绿色荧光蛋白在大鼠骨骼肌中的表达
作者：田竟生 赵春礼 郑少鹏 商永磊 潘海燕
单位：田竟生 赵春礼 郑少鹏 商永磊 潘海燕 首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100054
关键词：绿色荧光蛋白；骨骼肌细胞；大鼠
解剖学报990217
【摘要】 目的 研究绿色荧光蛋白(GFP)在哺乳动物细胞中的表达。 方法 制备了含绿色荧光蛋白基因的重组DNA，经脂质体(lipofectin)法转染培养的大鼠骨骼肌细胞，用共聚焦显微镜观察GFP的表达。 结果 大约20%～30%的骨骼肌细胞呈现不同强度的绿色荧光。 结论 GFP是研究活细胞生命现象的一种新途径。
GFP EXPRESSION IN MUSCLE CELLS OF RATS
, http://www.100md.com
Tian Jingsheng, Zhao Chunli, Zheng Shaopeng, Shang Yonglei,Pan Haiyan
(Beijing Institute for Neurosciences, Capital University of Medical Sciences, Beijing)
【Abstract】 Objective The expression of green fluorescent protein(GFP) in mammalian cells was studied. Methods The recombinant DNA containing GFP gene was prepared and transfected into the rat muscle cells in culture using lipofectin method. The expression product of GFP gene was observed by confocal microscope. Results About 20%-30% of living muscle cells expresses the product and appears different density of green fluorescent under confocal microscope. Conclusion GFP can be used as a new approach for studies of life sciences.
, 百拇医药
【Key words】 GFP; Muscle cell; Rat
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是从发光水母(Aeguorea Vietoria)分离出来的一种荧光蛋白，它在蓝光(主峰400nm，次峰475nm)或紫外光激发的条件下可自发绿色荧光，并由此而得名。GFP由238个氨基酸组成，分子量约为27kD，它所发射的绿色荧光主峰为509nm，肩峰为540nm，该荧光十分稳定，没有漂白现象[1]。GFP色基来自其主要的氨基酸即丝氨酸(serine)-去氢酪氨酸(dehydrotyrosine)-甘氨酸(glycine)在六肽中的环化。对GFP色基改造以加强荧光强度，已成为人们关注的热点。Rizzuto等[2]首先利用DNA重组技术，成功构建了含GFP的重组体，即以巨细胞病毒(CMV)为启动子将GFP cDNA插入真核表达载体Pc DNA-1中，转染HeLa细胞和原代培养的神经细胞等均获成功，其后又将野生型GFP (Wt-GFP)进行改造，将发光色基中的Ser65变成Thr65，形成了突变型GFP (mt-GFP)，即GPFS65T以增强其荧光强度。本研究将此由水母发光蛋白构建的突变型GFPS65T行体外扩增，提取质粒DNA，转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞，用共聚焦显微镜观察GFP在活体骨骼肌中的表达，进而提示GFP是研究活细胞生命现象的一种新途径。
, 百拇医药
材料和方法
1.材料
质粒pGFP65T由Rizzuto Rosario教授(University of Padova, Italy)惠赠，其内含有GFPS65T基因的cDNA(1.0kb)，克隆于PcDNA-1质粒载体的EcoRI/XhoI酶切位点。Geneclean试剂盒购自Bio101公司，Lipotectin试剂盒购自GIBCO/BRL公司，Matrigel购自Collaborative Biomedical Produce公司，Percoll购自Sigma公司，其他试剂为国产分析纯。SD大鼠由本校实验动物部提供。
2.质粒DNA的制备
GFPS65T转化菌体外扩增，采用常规碱裂解法制备质粒DNA，并经Geneclean试剂盒纯化，回收DNA片段。
, 百拇医药
3.大鼠骨骼肌细胞的原代培养
取新生SD大鼠的四肢肌肉，剪碎，用0.16%胰酶和0.08%胶原酶消化，经Percoll密度梯度离心后铺盘培养，基质为Matrigel，培养液为DMEM/F12加10%胎牛血清。
4.脂质体Lipofectin介导的转染实验
按照Gibco公司的试剂盒及其说明书进行。
5.观察方法
共聚焦显微镜(Mendian Instrument Inc产品)激光光源，选用蓝色光(400nm)为激发光，滤光片条件与异硫氰酸胍(FITC)相同，该仪器由中医研究院针灸所提供。
结果和讨论
大鼠骨骼肌在原代培养过程中再现分化的全过程，呈现以下3个时相的变化，经Percoll分离纯化的骨骼肌干细胞(卫星细胞)在接种3d内为梭形的单个核的成肌细胞；4～5d内融合为管状多核的肌管细胞；5～7d形成多核的可收缩的终末型骨骼肌细胞(图1)。
, 百拇医药
突变型GFP (pGFP65T)DNA在脂质体(lipofectin)介导下，转染48h后用共聚焦显微镜观察GFP在骨骼肌细胞中的表达，镜下可见绿色荧光分布在骨骼肌细胞的胞浆内，约20%～30%的细胞出现。胞浆内荧光强度不同，可分为+、++、+++、++++4个等级。强阳性一般出现在多核的骨骼肌细胞中，这与其时相变化相一致(图2～4)。
