实验性脾虚证大鼠胰岛细胞的免疫组织化学研究*
作者：王秀琴 尚宏伟 曾晓蓓 孟庆峰 王兴翠 杨进
单位：王秀琴 尚宏伟 曾晓蓓 孟庆峰 王兴翠 杨进(首都医科大学组织学胚胎学教研室，北京 100054)
关键词：胰岛细胞；实验性脾虚证；免疫组织化学；大鼠
解剖学报990316
【摘要】 目的 研究实验性脾虚证大鼠胰岛细胞胰岛素、胰岛淀粉样多肽、胰高血糖素和生长抑素分泌活动的变化，探讨中医学脾虚证发病与胰岛激素分泌活动的关系。 方法 用Wistar雄性成年大鼠24只，分为正常对照组、实验性脾虚组、自然恢复组和中药治疗组。4组动物同时麻醉处死，取胰尾固定于Bouin液，制成石蜡切片。用免疫组织化学法显示胰岛B细胞胰岛素和胰岛淀粉样多肽、A细胞胰高血糖素和D细胞生长抑素，并用显微分光光度计对免疫染色强度进行了定量测定。 结果 与对照组相比，脾虚组胰岛B细胞胰岛素和A细胞胰高血糖素免疫染色明显减弱，而D细胞生长抑素和B细胞胰岛淀粉样多肽免疫染色明显增强。 结论 上述结果提示，胰岛细胞激素分泌活动失常可能与脾虚证代谢异常有密切关系。
, 百拇医药
IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY ON THE PANCREATIC
ISLET CELLS IN EXPERIMENTAL SPLEEN
DEFICIENCY SYNDROME OF RATS
Wang XiuqinΔ, Shang Hongwei, Zeng Xiaobei, Meng Qingfeng, Wang Xingcui, Yang Jin
(Department of Histology and Embryology,Capital University of Medical Sciences,Beijing)
【Abstract】 Objective To study the relationship between the islet hormonal secretory activity and the pathogenesis of spleen deficiency syndrome in Chinese traditional medicine.Methods The changes of secretory activity of insulin(Ins), islet amyloid polypeptide (IAPP),glucagon(Glu) and somatostatin (SOM) in pancreatic islet cells of experimental spleen dificiency syndrome rats were observed by immunohistochemical technique.24 adult male Wistar rats were divided into 4 groups:(1)normal control group; (2)experimental spleen deficiency syndrome group induced by rhubarb combined with imbalance of food supply;(3) therapeutic group treated with Chinese herbs-“Plus Si Jun Zi Decoction”,and (4) self-recovery group,that is,the syndrom was induced but without medical treatment.The tail portions of pancreas were taken and prepared for immunohistochemical demonstration of A cells (for Glu),B cells(for Ins and IAPP) and D cells (for SOM).The immunoreactivity of the above mentioned cells were measured by microspectrophotometry.Results As compared with the normal control,the immunereactivity of Ins in B cells and Glu in A cells of the experimental spleen deficiency syndrome group is obviously declined, while IAPP in B cells and SOM in D cells are apparently elevated.Conclusion This study suggests that the disorder of islet cell secretory activity seems to be intimately related to the metabolic abnormality in the spleen deficiency syndrome.
, 百拇医药
【Key words】 Pancreatic islet cells; Experimental spleen deficiency syndrome; Immunohistochemistry; Rat
近年对脾虚证患者和实验性脾虚证动物的研究表明，脾虚证是一组比较集中反映“脾”功能低下和紊乱的综合征候群[1]。脾虚证患者和动物模型的能量代谢、糖和蛋白质代谢以及食物消化和吸收均有明显变化。有研究表明，实验性脾虚证时血糖水平的调节能力下降，血糖浓度处于较低水平[2]。另有研究证明，胰岛激素与某些内脏疾患恢复过程相关[3，4]。但脾虚证时胰岛激素分泌活动有无变化，尚未见研究。为此，我们应用免疫组织化学法和显微分光光度计定量测定法，从形态学角度探讨实验性脾虚证大鼠胰岛细胞激素的变化，以了解胰岛内分泌活动与脾虚证的关系。
