猕猴消化系统各器官蛋白水解酶种类和性质研究*
作者：吉爱玲 李彦章 向华 伍雁 封青川 徐存拴
单位：吉爱玲 李彦章 向华 伍雁 封青川 徐存拴(河南师范大学生物系，新乡 453002)
关键词：蛋白水解酶；活性电泳(G-PAGE)；消化系统；猕猴
解剖学报990311
【摘要】 目的 研究太行山猕猴(Macaca mulatta tcheliensis)消化系统各器官蛋白水解酶种类和性质。 方法 采用单向活性电泳(1D-G-PAGE)和双向活性电泳(2D-G-PAGE)技术。 结果 (1)消化系统各器官的蛋白水解酶在近中性条件下活性最强，其中94、86、64、59和25kD蛋白水解酶在消化系统各器官中普遍存在；(2)消化系统各器官均具有31、30、和29kD 3种酸性蛋白水解酶；(3) pH7.0时，胃、胰、十二指肠中分别含有12、34和18种不同分子量或等电点的蛋白水解酶；(4)pH10.5时，胰、十二指肠中分别检出21和12种不同分子量或等电点的蛋白水解酶。 结论 消化系统中蛋白水解酶的种类和数量比较多，且结构相似、功能相近的器官之间，蛋白水解酶的种类和性质相似。
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STUDY ON KINDS AND PROPERTIES OF PROTEOLYTIC
ENZYMES IN DIGESTIVE SYSTEM OF
MACACA MULATTA TCHELIENSIS
Ji Ailing, Li Yanzhang, Xiang Hua, Wu Yan, Feng Qingchuan, Xu CunshuanΔ
(Department of Biology, Henan Normal University; Henan Xinxiang)
【Abstract】 Objective To study the kinds and properties of proteolytic enzymes in digestive system of Macaca mulatta tcheliensis.Methods The 1D-G-PAGE was mainly employed. Results (1) The most active proteolytic enzymes exist in neutral condition and 94，86，64，59 and 25kD proteolytic enzymes all exist. (2) Three kinds of different proteolytic enzymes 31, 30 and 29kD exist in different organs of digestive system.(3) On the condition of pH7.0, 12,34,18 kinds of proteolytic enzymes with different MW or pI exist in stomach, pancreas, duodenum respectively. (4) On the condition of pH10.5, 21 and 12 kinds of proteolytic enzymes with different MW or pI exist in pancreas, duodenum respectively. Conclusions There are many kinds of proteolytic enzymes in digestive system of Macaca mulatta tcheliensis, and proteolytic enzymes likeness exists between the organs with similar structure and similar functions.
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【Key words】 Proteolytic enzymes;G-PAGE;Digestive system; Macaca mulatta tcheliensis
蛋白水解酶在蛋白质的降解与特异性修饰、调节细胞生理活动、细胞分化与迁移、组织再生与修复、细胞凋亡等过程中起重要作用，同时也与很多病理过程有关[1～4]。
太行山猕猴在进化上与人类有很近的亲缘关系，是研究人体生理、病理的很好的实验材料[5]，据报道，Ca2+激活的中性蛋白酶在病理状态下，如断离神经纤维脂肪变性(wallerian degeneration)，与神经元纤维的退化有关[6]。但迄今为止，对猕猴组织器官蛋白水解酶的研究还较少，而系统研究猕猴消化系统各器官蛋白水解酶的种类和性质，尚未见报道。
活性电泳方法始建于本世纪70年代，具有直观、简便、灵敏性高、电泳后仍可保持蛋白质和蛋白酶生物活性等优点[7]。除定性分析外，可用摄像扫描密度计定量测定酶活性区域的透光值，计算机可根据透光值，计算出相应含量。我们用活性单向电泳(1D-G-PAGE)和活性双向电泳(2D-G-PAGE)方法对猕猴消化系统各器官中蛋白水解酶的种类、性质及pH依赖性进行了研究，以期探讨消化系统中蛋白水解酶的变化规律，并对其与消化系统各脏器生理功能间的可能关系进行了讨论。
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材料和方法
