了部分实验基础。有关PCDNA*NM在真核细胞中表达的研究仍在进行中。
收稿1998-04 修回1998-11
参考文献
[1]Steeg P S, Bevilacqa G, Kopper L, et al. Evidence for a new gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst, 1988, 80(),200
[2]Alvaro L, Ursula F, Kenneth V, et al. Transfection of human nm23-H1 into the human MDA-MB-435 breast carcinoma cell enzymatic activity. Oncogene, 1993, 8,2325
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[3]许沈华，牟瀚洲.高转移人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性.中华病理学杂志，1996，25(1)：33
[4]Sambrood J, Fritsch E E, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor. Laboratory, 1989:33
[5]Rosengard A M, Krutzsch H C, Shearn A, et al. Reduced NM23/Awd protein in tumor metastasis and aberrant Drosophila development. Nature, 1989,342:177, 百拇医药
单位：文杰* 张世馥 李守柔 中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所细胞生物室，*白求恩医科大学第二临床医院妇产科，长春，130021
关键词：人肿瘤转移抑制基因；基因重组
解剖学报990221 【摘要】 目的 构建人肿瘤转移抑制基因NM23-H1与真核表达载体PcDNA3.1/Zero的重组体。 方法 利用分子生物学克隆技术从质粒puc18中酶切回收900bp的人NM23-H1基因片段，与PcDNA3.1/Zero构成重组体，并根据表达载体与克隆基因核苷酸序列中酶切位点分析、鉴定插入片段的正反连接。 结果 酶切得到900bp的NM23-H1基因片段，5.0kb质粒载体，两者相连构建成重组体PcDNA.NM23，利用Pst Ⅰ酶切位点确认PstI酶切后得到4条带的重组体为正向连接。 结论 人真核细胞表达质粒PcDNA.NM23成功构建，为卵巢癌基因治疗提供了部分实验基础。
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STRUCTURE OF RECOMBINANT FROM HUMAN
NON-METASTATIC GENE AND MAMMALIAN
EXPRESSING VECTOR PcDNA3.1/Zero
Wen Jie*, Zhang ShifuΔ, Li Shourou*
(Department of Cell Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing;*Department of Gynecology and Obstetrics, The Second Clinical Hospital, Bethune Medical College, Changchun)
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【Abstract】 Objective To develop a somatic gene therapy system for ovarian carcinoma treatment, we constructed a human non-metastatic gene(NM23-H1) expressing vector in ovarian carcinoma cells. Methods PUC18-NM23-H1 was treated with BamH1 to release the 900bp fragment. PcDNA3.1/Zero was digested with BamH1, releasing a 5.0kb fragment, NM23-H1(0.9kb) fragment was ligated to the vector PcDNA3.1/Zero(5.0kb). Results 900bp fragment and 5.0kb vector obtained by BamH1 digesting were connected with T4 DNA ligase to produce recombinant PcDNA.NM23. According to the enzymatic site PstⅠ, the positive oriention of the recombinant could be digested into four different fragments by PstⅠ. Conclusion The successful construction of PcDNA*NM could provide a rational basis for the gene therapy of ovarian carcinoma.