材料和方法
, 百拇医药
1. 动物分组及标本制备
成年雄性Wistar大鼠(Ⅱ级动物，中国医学科学院实验动物繁育场提供)24只，体重130～150g，分为4组：对照组5只、实验性脾虚组(脾虚组)7只、自然恢复组5只、中药治疗组(治疗组)7只。脾虚组用破气苦降药与饮食失节相结合的方法，制成脾虚证模型。破气苦降药成分剂量按厚朴∶枳实∶大黄为3∶3∶3的比例，冷水浸泡20min，煮沸20min，过滤浓缩成100%煎剂(含生药1 000g/L煎剂)，隔日灌服2次/d，3ml/次(药量为生药2g/100g体重)。喂药当日禁食，次日正常饮食，喂养42d，致成脾虚证模型。对照组按脾虚组给药法灌服自来水，3ml/次，但饮食不限，饲养42d。治疗组在动物致脾虚后，用加味四君子汤治疗，汤剂成分的剂量按灸黄芪∶党参∶茯苓∶炒白术∶灸甘草为2∶2∶2∶2∶1的比例，制成100%煎剂(含生药1 000g/L煎剂)，隔日灌服，2次/d，3ml/次(相当于生药1.5g/100g体重)，正常饮食，喂养21d。自然恢复组在动物致脾虚后，按治疗组给药法隔日灌服自来水，2次/d，3ml/次，正常饮食，喂养21d。
, 百拇医药
4组动物同时取材，取材前禁食12h。腹腔注射6%水合氯醛(0.5ml/100g体重)麻醉，心脏取血处死。取胰尾入Bouin液固定，按常规制成6μm厚的石蜡切片，在相同条件下同时进行免疫组织化学染色。
2. 免疫组织化学染色
2.1 胰岛B细胞染色：切片脱蜡入水，入3%甲醇-H2O2，室温30min,PBS洗；入正常羊血清(1∶20)，室温30min；隔片滴加兔抗胰岛素(Ins)抗血清(1∶100，美国Zymed公司)，室温30min，PBS洗，邻片滴加兔抗胰岛淀粉样多肽(IAPP)抗血清(1∶4 000，美国Peninsula公司)，4℃过夜，PBS洗。滴加HRP标记的羊抗兔IgG，室温10min，PBS洗；滴加H2O2-AEC(aminoethyl carbazole)显色剂(6A、6B、6C各1滴加入1ml蒸馏水中)(美国Zymed公司)，室温10min;蒸馏水洗，封片剂封片。
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2.2 胰岛A细胞和D细胞染色：前面步骤同上。隔片滴加兔抗胰高血糖素(Glu)抗血清(1∶100，美国Zymed公司)，相邻切片滴加兔抗生长抑素(SOM)抗血清(1∶100，美国Zymed公司)，4℃过夜：PBS洗。滴加生物素标记的羊抗兔IgG，37℃ 30min,PBS洗；滴加HRP标记的链霉卵白素，37℃ 30min；滴加DAB显色剂(DAB 6mg溶于0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)20ml内，磁棒搅拌30min，加3%H2O2 40μl)室温10min。经自来水和蒸馏水洗，甘油明胶封片。
以上几种免疫组织化学染色，都用PBS代替第一抗体作阴性对照。
3. 显微分光光度计定量测定
用显微分光光度计(MPV-COM,Leica)在10×40放大倍数下测定细胞免疫染色强度。Ins-IR(免疫反应性)细胞和IAPP-IR细胞每组测5只动物，每只测50个细胞(1～2个胰岛)。Glu-IR细胞和SOM-IR细胞每组测5只动物，每只测30个细胞(2～5个胰岛)。将所测各组细胞的光密度(A)值进行方差分析。
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结果
1. 组织学观察
胰岛B细胞呈Ins和IAPP阳性，数量最多，大多呈团索状分布于胰岛中央部，也见一些细胞散在于胰腺泡之间。B细胞呈圆形、椭圆形、三角形或多角形。胞质内含Ins-IR或IAPP-IR红色产物；胞核呈圆形，不着色(图1，5)。A细胞呈Glu阳性，数量较B细胞少，分布于胰岛周边。细胞形状不规则，呈三角形、多边形或梭形，有的细胞可见短小突起(图9)，胰腺泡间也可见散在的A细胞。A细胞胞质内含Glu-IR棕黄色产物；胞核呈椭圆形，不着色。D细胞为SOM阳性，数目较少，分布于胰岛周边的A、B细胞之间，也见于胰岛中央B细胞之间(图11)。D细胞呈圆形或梭形，常见突起(图12)，胞质内含SOM-IR棕黄色产物；胞核卵圆形，不着色。4种免疫组织化学反应的对照切片均为阴性。
2. 免疫组织化学半定量和定量测定
, 百拇医药 根据免疫组织化学染色强度，将阳性细胞分为3级，即强阳性(+++，胞质充满IR产物，色深)、弱阳性(+，IR产物占胞质一半以下，色浅)和中等阳性(++，IR产物和着色介于强阳性和弱阳性之间)。对照组Ins阳性B细胞以强阳性和中等阳性者居多，弱阳性者少(图1)。与对照组相比，脾虚组Ins阳性B细胞以中等和弱阳性者较多，强阳性者少(图2)。与对照组和脾虚组相比，自然恢复组Ins中等阳性B细胞比对照组少，而比脾虚组多；弱阳性者比对照组多，但比脾虚组少(图3)。与脾虚组和自然恢复组相比，治疗组Ins强阳性和中等阳性B细胞多，弱阳性者少，接近于对照组(图4)。显微分光光度计定量测定显示，与对照组相比，脾虚组B细胞Ins反应明显减弱，有显著性差异(P<0.01)。自然恢复组B细胞Ins反应高于脾虚组，低于对照组和治疗组，差异显著(P<0.01)。治疗组Ins反应强度高于脾虚组和自然恢复组，与对照组接近，但两者之间仍有显著性差异(P<0.01)，表示还未恢复正常。IAPP阳性B细胞，对照组以中等阳性和弱阳性者较多，强阳性者少(图5)。与对照组相比，脾虚组IAPP阳性B细胞以强阳性和中等阳性者多，弱阳性者少(图6)。与对照组和脾虚组相比，自然恢复组IAPP阳性B细胞中等阳性者多于对照组，弱阳性者少于对照组，与脾虚组接近(图7)。与脾虚组和自然恢复组相比，治疗组IAPP阳性B细胞中等阳性者少，弱阳性者较多(图8)。显微分光光度计定量测定显示，脾虚组IAPP阳性B细胞反应强度明显高于对照组，差异有显著性(P<0.01)。自然恢复组IAPP阳性B细胞反应强度高于对照组和脾虚组，差异有显著性(P<0.01)。治疗组IAPP阳性B细胞反应强度高于对照组，而低于脾虚组和自然恢复组，但比自然恢复组更接近对照组，且与对照组相比仍有显著性差异(P<0.01)。