1. 材料
系河南师范大学生物系猕猴饲养场提供的正常雄性成年太行山猕猴，实验用猕猴共3只。所取脏器包括舌、食管上段、食管中段、食管下段、胃贲门、胃体、胃幽门、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、腮腺、颌下腺、舌下腺、肝和胰脏等。
2. 主要化学药品
丙烯酰胺(acrylamide, Sigma公司)、双丙烯酰胺(bisacrylamide, Fluka公司)、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED，Bio-Rad公司)、明胶(gelatin, Sigma公司)、曲拉通X-100(Triton X-100，Farco公司)、十二烷基磺酸钠(SDS，Serva公司)、牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base,上海巴斯生物公司)、标准分子量蛋白(Serva公司)、考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brillant blue R250, Fluka公司进口分装)、两性电解质(ampholyte，军事医学科学院)、乙基苯基聚乙二醇(nonidet P40，Fluka公司)。
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本实验所用其他化学药品均为分析纯。
3. 制备组织匀浆液
取猕猴消化系统各器官，冰浴匀浆，4℃离心(20 000g, 5 min)，分装上清液，保存于液氮中备用。
4. 蛋白质浓度测定
采用Neuhoff方法[8]。
5. 活性单向电泳(1D-G-PAGE)
按徐存拴改良的方法[9]进行。将0.083%的明胶共聚于10%聚丙烯酰胺凝胶里，电泳在4℃进行，样品在浓缩胶里电泳时，电压为50V，初始电流强度10 mA/板；样品在分离胶里电泳时，电流强度同上，电压≤100 V。待前沿指示剂(1%溴酚蓝)到达离胶板下缘2cm处时停止电泳，切除前沿指示剂以下部分后，将凝胶板放入胶板洗涤液(3.03g Tris-base，12ml Triton X-100，500ml双蒸水，pH6.5，20℃)中30min，每5min振荡1次，洗涤后，将胶板放入双蒸水中洗涤3次(5min/次)，然后将胶板置37℃(0.1mol/L glycin，5mmol/LCaCl2，pH分别是：3.5、5.9、7.0、10.5)，24h后，按Laemmli方法[10]固定、染色、脱色至酶活性区域清晰透亮(使用用过多次的旧脱色液脱色，效果更佳)。使用不同pH值的孵育液处理胶板可以进行蛋白水解酶的pH依赖性检测。
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6. 活性双向电泳(2D-G-PAGE)
以O′Farrell[11](1977)IEF-SDS-PAGE方法为基础进行改良。用于等电聚焦(IEF)的凝胶里不含DTT，样品缓冲液的尿素浓度≤5mol/L。电泳在4℃进行，电压250V，电流12h。等点聚焦结束后，胶条在洗涤液(80mmol/L Tris-Cl、2%SDS,pH6.8)里洗涤10min，然后将胶条预夹入离胶液槽上沿和左侧各1cm处的胶液槽(胶液槽厚1mm)里，把分离胶液注入胶液槽待凝固后，将上述洗涤液注入胶液槽内洗涤胶条2次(5min/次)，然后将洗涤液倒掉，用0.5mol/L Tris-Cl，pH6.8的缓冲液洗涤2次，之后把浓缩胶液注满整个胶液槽，其余步骤同1D-G-PAGE。
胶条的pH梯度测定：把胶条切成1cm长的胶段，将各胶段放入煮沸5min再冷却后的5 ml双蒸水里4h，然后测定双蒸水的pH值。
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结 果
1. 用活性单向电泳(1D-G-PAGE)分析蛋白水解酶的种类、性质和活性
1.1 pH3.5时消化系统各器官的蛋白水解酶种类及活性：在酸性条件下，31、30、29kD 3条酶带普遍存在于各受检器官中。从食管下段至胃幽门，出现47和43kD 2条活性酶带，它们在胃体中的活性最强。另外，86kD的酶带在胃贲门和胃幽门中出现，39kD的酶带在食管下段、胃体和胃幽门中出现，如图1所示。
在其他消化器官中，蛋白水解酶的种类及活性见表1所示。在十二指肠、空肠和回肠中，分别检出分子量从141kD至64kD等酶带，但活性较弱，而在其他受检器官中较少检出。
1.2 pH5.9和7.0时消化系统各器官的蛋白水解酶种类及活性：在pH5.9和7.0时，舌、食管上段、食管中段、食管下段、胃贲门、胃体和胃幽门均检出250、94、86、64、59和25kD 6条酶带，其中，94、86和25kD 3条酶带活性较强；另外，在食管上段、胃贲门和胃幽门中还检出49和41kD 2条酶带，如图2所示。
, 百拇医药
其他消化器官中，pH5.9时蛋白水解酶的种类及活性见表2所示，pH7.0时蛋白水解酶的种类及活性见表3所示。其中94、86、64、59、25kD 5条酶带普遍存在于受检器官中，活性也较强。尤其是，空肠和回肠所含蛋白水解酶的种类最多，活性最强。在各消化腺体中，胰腺所含酶的种类较多，活性也较强。