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【Key words】 Human non-metastatic gene; DNA recombination
卵巢癌是难于早期诊断的妇科恶性肿瘤，大部分病例诊断时已存在广泛的微小转移，给手术、化疗带来很大困难，以致死亡率居高不下。随着分子生物学技术的发展，人们设想利用肿瘤抑制基因治疗卵巢癌。NM23-H1基因是近几年来克隆出的与肿瘤转移相关的抑癌基因[1]。国外已有报道转染人NM23-H1的乳腺癌细胞有抑制肿瘤转移的能力[2]。本研究策略是利用分子生物学技术将带有人NM23-H1基因的表达质粒转染高转移卵巢癌细胞HO-8910[3]，探讨其对肿瘤转移的抑制作用，为卵巢癌基因治疗提供实验依据。本文报道NM23-H1表达质粒的构建及其鉴定。
材料和方法
1.质粒、菌株和试剂
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质粒puc18含有人NM23-H1全长cDNA序列基因，由北京医科大学病理室赠送，质粒pcDNA3.1/Zero(中国医学科学院基础所生物化学实验室黄炳仁教授赠送)，大肠杆菌DH5α由中国医学科学院基础医学研究所提供，各种限制性内切酶，T4DNA连接酶等分别购自Promega公司、Sigma公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
2.重组体的构建
2.1 质粒的制备：按本实验室常规方法小量或大量提取，并用聚已二醇纯化质粒。
(1)质粒的小量提取 取1.5ml菌液置于1.5ml Eppendorf管中，10 000g×30s，弃上清，控尽，加溶液I(50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)100μl，重悬菌体，加溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH、1%SDS)200μl倒转混匀，加溶液Ⅲ150μl(5mol/L KAc 60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml)，10 000g×5min，转移上清至另一Ep管中，加等体积平衡酚混匀，室温离心，5 000g×5min，小心吸取上清，并转移至另一Ep管，勿将蛋白层吸出。等体积氯仿：酚抽提1次，离心，5 000g×5min，转移上清至另一Ep管中，加2.5体积的无水乙醇，混匀，置-20℃ 1h，离心，10 000g×15min，弃上清，留沉淀，70%乙醇洗1次，离心，8 000g×10min，弃上清，留沉淀，加TE(pH8.0)20μl，溶解沉淀。加RNase A(10mg/ml)3～5μl，混匀，37℃水浴30min，置-20℃保存待用。
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(2)质粒的大量提取及纯化 将已扩增好的菌液500ml 4℃离心，4 000g×10min，弃上清，沉淀加10ml溶液Ⅰ和20mg溶菌酶，充分振摇，混匀。加溶液Ⅱ20ml，缓慢颠倒离心管数次以充分混匀内容物，室温放置5～10min，加15ml用冰预冷的溶液Ⅲ，摇动离心管数次以混匀内容物，置冰浴10min，4℃离心，8 000g×10min。将上清转移至一50ml离心管中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置20min。4℃离心，10 000g×10min，弃上清，加2ml TE溶解沉淀。加2ml用冰预冷的5ml 5 mol/L LiCL溶液混匀。4℃离心，10 000g×10min。弃上清，70%乙醇洗1次，控干液体，沉淀溶于4mlTE(pH8.0)中，加RNase A 30μl，37℃水浴30min，加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG8 000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，4℃ 12 000g×5min，回收质粒DNA，吸出上清，加400μl TE溶解质粒DNA沉淀，加等体积氯仿：酚抽提，离心5 000g×5min，回收上层水相，加1/10体积10mol/L NaAc，充分混匀，加2倍体积乙醇，室温放置10min，4℃离心，12 000g×5min，回收沉淀的质粒DNA。吸出上清，加70%乙醇200μl，稍加振荡，4℃离心，12 000g×2，用500μl TE溶解沉淀，置-20℃保存。
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2.2 质粒的限制性内切酶解及片段回收：
酶解缓冲体系为50～100μl，DNA<100ng，限制性内切酶为3～5IU/μl，置37水浴反应1h。酶解后在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，并用DEAE纤维素纸插片法回收DNA片段。
3.DNA重组
3.1 带有插入片段的重组体筛选：感受态菌的制备、转化实验按常规方法进行[4]。随机挑选转化单菌落培养后小量制备质粒DNA，采用限制性内切酶结合质粒酶切图谱筛选阳性克隆。
3.2 重组体正反向连接鉴定：选择插入片段及表达质粒上共有的，且不同于连接位点的酶切点PstⅠ对重组进行酶切，根据酶切片段大小，鉴定正、反向连接。
结果和讨论