, 百拇医药
对照组Glu阳性A细胞以强阳性和中等阳性者较多，弱阳性者少(图9)。与对照组相比，脾虚组Glu阳性A细胞以中等阳性和弱阳性者较多(图10)。自然恢复组和治疗组Glu阳性A细胞，强阳性和中等阳性者比对照组和脾虚组多。显微分光光度计定量测定显示，脾虚组胰岛A细胞Glu反应强度低于对照组，差异有显著性(P<0.01)。自然恢复组和治疗组A细胞Glu反应强度都高于对照组和脾虚组(P<0.01)，表示尚未完全恢复，但治疗组更接近对照组。对照组SOM阳性D细胞以中等和弱阳性者多(图11)。与对照组相比，脾虚组SOM阳性D细胞以强阳性和中等阳性者较多，弱阳性者减少(图12)。自然恢复组和治疗组SOM阳性D细胞，强阳性和中等阳性者比对照组和脾虚组多。显微分光光度计定量测定显示，脾虚组SOM反应强于对照组，差异有显著性(P<0.01)。自然恢复组和治疗组SOM反应强于对照组和脾虚组(P<0.01)，表示并未完全恢复。以上各组免疫组织化学结果见表1，2。
表1 胰岛细胞免疫染色半定量测定
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Table 1 Semi-quantitative measurement of the immuneo-
staining in pancreatic islet cells 分组
group
胰岛素
B细胞
Ins B cells
胰岛淀粉样
多肽B细胞
IAPP B cells
胰高血糖素
A细胞
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Glu A cells
生长抑素
D细胞
SOM D cells
对照组
N-C group
++
+
++～+++
++
脾虚组
S-D group
+
, 百拇医药
+++
+～++
++～+++
自然恢复组
S-R group
+～++
++
+++
+++
治疗组
ther group
++
+～++
, 百拇医药
+++
+++
+++：示强阳性细胞多；++：示中等阳性细胞多；+：示弱阳性细胞多；
+++,the mark denotes strong positive cells are increased; ++,the mark denotes moderate positive cells are increased; +,the mark denotes weak positive cells are increased.
N-C group, normal control group; S-D group, spleen deficiency group; S-R group, self-recovery group; Ther group,therapeutic group.
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讨论
胰岛细胞胞质的分泌颗粒是激素的贮存所在。分泌颗粒的数量和免疫染色强度在一定程度上可反映激素的含量，也可反映细胞分泌活动的强弱。有研究证明，胰岛细胞瘤细胞分泌激素亢进时，细胞的免疫染色比正常胰岛细胞明显减弱[5]。这提示细胞激素释放增强时，免疫染色弱；细胞合成激素旺盛时，免疫染色强。故用显微分光光度计对内分泌细胞免疫染色进行定量测定，能够显示细胞内激素的含量变化[6]。本研究用免疫组织化学半定量和定量测定的结果表明，脾虚组B细胞内Ins和A细胞内Glu免疫染色产物含量低于对照组，提示激素释放活跃；而B细胞IAPP及D细胞SOM免疫染色产物含量高于对照组，提示激素合成活跃。治疗组Ins和Glu的免疫染色接近对照组，IAPP和SOM的免疫染色高于对照组，提示所用中药方剂对胰岛细胞激素分泌紊乱的改善作用在不同细胞之间存在差别，尚未完全恢复。自然恢复组几种激素的免疫染色变化较复杂，Ins低于对照组和治疗组，IAPP高于其他3组，Glu和SOM高于对照组和脾虚组，我们尚不能解释，有待今后研究。
, 百拇医药
表2 胰岛细胞免疫染色显微分光光度计定量测定(
±
)
Table 2 Quantitative measurement of the immunostaining in pancreatic islet
cells by microspectrophotometer(±) 抗血清
antiserum
动物只数
, http://www.100md.com
animals
number
细胞数
cells
number
对照组
N-C
group
脾虚组
S-D
group
自然恢复组
S-R
, http://www.100md.com
group
治疗组
ther. group
胰岛素
insulin
5
250
0.553±0.11
0.189±0.043*
0.298±0.078
0.474±0.091**
胰岛淀粉样多肽
, 百拇医药
islet amyloid
polypeptide
5
250
0.217±0.055
0.543±0.119*
0.621±0.133
0.445±0.151**
胰高血糖素
glucagon
5
, 百拇医药
150
0.468±0.096
0.259±0.067*
0.515±0.097
0.570±0.128**
生长抑素
somatostatin
5
150
0.235±0.094
0.347±0.093*
, 百拇医药
0.648±0.093
0.546±0.084**
：脾虚组与对照组相比，P<0.01；**：治疗组与对照组相比，P<0.01；
,as compared with normal cotrol group,P<0.01; **,as compared with normal control group,P<0.01.