1.3 pH10.5时消化系统各器官的蛋白水解酶种类及活性：在pH10.5时，舌、食管上段、食管中段、食管下段、胃贲门、胃体和胃幽门均检出86和25kD 2条酶带；另外，在食管上段、胃贲门和胃幽门中还检出64和49kD 2条酶带，如图3所示。
在其他消化器官中，蛋白水解酶的种类及活性见表4所示。其中86、49、25kD 3条酶带普遍存在于受检器官中。与中性条件相比较，在碱性条件下，小肠仍保持较高的蛋白水解酶活性，尤其是在十二指肠中，酶的种类有所增多，活性也有所增强。而其他各部位的酶活性开始减弱或消失。
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表1 pH3.5时消化系统各器官蛋白水解酶种类及活性
Table 1 On the condition of pH3.5, the kinds and activity of proteolytic enzymes in digestive system 分子量
kD
十二指肠
duodenum
空肠
jejunum
回肠
ileum
盲肠
, 百拇医药
caecum
结肠
colon
直肠
rectum
腮腺
parotid gland
颌下腺
submandibular
gland
舌下腺
sublingual
, 百拇医药 gland
肝
liver
胰
pancreas
141
2+
3+
131
+
113
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2+
2+
(+)活性弱 (2+)活性较弱 (3+)活性强 (4+)活性很强
(+)weak activity (2+)general activity (3+)strong activity (4+) stronger activity
表2 pH5.9时消化系统各器官蛋白水解酶种类及活性
Table 2 On the condition of pH5.9, the kinds and activity of proteolytic enzymes in digestive system 分子量
, 百拇医药
kD
十二指肠
duodenum
空肠
jejunum
回肠
ileum
盲肠
caecum
结肠
colon
直肠
rectum
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腮腺
parotid gland
颌下腺
submandibular
gland
舌下腺
sublingual
gland
肝
liver
胰
pancreas
, 百拇医药 250
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+和其前面系数的含义同表1。
+ and their coefficient here mean the same as those of table 1 do.
表3 pH7.0时消化系统各器官蛋白水解酶种类及活性
Table 3 On the condition of pH7.0, the kinds and activity of proteolytic enzymes in digestive system 分子量
, 百拇医药 kD
十二指肠
duodenum
空肠
jejunum
回肠
ileum
盲肠
caecum
结肠
colon
直肠
rectum
, 百拇医药
腮腺
parotid gland
颌下腺
submandibular
gland
舌下腺
sublingual
gland
肝
liver
胰
pancreas
, 百拇医药 250
2+
2+
2+
2+
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3+
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+和其前面系数的含义同表1。
+and their coefficient here mean the same as those of table 1 do.
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表4 pH10.5时消化系统各器官蛋白水解酶种类及活性
Table 4 On the condition of pH10.5 the kinds and activity of proteolytic enzymes in digestive system 分子量
kD
十二指肠
duodenum
空肠
jejunum
回肠
ileum
盲肠
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caecum
结肠
colon
直肠
rectum
腮腺
parotid gland
颌下腺
submandibular
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舌下腺
sublingual
, 百拇医药 gland
肝
liver
胰
pancreas
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+和其前面系数的含义同表1。
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+and their coefficient here mean the same as those of table 1 do.