本研究结果表明，突变型绿色荧光蛋白基因(GFP65T)可在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中表达，这与Rizzuto等[2，3]的结果相似。我们还观察到GFP在终末分化的骨骼肌细胞中表达水平高于成肌细胞和肌管细胞，这一现象可能与培养过程中骨骼肌分化过程相关，即随着培养时间的推进，表达GFP的细胞会自发融合而导致荧光的增强。至于外源基因尤其是以质粒DNA形式构建成功的重组体，为何更易在骨骼肌中表达尚待探讨。近年人们试图对GFP色基的结构进行改造，通过点突变使之发射更强的荧光[4]。“人化”改造[5]——用人tRNA编码的密码子取代水母来源的序列，构成pGren Lantern质粒，使GFP应用日趋扩大，它不但可在体外表达，而且还在体内表达。
, 百拇医药
图1 5～7d肌管细胞融合成大的肌纤维并具有收缩功能 ×250
Fig.1 After 5-7days, the myotube fused into large myotube that can contract.×250
图2 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(++)
Fig.2 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(++).
图3 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(+++)
Fig.3 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(+++).
, 百拇医药
图4 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(++++)
Fig.4 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(++++).
参考文献
[1]Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994, 263(5148):802
[2]Rizzuto R, Brini M, Pizzo P, et al. Chimeric Green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol, 1995, 5(6):635
, 百拇医药
[3]Gubi AN, Reddy B, Njoroge JM,et al. Long-term stable expression of Green fluorescent protein in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 236(2):347
[4]Siemering KR, Golbik R, Sever R, et al. Mutations that suppress the thermosensitivity of Green fluorescent protein Curr Biol, 1996,6(12)1653
[5]Evans K, Hawley-Nelson P, Schifferli K, et al. p Green LanternTM-1, a superior Green fluorescent protein, mammalian cell transfection reporter. Focus, 1996, 18(2):40, 百拇医药
单位：田竟生 赵春礼 郑少鹏 商永磊 潘海燕 首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100054
关键词：绿色荧光蛋白；骨骼肌细胞；大鼠
解剖学报990217
【摘要】 目的 研究绿色荧光蛋白(GFP)在哺乳动物细胞中的表达。 方法 制备了含绿色荧光蛋白基因的重组DNA，经脂质体(lipofectin)法转染培养的大鼠骨骼肌细胞，用共聚焦显微镜观察GFP的表达。 结果 大约20%～30%的骨骼肌细胞呈现不同强度的绿色荧光。 结论 GFP是研究活细胞生命现象的一种新途径。
GFP EXPRESSION IN MUSCLE CELLS OF RATS
, http://www.100md.com
Tian Jingsheng, Zhao Chunli, Zheng Shaopeng, Shang Yonglei,Pan Haiyan
(Beijing Institute for Neurosciences, Capital University of Medical Sciences, Beijing)
【Abstract】 Objective The expression of green fluorescent protein(GFP) in mammalian cells was studied. Methods The recombinant DNA containing GFP gene was prepared and transfected into the rat muscle cells in culture using lipofectin method. The expression product of GFP gene was observed by confocal microscope. Results About 20%-30% of living muscle cells expresses the product and appears different density of green fluorescent under confocal microscope. Conclusion GFP can be used as a new approach for studies of life sciences.