胰岛B细胞分泌的Ins能促进肝细胞和肌细胞糖原合成，使血糖水平下调[7]。脾虚组Ins分泌增强，可能促进肝细胞糖原合成，使细胞内糖原贮存增多[8]，血糖下调，与已有的报道一致[9]。IAPP(又名amylin)与Ins共存于B细胞的分泌颗粒内，与Ins一起释放[10]。它可能与糖代谢的调节有密切关系，并参与血钙水平的调节[11]。正常状况下血浆IAPP含量约是Ins的10%，两者含量的波动呈平行关系。在某些代谢发生变化时，这两种激素合成和释放的相对量可发生明显改变，这在Ⅱ型糖尿病的发生中可能有重要意义[12]。本实验结果显示，对照组B细胞的Ins染色强，IAPP染色弱；脾虚组则与对照组相反，B细胞Ins染色弱而IAPP染色强。这提示脾虚组Ins与IAPP的比例发生了变化，可能与脾虚证的代谢失常有关，或许与糖代谢失常有密切关系。
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胰岛A细胞分泌的Glu主要作用是促进糖原分解和糖异生，使血糖上调[7]。已知低血糖和低氨基酸时能刺激Glu分泌[7]。本实验脾虚组A细胞Glu反应弱，提示Glu分泌活动增强，这可能是因为脾虚组血糖降低，而使A细胞Glu分泌增多，Glu可能通过提高肝糖原分解的关键酶葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)活性，促进糖原分解，使血糖上调。本室先前的工作[8]证明，脾虚组肝细胞G-6-Pase活性增强，可能与实验所见Glu分泌增多有关。Glu还可促进Ins分泌，并通过抑制胃酸分泌对胃粘膜起保护作用[13]。在本室多年的研究中，未发现脾虚证大鼠胃粘膜有病理性改变，可能与Glu通过抑制胃酸分泌而保护胃粘膜有关。胰岛D细胞分泌的SOM对B细胞和A细胞的分泌活动起抑制作用[7]。本研究发现，脾虚组胰岛D细胞内SOM合成多，释放少，可能是由于D细胞释放SOM暂时减弱，降低了对胰岛A、B细胞激素分泌的抑制作用，导致A、B细胞分泌活动增强。
, 百拇医药
我们应用免疫组织化学法的研究证明，实验性脾虚证时大鼠胰岛A细胞、B细胞和D细胞的分泌活动确实发生了变化。这对研究脾虚证发病与胰岛内分泌的关系提供了可供参考的线索。
图版说明
图1 正常对照组，示Ins强阳性和中等阳性B细胞多，箭头示胞核偏于细胞一侧。 ×400
图2 脾虚组，示Ins弱阳性和中等阳性B细胞多，胞质染色较浅。×400
图3 自然恢复组，示Ins阳性B细胞染色比脾虚组深(图2)，比对照组浅(图1)。 ×400
图4 中药治疗组，示Ins强阳性和中等阳性B细胞多。 ×400
, 百拇医药 图5 正常对照组，示IAPP中等和弱阳性B细胞多。 ×400
图6 脾虚组，示IAPP强阳性和中等阳性B细胞增多。 ×400
图7 自然恢复组，示IAPP中等阳性B细胞多于对照组(图5)。 ×400
图8 中药治疗组，示IAPP中等阳性和弱阳性B细胞比自然恢复组增多(图7)，但尚未恢复到正常水平。 ×400
图9 正常对照组，示Glu强阳性和中等阳性A细胞较多，箭头示细胞伸出的突起。 ×400
图10 脾虚组，示Glu中等阳性和弱阳性A细胞增多，细胞染色浅。 ×400
图11 正常对照组，示SOM弱阳性和中等阳性D细胞较多。 ×400
, 百拇医药
图12 脾虚组，示SOM强阳性和中等阳性D细胞增多，可见有的细胞伸出突起(箭头)。 ×400
Explanation of figures
Fig.1 Showing Ins-positive B cells.There are many strong and moderate Ins-positive B cells in normal control group.Two arrows denote the cell nucleus is eccentrically located ×400
Fig.2 Showing Ins-positive B cells.There are many weak Ins-positive B cells in experimental spleen deficiency syndrome group. ×400
, 百拇医药
Fig.3 Showing Ins-positive B cells,the reactivity of B cells in self-recovery group is stronger than in experimental spleen deficiency syndrome group(Fig.2),but is weaker than normal control(Fig.1). ×400
Fig.4 Showing strong and moderate Ins-positive B cells are increased in therapeutic group than in the self-recovery group. ×400
Fig.5 Showing IAPP-positive B cells.There are many moderate and weak IAPP-positive B cells in normal control group. ×400
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Fig.6 Showing IAPP-positive B cells.The strong and moderate IAPP-positive B cells are more in experimental spleen deficiency syndrome group than in normal control(Fig.5). ×400
Fig.7 Showing IAPP-positive B cells in self-recovery group.There are more moderate IAPP-positive B cells than in normal control group(Fig.5). ×400
Fig.8 Showing IAPP-positive B cells in therapeutic group.There are more moderate and weak IAPP-positive B cells,but still not recovered to normal control. ×400
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Fig.9 Showing Glu-positive A cells in the normal control group.There are many moderate Glu-positive A cells.The arrow denotes a thick process extends from A cell. ×400