2. 用活性双向电泳分析蛋白水解酶的种类、性质和活性
2.1 在孵育液为pH7.0的条件下：在pH7.0时，十二指肠中检出18种不同分子量或等电点的酶(图4)；分别为113kD(pI6.0)、113kD(pI5.64)、94kD(pI6.0)、94kD(pI5.64)、86kD(pI6.0)、86kD(pI5.64)、78kD(pI5.64)、67kD(pI5.64)、64kD(pI6.0)、64kD(pI5.64)、59kD(pI5.64)、53kD(pI5.19)、49kD(pI5.64)、30kD(pI5.64)、25kD(pI6.0)、25kD(pI5.64)、22kD(pI5.64)和20kD(pI5.64)。用同样的方法显示胃体中含有12种不同分子量或等电点的酶(表5)；胰中含有34种不同分子量或等电点的酶(表6)。
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表5 活性双向电泳分析pH7.0时胃体蛋白水解酶的种类
Table 5 2D-G-PAGE analysis of the proteolytic
enzymes in stomach on the condition of pH7.0
分子量molecular weight(kD)
113
94
86
64
59
49
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36
25
等电点(pI)
5.19
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4.68
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4.42
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表6 活性双向电泳分析pH7.0时胰蛋白水解酶的种类
Table 6 2D-G-PAGE analysis of the proteolytic enzymes
in pancreas on the condition of pH7.0
分子量 molecular weight (kD)
113
94
, http://www.100md.com
86
78
64
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等电点(pI)
6.0
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2.2 在孵育液为pH10.5的条件下：在pH10.5时，胰中检出21种不同分子量或等电点的酶(表7)；十二指肠中检出12种不同分子量或等电点的酶(表8)。
表7 活性双向电泳分析pH10.5时胰蛋白水解酶的种类
Table 7 2D-D-PAGE analysis of the proteolytic enzymes
in pancreas on the condition of pH10.5
分子量 molecular weight(kD)
94
86
64
, 百拇医药
53
49
39
36
31
30
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等电点(pI)
7.3
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表8 活性双向电泳分析pH10.5时十二指肠蛋白水解酶的种类
Table 8 2D-G-PAGE analysis of the proteolytic enzymes
in duodenum on the condition of pH10.5
, 百拇医药
分子量 molecular weight (kD)
113
94
86
64
53
49
30
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等电点(pI)
6.0
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5.19
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讨 论
蛋白质水解是细胞的重要代谢过程，这一代谢过程对生命是必不可少的，蛋白水解酶在其中起重要的作用。
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我们所采用的活性电泳方法是一种专门显示蛋白水解酶的方法。该方法既可用于测定分离纯化的酶活性，又可用于直接测定分析细胞匀浆液里的蛋白水解酶活性，我们正是通过这种方法直接测定分析了猕猴消化系统各器官组织匀浆液里的蛋白水解酶种类及活性，样品制备简便。活性电泳方法的基本原理是：SDS-聚丙烯酰胺凝胶里共聚有明胶(如果用Coomassie Brillant blue R250染色，整个胶板被染成蓝色)，电泳后，用非离子去垢剂(如Triton X-100)处理胶板，SDS被Triton X-100洗下来，蛋白水解酶活性恢复。恢复活性的蛋白水解酶可把其相应位置的明胶消化掉，成为不能被着色的透明带。