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1.重组体的构建及筛选
从puc18上用BamH1切下0.9kb左右的人NM23-H1基因片段，DEAE纤维素纸插片法回收0.9kb基因片段，再以BamH1酶切表达质粒PcDNA3.1/Zero。将上述两酶切产物进行连接，重组体命名为PcDNA.NM。(图1)
图1 质粒PcDNA.NM构建示意
Fig.1 Construction of the plasmid PcDNA.NM
将此重组体PcDNA.NM转化大肠杆菌DH5α，用BamH1对重组体进行酶切鉴定，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳可得2条大小分别为5.0kb、0.9kb片段，与原质粒插入片段大小一致。结果见图2。
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图2 质粒PcDNA.NM酶切鉴定
Fig.2 Identification of the plasmid PcDNA.NM
1.DNA marker λDNA/Hind Ⅲ
2.PcDNA3.1/Zero
3.PcDNA.NM/BamH1
4.PUC18-NM23-H1
5.PUC18-NM23-H1/BamH1
2.重组体正、反向连接的鉴定
分析人NM23-H1核苷酸序列及表达载体PcDNA3.1/Zero的多克隆酶切位点，选择Pst Ⅰ酶切鉴定。人重组体插入片段中含有3个 Pst Ⅰ酶切位点，正向连接酶切后可得4条大小分别为5.0kb、66bp、324bp、508bp左右4个片段，结果见图3，反向连接酶切后可得大小为5.3kb、324bp、66bp、183bp4个片段，与理论相符。测定正向重组序列与文献一致[5]，未发现碱基缺失或突变。然后大量制备质粒，以便下一步转染卵巢癌细胞。
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图3 质粒PcDNA.NM酶切鉴定正向连接
Fig.2 Identification of the orientation of the
recombinant with restriction enzymes
1.DNA marker λDNA/Hind Ⅲ
2.PcDNA.NM/Pst Ⅰ
3.PcDNA.NM
4.pBR322/BstN Ⅰ
本课题目的是获得能够在人卵巢癌细胞中高表达的NM23-H1质粒。因此我们选择了带有CMV启动子的高表达载体PcDNA 3.1/Zero用于重组体的构建。从Puc18上获得的nm23\|H1基因片段两端均为BamH1酶切位点，因此构建中存在正反连接问题。本研究根据目的基因核苷酸序列酶切位点分析发现该序列中存在另外一个与PcDNA3.1/Zero表达质粒相同的酶切位点PstI，所以选择再一次酶切，根据酶切片段数目、大小即可鉴定正向性连接。就本实验研究中所用载体及目的基因来看，两次选用两种不同的酶酶切重组体筛选克隆，鉴定正反连接简便快捷。同时本实验也体会到重组体构建中，表达质粒PcDNA/Zero BamH1酶切后为线状质粒DNA，先用牛小肠碱性磷酸酶(ALP)去磷酸化，然后与目的基因片段连接，可以减少载体自连，提高连接效率。
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卵巢癌是高转移肿瘤，临床上化疗、手术等方法都不能彻底根治转移。研究与卵巢癌转移相关的基因，可以从分子水平更深入探讨转移机制、抑制转移的方法，进而改变卵巢癌治疗。含有转移抑制基因NM23-H1的重组体的构建是这一研究的基础。本研究成功地构建了表达载体PcDNA.NM，为卵巢癌基因治疗提供了部分实验基础。有关PCDNA*NM在真核细胞中表达的研究仍在进行中。
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参考文献
[1]Steeg P S, Bevilacqa G, Kopper L, et al. Evidence for a new gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst, 1988, 80(),200
[2]Alvaro L, Ursula F, Kenneth V, et al. Transfection of human nm23-H1 into the human MDA-MB-435 breast carcinoma cell enzymatic activity. Oncogene, 1993, 8,2325
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[3]许沈华，牟瀚洲.高转移人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性.中华病理学杂志，1996，25(1)：33
[4]Sambrood J, Fritsch E E, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor. Laboratory, 1989:33
[5]Rosengard A M, Krutzsch H C, Shearn A, et al. Reduced NM23/Awd protein in tumor metastasis and aberrant Drosophila development. Nature, 1989,342:177, 百拇医药