Fig.10 Showing more weak Glu-positive A cells in experimental spleen deficiency syndrome group than in normal control(Fig.9). ×400
Fig.11 Showing more moderate and weak SOM-positive D cells in normal control. ×400
Fig.12 Showing strong and moderate SOM-positive D cells are more in experimental spleen deficiency syndrome group than in mormal control(Fig.11).The arrows denote a process extends from D cells. ×400
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* 北京市中医管理局资助课题(No.JX95305)
△ Department of Histology and Embryology,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China
参考文献
[1]吴贤中，高金亮主编.脾虚证的现代研究.天津：天津科技翻译出版公司，1992：46～48
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[7]冯子强.胰腺.见成令忠主编：组织学.第2版.北京：人民卫生出版社，1993：1156～1160
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收稿1998-06 修回1999-02, 百拇医药
单位：王秀琴 尚宏伟 曾晓蓓 孟庆峰 王兴翠 杨进(首都医科大学组织学胚胎学教研室，北京 100054)
关键词：胰岛细胞；实验性脾虚证；免疫组织化学；大鼠
解剖学报990316
【摘要】 目的 研究实验性脾虚证大鼠胰岛细胞胰岛素、胰岛淀粉样多肽、胰高血糖素和生长抑素分泌活动的变化，探讨中医学脾虚证发病与胰岛激素分泌活动的关系。 方法 用Wistar雄性成年大鼠24只，分为正常对照组、实验性脾虚组、自然恢复组和中药治疗组。4组动物同时麻醉处死，取胰尾固定于Bouin液，制成石蜡切片。用免疫组织化学法显示胰岛B细胞胰岛素和胰岛淀粉样多肽、A细胞胰高血糖素和D细胞生长抑素，并用显微分光光度计对免疫染色强度进行了定量测定。 结果 与对照组相比，脾虚组胰岛B细胞胰岛素和A细胞胰高血糖素免疫染色明显减弱，而D细胞生长抑素和B细胞胰岛淀粉样多肽免疫染色明显增强。 结论 上述结果提示，胰岛细胞激素分泌活动失常可能与脾虚证代谢异常有密切关系。
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IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY ON THE PANCREATIC
ISLET CELLS IN EXPERIMENTAL SPLEEN
DEFICIENCY SYNDROME OF RATS
Wang XiuqinΔ, Shang Hongwei, Zeng Xiaobei, Meng Qingfeng, Wang Xingcui, Yang Jin
(Department of Histology and Embryology,Capital University of Medical Sciences,Beijing)
【Abstract】 Objective To study the relationship between the islet hormonal secretory activity and the pathogenesis of spleen deficiency syndrome in Chinese traditional medicine.Methods The changes of secretory activity of insulin(Ins), islet amyloid polypeptide (IAPP),glucagon(Glu) and somatostatin (SOM) in pancreatic islet cells of experimental spleen dificiency syndrome rats were observed by immunohistochemical technique.24 adult male Wistar rats were divided into 4 groups:(1)normal control group; (2)experimental spleen deficiency syndrome group induced by rhubarb combined with imbalance of food supply;(3) therapeutic group treated with Chinese herbs-“Plus Si Jun Zi Decoction”,and (4) self-recovery group,that is,the syndrom was induced but without medical treatment.The tail portions of pancreas were taken and prepared for immunohistochemical demonstration of A cells (for Glu),B cells(for Ins and IAPP) and D cells (for SOM).The immunoreactivity of the above mentioned cells were measured by microspectrophotometry.Results As compared with the normal control,the immunereactivity of Ins in B cells and Glu in A cells of the experimental spleen deficiency syndrome group is obviously declined, while IAPP in B cells and SOM in D cells are apparently elevated.Conclusion This study suggests that the disorder of islet cell secretory activity seems to be intimately related to the metabolic abnormality in the spleen deficiency syndrome.