为保持蛋白水解酶的活性，我们采取了以下几点措施：(1)制备SDS-PAGE电泳样品时，不煮样品，样品缓冲液不含破坏蛋白质结构的试剂，如β-疏基乙醇，DTT等；(2) 电泳在4℃、低电流(10mA/板)、低电压(样品在浓缩胶内电泳时，电压为50V；样品在分离胶内电泳时，电压为100V)进行；(3)用合适洗涤剂洗去胶板里和与蛋白水解酶结合的SDS、脲素；(4) 在合适的温度和保温液里使蛋白水解酶消化其相应位置的明胶。
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我们用这种活性电泳方法系统研究了蛋白水解酶在猕猴消化系统中的分布规律。从实验结果可以看出，同一系统不同器官之间蛋白水解酶的种类和活性有所不同，但同一系统中结构相似、执行相同或相近生理功能的器官具有种类、活性和pH依赖性相似的蛋白水解酶。例如：食管上段与食管下段之间；胃贲门与胃幽门之间；十二指肠、空肠与回肠之间；结肠、直肠与盲肠之间均具有十分相似的酶谱。
在pH3.5时，各器官均显出31、30、29kD 3条酶带，这些蛋白水解酶在中性、碱性条件下不表现活性或活性极弱。我们在猕猴生殖、泌尿、免疫等系统中也有相同发现[12]，其性质与文献报道的酸性溶酶体蛋白水解酶一致[1]。因此推测，这3种酶属于酸性溶酶体蛋白水解酶。
胃液呈酸性反应，胃蛋白酶只有在酸性较强的环境中才能发挥蛋白水解作用。结果表明，在酸性条件下，胃体中蛋白水解酶的活性最强，从而有助于蛋白质在胃内的初步消化。食糜由胃进入十二指肠后，开始了小肠内消化。小肠内消化是整个消化过程的最重要阶段。小肠液是一种弱碱性液体，pH约为7.6；胰液是碱性液体，pH约为7.8～8.4。实验结果表明，消化系统中蛋白水解酶的种类和数量比较多，其中，小肠和胰腺的蛋白水解酶种类最多，活性最强，食管以上、小肠以下部位的蛋白水解酶种类比较少，活性也较弱。就pH依赖性而言，最适pH为中性的蛋白水解酶占优势，这与小肠液在近中性条件下发挥作用相一致。在碱性条件下，除胰腺仍保持较高的蛋白水解酶活性外，其他部位的酶活性明显减弱或消失，这与胰液呈碱性反应相一致。由此可见，消化系统中，蛋白水解酶的种类、分布及pH依赖性与消化系统的正常生理功能相吻合。
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2D-G-PAGE发现在pH7.0时，胃体中检出12种、胰中检出34种、十二指肠中检出18种不同分子量或等电点的蛋白水解酶；在pH10.5时，十二指肠中检出12种、胰中检出21种不同分子量或等电点的蛋白水解酶。2D-G-PAGE显示出的蛋白水解酶的种类和数量比1D-G-PAGE明显增多，这可能是因为不同等电点的酶具有相同的分子量。
我们通过对太行山猕猴消化系统蛋白水解酶种类和性质研究，得到了1套较为完整的蛋白水解酶分布及活性数据，对诊断治疗人类的某些疾病有重要的临床意义。
在蛋白水解酶脱SDS和活性恢复过程中，保温液的pH值和所含的化学成分可影响蛋白水解酶的活性，因此，下一步我们将通过调节保温液的温度、pH值及保温时间和在保温液里加入酶的特异性底物、活化因子或抑制因子等来研究这些酶的性质、功能和鉴定这些酶的种类，以期探讨消化系统疾病与蛋白水解酶活性的关系。
* 国家自然科学基金资助课题(No.39670372)
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△ Department of Biology, Henan Normal University, Henan Xinxiang, 453002
参考文献
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图1 pH3.5时，消化系统的蛋白水解酶
a.舌 b.食管上段 c.食管中段 d.食管下段 e.胃贲门 f.胃体 g.胃幽门
图2 pH7.0时，消化系统的蛋白水解酶
a.舌 b.食管上段 c.食管中段 d.食管下段 e.胃贲门 f.胃体 g.胃幽门
图3 pH10.5时，消化系统的蛋白水解酶
a.舌 b.食管上段 c.食管中段 d.食管下段 e.胃贲门 f.胃体 g.胃幽门
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图4 pH7.0时十二指肠蛋白水解酶的分子量、等电点和活性
Fig.1 The activity of proteolytic enzymes in digestive system on the condition of pH3.5
a， tongue； b，upper esophagus； c，middle esophagus； d，bottom esophagus； e，stomachus cardiacus； f，stomachus body； g，stomachus pyloricus
Fig.2 The activity of proteolytic enzymes in digestive system on the condition of pH7.0