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【Key words】 GFP; Muscle cell; Rat
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是从发光水母(Aeguorea Vietoria)分离出来的一种荧光蛋白，它在蓝光(主峰400nm，次峰475nm)或紫外光激发的条件下可自发绿色荧光，并由此而得名。GFP由238个氨基酸组成，分子量约为27kD，它所发射的绿色荧光主峰为509nm，肩峰为540nm，该荧光十分稳定，没有漂白现象[1]。GFP色基来自其主要的氨基酸即丝氨酸(serine)-去氢酪氨酸(dehydrotyrosine)-甘氨酸(glycine)在六肽中的环化。对GFP色基改造以加强荧光强度，已成为人们关注的热点。Rizzuto等[2]首先利用DNA重组技术，成功构建了含GFP的重组体，即以巨细胞病毒(CMV)为启动子将GFP cDNA插入真核表达载体Pc DNA-1中，转染HeLa细胞和原代培养的神经细胞等均获成功，其后又将野生型GFP (Wt-GFP)进行改造，将发光色基中的Ser65变成Thr65，形成了突变型GFP (mt-GFP)，即GPFS65T以增强其荧光强度。本研究将此由水母发光蛋白构建的突变型GFPS65T行体外扩增，提取质粒DNA，转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞，用共聚焦显微镜观察GFP在活体骨骼肌中的表达，进而提示GFP是研究活细胞生命现象的一种新途径。
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材料和方法
1.材料
质粒pGFP65T由Rizzuto Rosario教授(University of Padova, Italy)惠赠，其内含有GFPS65T基因的cDNA(1.0kb)，克隆于PcDNA-1质粒载体的EcoRI/XhoI酶切位点。Geneclean试剂盒购自Bio101公司，Lipotectin试剂盒购自GIBCO/BRL公司，Matrigel购自Collaborative Biomedical Produce公司，Percoll购自Sigma公司，其他试剂为国产分析纯。SD大鼠由本校实验动物部提供。
2.质粒DNA的制备
GFPS65T转化菌体外扩增，采用常规碱裂解法制备质粒DNA，并经Geneclean试剂盒纯化，回收DNA片段。
, 百拇医药
3.大鼠骨骼肌细胞的原代培养
取新生SD大鼠的四肢肌肉，剪碎，用0.16%胰酶和0.08%胶原酶消化，经Percoll密度梯度离心后铺盘培养，基质为Matrigel，培养液为DMEM/F12加10%胎牛血清。
4.脂质体Lipofectin介导的转染实验
按照Gibco公司的试剂盒及其说明书进行。
5.观察方法
共聚焦显微镜(Mendian Instrument Inc产品)激光光源，选用蓝色光(400nm)为激发光，滤光片条件与异硫氰酸胍(FITC)相同，该仪器由中医研究院针灸所提供。
结果和讨论
大鼠骨骼肌在原代培养过程中再现分化的全过程，呈现以下3个时相的变化，经Percoll分离纯化的骨骼肌干细胞(卫星细胞)在接种3d内为梭形的单个核的成肌细胞；4～5d内融合为管状多核的肌管细胞；5～7d形成多核的可收缩的终末型骨骼肌细胞(图1)。
, 百拇医药
突变型GFP (pGFP65T)DNA在脂质体(lipofectin)介导下，转染48h后用共聚焦显微镜观察GFP在骨骼肌细胞中的表达，镜下可见绿色荧光分布在骨骼肌细胞的胞浆内，约20%～30%的细胞出现。胞浆内荧光强度不同，可分为+、++、+++、++++4个等级。强阳性一般出现在多核的骨骼肌细胞中，这与其时相变化相一致(图2～4)。
本研究结果表明，突变型绿色荧光蛋白基因(GFP65T)可在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中表达，这与Rizzuto等[2，3]的结果相似。我们还观察到GFP在终末分化的骨骼肌细胞中表达水平高于成肌细胞和肌管细胞，这一现象可能与培养过程中骨骼肌分化过程相关，即随着培养时间的推进，表达GFP的细胞会自发融合而导致荧光的增强。至于外源基因尤其是以质粒DNA形式构建成功的重组体，为何更易在骨骼肌中表达尚待探讨。近年人们试图对GFP色基的结构进行改造，通过点突变使之发射更强的荧光[4]。“人化”改造[5]——用人tRNA编码的密码子取代水母来源的序列，构成pGren Lantern质粒，使GFP应用日趋扩大，它不但可在体外表达，而且还在体内表达。
, 百拇医药
图1 5～7d肌管细胞融合成大的肌纤维并具有收缩功能 ×250
Fig.1 After 5-7days, the myotube fused into large myotube that can contract.×250
图2 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(++)
Fig.2 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(++).
图3 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(+++)
Fig.3 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(+++).
, 百拇医药
图4 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(++++)
Fig.4 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(++++).
参考文献
[1]Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994, 263(5148):802
[2]Rizzuto R, Brini M, Pizzo P, et al. Chimeric Green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol, 1995, 5(6):635
, 百拇医药
[3]Gubi AN, Reddy B, Njoroge JM,et al. Long-term stable expression of Green fluorescent protein in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 236(2):347
[4]Siemering KR, Golbik R, Sever R, et al. Mutations that suppress the thermosensitivity of Green fluorescent protein Curr Biol, 1996,6(12)1653
[5]Evans K, Hawley-Nelson P, Schifferli K, et al. p Green LanternTM-1, a superior Green fluorescent protein, mammalian cell transfection reporter. Focus, 1996, 18(2):40, 百拇医药