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【Key words】 Pancreatic islet cells; Experimental spleen deficiency syndrome; Immunohistochemistry; Rat
近年对脾虚证患者和实验性脾虚证动物的研究表明，脾虚证是一组比较集中反映“脾”功能低下和紊乱的综合征候群[1]。脾虚证患者和动物模型的能量代谢、糖和蛋白质代谢以及食物消化和吸收均有明显变化。有研究表明，实验性脾虚证时血糖水平的调节能力下降，血糖浓度处于较低水平[2]。另有研究证明，胰岛激素与某些内脏疾患恢复过程相关[3，4]。但脾虚证时胰岛激素分泌活动有无变化，尚未见研究。为此，我们应用免疫组织化学法和显微分光光度计定量测定法，从形态学角度探讨实验性脾虚证大鼠胰岛细胞激素的变化，以了解胰岛内分泌活动与脾虚证的关系。
材料和方法
, 百拇医药
1. 动物分组及标本制备
成年雄性Wistar大鼠(Ⅱ级动物，中国医学科学院实验动物繁育场提供)24只，体重130～150g，分为4组：对照组5只、实验性脾虚组(脾虚组)7只、自然恢复组5只、中药治疗组(治疗组)7只。脾虚组用破气苦降药与饮食失节相结合的方法，制成脾虚证模型。破气苦降药成分剂量按厚朴∶枳实∶大黄为3∶3∶3的比例，冷水浸泡20min，煮沸20min，过滤浓缩成100%煎剂(含生药1 000g/L煎剂)，隔日灌服2次/d，3ml/次(药量为生药2g/100g体重)。喂药当日禁食，次日正常饮食，喂养42d，致成脾虚证模型。对照组按脾虚组给药法灌服自来水，3ml/次，但饮食不限，饲养42d。治疗组在动物致脾虚后，用加味四君子汤治疗，汤剂成分的剂量按灸黄芪∶党参∶茯苓∶炒白术∶灸甘草为2∶2∶2∶2∶1的比例，制成100%煎剂(含生药1 000g/L煎剂)，隔日灌服，2次/d，3ml/次(相当于生药1.5g/100g体重)，正常饮食，喂养21d。自然恢复组在动物致脾虚后，按治疗组给药法隔日灌服自来水，2次/d，3ml/次，正常饮食，喂养21d。
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4组动物同时取材，取材前禁食12h。腹腔注射6%水合氯醛(0.5ml/100g体重)麻醉，心脏取血处死。取胰尾入Bouin液固定，按常规制成6μm厚的石蜡切片，在相同条件下同时进行免疫组织化学染色。
2. 免疫组织化学染色
2.1 胰岛B细胞染色：切片脱蜡入水，入3%甲醇-H2O2，室温30min,PBS洗；入正常羊血清(1∶20)，室温30min；隔片滴加兔抗胰岛素(Ins)抗血清(1∶100，美国Zymed公司)，室温30min，PBS洗，邻片滴加兔抗胰岛淀粉样多肽(IAPP)抗血清(1∶4 000，美国Peninsula公司)，4℃过夜，PBS洗。滴加HRP标记的羊抗兔IgG，室温10min，PBS洗；滴加H2O2-AEC(aminoethyl carbazole)显色剂(6A、6B、6C各1滴加入1ml蒸馏水中)(美国Zymed公司)，室温10min;蒸馏水洗，封片剂封片。
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2.2 胰岛A细胞和D细胞染色：前面步骤同上。隔片滴加兔抗胰高血糖素(Glu)抗血清(1∶100，美国Zymed公司)，相邻切片滴加兔抗生长抑素(SOM)抗血清(1∶100，美国Zymed公司)，4℃过夜：PBS洗。滴加生物素标记的羊抗兔IgG，37℃ 30min,PBS洗；滴加HRP标记的链霉卵白素，37℃ 30min；滴加DAB显色剂(DAB 6mg溶于0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)20ml内，磁棒搅拌30min，加3%H2O2 40μl)室温10min。经自来水和蒸馏水洗，甘油明胶封片。
以上几种免疫组织化学染色，都用PBS代替第一抗体作阴性对照。
3. 显微分光光度计定量测定
用显微分光光度计(MPV-COM,Leica)在10×40放大倍数下测定细胞免疫染色强度。Ins-IR(免疫反应性)细胞和IAPP-IR细胞每组测5只动物，每只测50个细胞(1～2个胰岛)。Glu-IR细胞和SOM-IR细胞每组测5只动物，每只测30个细胞(2～5个胰岛)。将所测各组细胞的光密度(A)值进行方差分析。
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结果
1. 组织学观察
胰岛B细胞呈Ins和IAPP阳性，数量最多，大多呈团索状分布于胰岛中央部，也见一些细胞散在于胰腺泡之间。B细胞呈圆形、椭圆形、三角形或多角形。胞质内含Ins-IR或IAPP-IR红色产物；胞核呈圆形，不着色(图1，5)。A细胞呈Glu阳性，数量较B细胞少，分布于胰岛周边。细胞形状不规则，呈三角形、多边形或梭形，有的细胞可见短小突起(图9)，胰腺泡间也可见散在的A细胞。A细胞胞质内含Glu-IR棕黄色产物；胞核呈椭圆形，不着色。D细胞为SOM阳性，数目较少，分布于胰岛周边的A、B细胞之间，也见于胰岛中央B细胞之间(图11)。D细胞呈圆形或梭形，常见突起(图12)，胞质内含SOM-IR棕黄色产物；胞核卵圆形，不着色。4种免疫组织化学反应的对照切片均为阴性。
2. 免疫组织化学半定量和定量测定
, 百拇医药 根据免疫组织化学染色强度，将阳性细胞分为3级，即强阳性(+++，胞质充满IR产物，色深)、弱阳性(+，IR产物占胞质一半以下，色浅)和中等阳性(++，IR产物和着色介于强阳性和弱阳性之间)。对照组Ins阳性B细胞以强阳性和中等阳性者居多，弱阳性者少(图1)。与对照组相比，脾虚组Ins阳性B细胞以中等和弱阳性者较多，强阳性者少(图2)。与对照组和脾虚组相比，自然恢复组Ins中等阳性B细胞比对照组少，而比脾虚组多；弱阳性者比对照组多，但比脾虚组少(图3)。与脾虚组和自然恢复组相比，治疗组Ins强阳性和中等阳性B细胞多，弱阳性者少，接近于对照组(图4)。显微分光光度计定量测定显示，与对照组相比，脾虚组B细胞Ins反应明显减弱，有显著性差异(P<0.01)。自然恢复组B细胞Ins反应高于脾虚组，低于对照组和治疗组，差异显著(P<0.01)。治疗组Ins反应强度高于脾虚组和自然恢复组，与对照组接近，但两者之间仍有显著性差异(P<0.01)，表示还未恢复正常。IAPP阳性B细胞，对照组以中等阳性和弱阳性者较多，强阳性者少(图5)。与对照组相比，脾虚组IAPP阳性B细胞以强阳性和中等阳性者多，弱阳性者少(图6)。与对照组和脾虚组相比，自然恢复组IAPP阳性B细胞中等阳性者多于对照组，弱阳性者少于对照组，与脾虚组接近(图7)。与脾虚组和自然恢复组相比，治疗组IAPP阳性B细胞中等阳性者少，弱阳性者较多(图8)。显微分光光度计定量测定显示，脾虚组IAPP阳性B细胞反应强度明显高于对照组，差异有显著性(P<0.01)。自然恢复组IAPP阳性B细胞反应强度高于对照组和脾虚组，差异有显著性(P<0.01)。治疗组IAPP阳性B细胞反应强度高于对照组，而低于脾虚组和自然恢复组，但比自然恢复组更接近对照组，且与对照组相比仍有显著性差异(P<0.01)。