a， tongue； b，upper esophagus； c，middle esophagus； d，bottom esophagus； e，stomachus cardiacus； f，stomachus body； g，stomachus pyloricus
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Fig.3 The activity of proteolytic enzymes in digestive system on the condition of pH10.5
a， tongue； b，upper esophagus； c，middle esophagus； d，bottom esophagus； e，stomachus cardiacus； f，stomachus body； g，stomachus pyloricus
Fig.4 The MWS, pIs and activity of proteolytic enzymes in duodenum on the condition of pH7.0收稿1998-05 修回1998-12, 百拇医药
单位：吉爱玲 李彦章 向华 伍雁 封青川 徐存拴(河南师范大学生物系，新乡 453002)
关键词：蛋白水解酶；活性电泳(G-PAGE)；消化系统；猕猴
解剖学报990311
【摘要】 目的 研究太行山猕猴(Macaca mulatta tcheliensis)消化系统各器官蛋白水解酶种类和性质。 方法 采用单向活性电泳(1D-G-PAGE)和双向活性电泳(2D-G-PAGE)技术。 结果 (1)消化系统各器官的蛋白水解酶在近中性条件下活性最强，其中94、86、64、59和25kD蛋白水解酶在消化系统各器官中普遍存在；(2)消化系统各器官均具有31、30、和29kD 3种酸性蛋白水解酶；(3) pH7.0时，胃、胰、十二指肠中分别含有12、34和18种不同分子量或等电点的蛋白水解酶；(4)pH10.5时，胰、十二指肠中分别检出21和12种不同分子量或等电点的蛋白水解酶。 结论 消化系统中蛋白水解酶的种类和数量比较多，且结构相似、功能相近的器官之间，蛋白水解酶的种类和性质相似。
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STUDY ON KINDS AND PROPERTIES OF PROTEOLYTIC
ENZYMES IN DIGESTIVE SYSTEM OF
MACACA MULATTA TCHELIENSIS
Ji Ailing, Li Yanzhang, Xiang Hua, Wu Yan, Feng Qingchuan, Xu CunshuanΔ
(Department of Biology, Henan Normal University; Henan Xinxiang)
【Abstract】 Objective To study the kinds and properties of proteolytic enzymes in digestive system of Macaca mulatta tcheliensis.Methods The 1D-G-PAGE was mainly employed. Results (1) The most active proteolytic enzymes exist in neutral condition and 94，86，64，59 and 25kD proteolytic enzymes all exist. (2) Three kinds of different proteolytic enzymes 31, 30 and 29kD exist in different organs of digestive system.(3) On the condition of pH7.0, 12,34,18 kinds of proteolytic enzymes with different MW or pI exist in stomach, pancreas, duodenum respectively. (4) On the condition of pH10.5, 21 and 12 kinds of proteolytic enzymes with different MW or pI exist in pancreas, duodenum respectively. Conclusions There are many kinds of proteolytic enzymes in digestive system of Macaca mulatta tcheliensis, and proteolytic enzymes likeness exists between the organs with similar structure and similar functions.
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【Key words】 Proteolytic enzymes;G-PAGE;Digestive system; Macaca mulatta tcheliensis
蛋白水解酶在蛋白质的降解与特异性修饰、调节细胞生理活动、细胞分化与迁移、组织再生与修复、细胞凋亡等过程中起重要作用，同时也与很多病理过程有关[1～4]。
太行山猕猴在进化上与人类有很近的亲缘关系，是研究人体生理、病理的很好的实验材料[5]，据报道，Ca2+激活的中性蛋白酶在病理状态下，如断离神经纤维脂肪变性(wallerian degeneration)，与神经元纤维的退化有关[6]。但迄今为止，对猕猴组织器官蛋白水解酶的研究还较少，而系统研究猕猴消化系统各器官蛋白水解酶的种类和性质，尚未见报道。
活性电泳方法始建于本世纪70年代，具有直观、简便、灵敏性高、电泳后仍可保持蛋白质和蛋白酶生物活性等优点[7]。除定性分析外，可用摄像扫描密度计定量测定酶活性区域的透光值，计算机可根据透光值，计算出相应含量。我们用活性单向电泳(1D-G-PAGE)和活性双向电泳(2D-G-PAGE)方法对猕猴消化系统各器官中蛋白水解酶的种类、性质及pH依赖性进行了研究，以期探讨消化系统中蛋白水解酶的变化规律，并对其与消化系统各脏器生理功能间的可能关系进行了讨论。
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材料和方法
1. 材料
系河南师范大学生物系猕猴饲养场提供的正常雄性成年太行山猕猴，实验用猕猴共3只。所取脏器包括舌、食管上段、食管中段、食管下段、胃贲门、胃体、胃幽门、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、腮腺、颌下腺、舌下腺、肝和胰脏等。
2. 主要化学药品
丙烯酰胺(acrylamide, Sigma公司)、双丙烯酰胺(bisacrylamide, Fluka公司)、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED，Bio-Rad公司)、明胶(gelatin, Sigma公司)、曲拉通X-100(Triton X-100，Farco公司)、十二烷基磺酸钠(SDS，Serva公司)、牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base,上海巴斯生物公司)、标准分子量蛋白(Serva公司)、考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brillant blue R250, Fluka公司进口分装)、两性电解质(ampholyte，军事医学科学院)、乙基苯基聚乙二醇(nonidet P40，Fluka公司)。
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本实验所用其他化学药品均为分析纯。
3. 制备组织匀浆液
取猕猴消化系统各器官，冰浴匀浆，4℃离心(20 000g, 5 min)，分装上清液，保存于液氮中备用。
4. 蛋白质浓度测定
采用Neuhoff方法[8]。
5. 活性单向电泳(1D-G-PAGE)
按徐存拴改良的方法[9]进行。将0.083%的明胶共聚于10%聚丙烯酰胺凝胶里，电泳在4℃进行，样品在浓缩胶里电泳时，电压为50V，初始电流强度10 mA/板；样品在分离胶里电泳时，电流强度同上，电压≤100 V。待前沿指示剂(1%溴酚蓝)到达离胶板下缘2cm处时停止电泳，切除前沿指示剂以下部分后，将凝胶板放入胶板洗涤液(3.03g Tris-base，12ml Triton X-100，500ml双蒸水，pH6.5，20℃)中30min，每5min振荡1次，洗涤后，将胶板放入双蒸水中洗涤3次(5min/次)，然后将胶板置37℃(0.1mol/L glycin，5mmol/LCaCl2，pH分别是：3.5、5.9、7.0、10.5)，24h后，按Laemmli方法[10]固定、染色、脱色至酶活性区域清晰透亮(使用用过多次的旧脱色液脱色，效果更佳)。使用不同pH值的孵育液处理胶板可以进行蛋白水解酶的pH依赖性检测。
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6. 活性双向电泳(2D-G-PAGE)
以O′Farrell[11](1977)IEF-SDS-PAGE方法为基础进行改良。用于等电聚焦(IEF)的凝胶里不含DTT，样品缓冲液的尿素浓度≤5mol/L。电泳在4℃进行，电压250V，电流12h。等点聚焦结束后，胶条在洗涤液(80mmol/L Tris-Cl、2%SDS,pH6.8)里洗涤10min，然后将胶条预夹入离胶液槽上沿和左侧各1cm处的胶液槽(胶液槽厚1mm)里，把分离胶液注入胶液槽待凝固后，将上述洗涤液注入胶液槽内洗涤胶条2次(5min/次)，然后将洗涤液倒掉，用0.5mol/L Tris-Cl，pH6.8的缓冲液洗涤2次，之后把浓缩胶液注满整个胶液槽，其余步骤同1D-G-PAGE。
胶条的pH梯度测定：把胶条切成1cm长的胶段，将各胶段放入煮沸5min再冷却后的5 ml双蒸水里4h，然后测定双蒸水的pH值。
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结 果
1. 用活性单向电泳(1D-G-PAGE)分析蛋白水解酶的种类、性质和活性