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对照组Glu阳性A细胞以强阳性和中等阳性者较多，弱阳性者少(图9)。与对照组相比，脾虚组Glu阳性A细胞以中等阳性和弱阳性者较多(图10)。自然恢复组和治疗组Glu阳性A细胞，强阳性和中等阳性者比对照组和脾虚组多。显微分光光度计定量测定显示，脾虚组胰岛A细胞Glu反应强度低于对照组，差异有显著性(P<0.01)。自然恢复组和治疗组A细胞Glu反应强度都高于对照组和脾虚组(P<0.01)，表示尚未完全恢复，但治疗组更接近对照组。对照组SOM阳性D细胞以中等和弱阳性者多(图11)。与对照组相比，脾虚组SOM阳性D细胞以强阳性和中等阳性者较多，弱阳性者减少(图12)。自然恢复组和治疗组SOM阳性D细胞，强阳性和中等阳性者比对照组和脾虚组多。显微分光光度计定量测定显示，脾虚组SOM反应强于对照组，差异有显著性(P<0.01)。自然恢复组和治疗组SOM反应强于对照组和脾虚组(P<0.01)，表示并未完全恢复。以上各组免疫组织化学结果见表1，2。
表1 胰岛细胞免疫染色半定量测定
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Table 1 Semi-quantitative measurement of the immuneo-
staining in pancreatic islet cells 分组
group
胰岛素
B细胞
Ins B cells
胰岛淀粉样
多肽B细胞
IAPP B cells
胰高血糖素
A细胞
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Glu A cells
生长抑素
D细胞
SOM D cells
对照组
N-C group
++
+
++～+++
++
脾虚组
S-D group
+
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+++
+～++
++～+++
自然恢复组
S-R group
+～++
++
+++
+++
治疗组
ther group
++
+～++
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+++
+++
+++：示强阳性细胞多；++：示中等阳性细胞多；+：示弱阳性细胞多；
+++,the mark denotes strong positive cells are increased; ++,the mark denotes moderate positive cells are increased; +,the mark denotes weak positive cells are increased.
N-C group, normal control group; S-D group, spleen deficiency group; S-R group, self-recovery group; Ther group,therapeutic group.
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讨论
胰岛细胞胞质的分泌颗粒是激素的贮存所在。分泌颗粒的数量和免疫染色强度在一定程度上可反映激素的含量，也可反映细胞分泌活动的强弱。有研究证明，胰岛细胞瘤细胞分泌激素亢进时，细胞的免疫染色比正常胰岛细胞明显减弱[5]。这提示细胞激素释放增强时，免疫染色弱；细胞合成激素旺盛时，免疫染色强。故用显微分光光度计对内分泌细胞免疫染色进行定量测定，能够显示细胞内激素的含量变化[6]。本研究用免疫组织化学半定量和定量测定的结果表明，脾虚组B细胞内Ins和A细胞内Glu免疫染色产物含量低于对照组，提示激素释放活跃；而B细胞IAPP及D细胞SOM免疫染色产物含量高于对照组，提示激素合成活跃。治疗组Ins和Glu的免疫染色接近对照组，IAPP和SOM的免疫染色高于对照组，提示所用中药方剂对胰岛细胞激素分泌紊乱的改善作用在不同细胞之间存在差别，尚未完全恢复。自然恢复组几种激素的免疫染色变化较复杂，Ins低于对照组和治疗组，IAPP高于其他3组，Glu和SOM高于对照组和脾虚组，我们尚不能解释，有待今后研究。
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表2 胰岛细胞免疫染色显微分光光度计定量测定(
±)Table 2 Quantitative measurement of the immunostaining in pancreatic islet
cells by microspectrophotometer(
±) 抗血清antiserum
动物只数
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animals
number
细胞数
cells
number
对照组
N-C
group
脾虚组
S-D
group
自然恢复组
S-R
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group
治疗组
ther. group
胰岛素
insulin
5
250
0.553±0.11
0.189±0.043*
0.298±0.078
0.474±0.091**
胰岛淀粉样多肽
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islet amyloid
polypeptide
5
250
0.217±0.055
0.543±0.119*
0.621±0.133
0.445±0.151**
胰高血糖素
glucagon
5
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150
0.468±0.096
0.259±0.067*
0.515±0.097
0.570±0.128**
生长抑素
somatostatin
5
150
0.235±0.094
0.347±0.093*
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0.648±0.093
0.546±0.084**
：脾虚组与对照组相比，P<0.01；**：治疗组与对照组相比，P<0.01；
,as compared with normal cotrol group,P<0.01; **,as compared with normal control group,P<0.01.
胰岛B细胞分泌的Ins能促进肝细胞和肌细胞糖原合成，使血糖水平下调[7]。脾虚组Ins分泌增强，可能促进肝细胞糖原合成，使细胞内糖原贮存增多[8]，血糖下调，与已有的报道一致[9]。IAPP(又名amylin)与Ins共存于B细胞的分泌颗粒内，与Ins一起释放[10]。它可能与糖代谢的调节有密切关系，并参与血钙水平的调节[11]。正常状况下血浆IAPP含量约是Ins的10%，两者含量的波动呈平行关系。在某些代谢发生变化时，这两种激素合成和释放的相对量可发生明显改变，这在Ⅱ型糖尿病的发生中可能有重要意义[12]。本实验结果显示，对照组B细胞的Ins染色强，IAPP染色弱；脾虚组则与对照组相反，B细胞Ins染色弱而IAPP染色强。这提示脾虚组Ins与IAPP的比例发生了变化，可能与脾虚证的代谢失常有关，或许与糖代谢失常有密切关系。
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胰岛A细胞分泌的Glu主要作用是促进糖原分解和糖异生，使血糖上调[7]。已知低血糖和低氨基酸时能刺激Glu分泌[7]。本实验脾虚组A细胞Glu反应弱，提示Glu分泌活动增强，这可能是因为脾虚组血糖降低，而使A细胞Glu分泌增多，Glu可能通过提高肝糖原分解的关键酶葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)活性，促进糖原分解，使血糖上调。本室先前的工作[8]证明，脾虚组肝细胞G-6-Pase活性增强，可能与实验所见Glu分泌增多有关。Glu还可促进Ins分泌，并通过抑制胃酸分泌对胃粘膜起保护作用[13]。在本室多年的研究中，未发现脾虚证大鼠胃粘膜有病理性改变，可能与Glu通过抑制胃酸分泌而保护胃粘膜有关。胰岛D细胞分泌的SOM对B细胞和A细胞的分泌活动起抑制作用[7]。本研究发现，脾虚组胰岛D细胞内SOM合成多，释放少，可能是由于D细胞释放SOM暂时减弱，降低了对胰岛A、B细胞激素分泌的抑制作用，导致A、B细胞分泌活动增强。
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我们应用免疫组织化学法的研究证明，实验性脾虚证时大鼠胰岛A细胞、B细胞和D细胞的分泌活动确实发生了变化。这对研究脾虚证发病与胰岛内分泌的关系提供了可供参考的线索。
图版说明
图1 正常对照组，示Ins强阳性和中等阳性B细胞多，箭头示胞核偏于细胞一侧。 ×400
图2 脾虚组，示Ins弱阳性和中等阳性B细胞多，胞质染色较浅。×400
图3 自然恢复组，示Ins阳性B细胞染色比脾虚组深(图2)，比对照组浅(图1)。 ×400
图4 中药治疗组，示Ins强阳性和中等阳性B细胞多。 ×400
, 百拇医药 图5 正常对照组，示IAPP中等和弱阳性B细胞多。 ×400
图6 脾虚组，示IAPP强阳性和中等阳性B细胞增多。 ×400
图7 自然恢复组，示IAPP中等阳性B细胞多于对照组(图5)。 ×400
图8 中药治疗组，示IAPP中等阳性和弱阳性B细胞比自然恢复组增多(图7)，但尚未恢复到正常水平。 ×400
图9 正常对照组，示Glu强阳性和中等阳性A细胞较多，箭头示细胞伸出的突起。 ×400
图10 脾虚组，示Glu中等阳性和弱阳性A细胞增多，细胞染色浅。 ×400
图11 正常对照组，示SOM弱阳性和中等阳性D细胞较多。 ×400
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图12 脾虚组，示SOM强阳性和中等阳性D细胞增多，可见有的细胞伸出突起(箭头)。 ×400
Explanation of figures
Fig.1 Showing Ins-positive B cells.There are many strong and moderate Ins-positive B cells in normal control group.Two arrows denote the cell nucleus is eccentrically located ×400
Fig.2 Showing Ins-positive B cells.There are many weak Ins-positive B cells in experimental spleen deficiency syndrome group. ×400
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Fig.3 Showing Ins-positive B cells,the reactivity of B cells in self-recovery group is stronger than in experimental spleen deficiency syndrome group(Fig.2),but is weaker than normal control(Fig.1). ×400
Fig.4 Showing strong and moderate Ins-positive B cells are increased in therapeutic group than in the self-recovery group. ×400
Fig.5 Showing IAPP-positive B cells.There are many moderate and weak IAPP-positive B cells in normal control group. ×400
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Fig.6 Showing IAPP-positive B cells.The strong and moderate IAPP-positive B cells are more in experimental spleen deficiency syndrome group than in normal control(Fig.5). ×400
Fig.7 Showing IAPP-positive B cells in self-recovery group.There are more moderate IAPP-positive B cells than in normal control group(Fig.5). ×400
Fig.8 Showing IAPP-positive B cells in therapeutic group.There are more moderate and weak IAPP-positive B cells,but still not recovered to normal control. ×400
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Fig.9 Showing Glu-positive A cells in the normal control group.There are many moderate Glu-positive A cells.The arrow denotes a thick process extends from A cell. ×400
Fig.10 Showing more weak Glu-positive A cells in experimental spleen deficiency syndrome group than in normal control(Fig.9). ×400
Fig.11 Showing more moderate and weak SOM-positive D cells in normal control. ×400
Fig.12 Showing strong and moderate SOM-positive D cells are more in experimental spleen deficiency syndrome group than in mormal control(Fig.11).The arrows denote a process extends from D cells. ×400
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* 北京市中医管理局资助课题(No.JX95305)
△ Department of Histology and Embryology,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China
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收稿1998-06 修回1999-02, 百拇医药