1.1 pH3.5时消化系统各器官的蛋白水解酶种类及活性：在酸性条件下，31、30、29kD 3条酶带普遍存在于各受检器官中。从食管下段至胃幽门，出现47和43kD 2条活性酶带，它们在胃体中的活性最强。另外，86kD的酶带在胃贲门和胃幽门中出现，39kD的酶带在食管下段、胃体和胃幽门中出现，如图1所示。
在其他消化器官中，蛋白水解酶的种类及活性见表1所示。在十二指肠、空肠和回肠中，分别检出分子量从141kD至64kD等酶带，但活性较弱，而在其他受检器官中较少检出。
1.2 pH5.9和7.0时消化系统各器官的蛋白水解酶种类及活性：在pH5.9和7.0时，舌、食管上段、食管中段、食管下段、胃贲门、胃体和胃幽门均检出250、94、86、64、59和25kD 6条酶带，其中，94、86和25kD 3条酶带活性较强；另外，在食管上段、胃贲门和胃幽门中还检出49和41kD 2条酶带，如图2所示。
, 百拇医药
其他消化器官中，pH5.9时蛋白水解酶的种类及活性见表2所示，pH7.0时蛋白水解酶的种类及活性见表3所示。其中94、86、64、59、25kD 5条酶带普遍存在于受检器官中，活性也较强。尤其是，空肠和回肠所含蛋白水解酶的种类最多，活性最强。在各消化腺体中，胰腺所含酶的种类较多，活性也较强。
1.3 pH10.5时消化系统各器官的蛋白水解酶种类及活性：在pH10.5时，舌、食管上段、食管中段、食管下段、胃贲门、胃体和胃幽门均检出86和25kD 2条酶带；另外，在食管上段、胃贲门和胃幽门中还检出64和49kD 2条酶带，如图3所示。
在其他消化器官中，蛋白水解酶的种类及活性见表4所示。其中86、49、25kD 3条酶带普遍存在于受检器官中。与中性条件相比较，在碱性条件下，小肠仍保持较高的蛋白水解酶活性，尤其是在十二指肠中，酶的种类有所增多，活性也有所增强。而其他各部位的酶活性开始减弱或消失。
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表1 pH3.5时消化系统各器官蛋白水解酶种类及活性
Table 1 On the condition of pH3.5, the kinds and activity of proteolytic enzymes in digestive system 分子量
kD
十二指肠
duodenum
空肠
jejunum
回肠
ileum
盲肠
, 百拇医药
caecum
结肠
colon
直肠
rectum
腮腺
parotid gland
颌下腺
submandibular
gland
舌下腺
sublingual
, 百拇医药 gland
肝
liver
胰
pancreas
141
2+
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(+)活性弱 (2+)活性较弱 (3+)活性强 (4+)活性很强
(+)weak activity (2+)general activity (3+)strong activity (4+) stronger activity
表2 pH5.9时消化系统各器官蛋白水解酶种类及活性
Table 2 On the condition of pH5.9, the kinds and activity of proteolytic enzymes in digestive system 分子量
, 百拇医药
kD
十二指肠
duodenum
空肠
jejunum
回肠
ileum
盲肠
caecum
结肠
colon
直肠
rectum
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腮腺
parotid gland
颌下腺
submandibular
gland
舌下腺
sublingual
gland
肝
liver
胰
pancreas
, 百拇医药 250
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4+
3+
3+
3+
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+和其前面系数的含义同表1。
+ and their coefficient here mean the same as those of table 1 do.
表3 pH7.0时消化系统各器官蛋白水解酶种类及活性
Table 3 On the condition of pH7.0, the kinds and activity of proteolytic enzymes in digestive system 分子量
, 百拇医药 kD
十二指肠
duodenum
空肠
jejunum
回肠
ileum
盲肠
caecum
结肠
colon
直肠
rectum
, 百拇医药
腮腺
parotid gland
颌下腺
submandibular
gland
舌下腺
sublingual
gland
肝
liver
胰
pancreas
, 百拇医药 250
2+
2+
2+
2+
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3+
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+和其前面系数的含义同表1。
+and their coefficient here mean the same as those of table 1 do.
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表4 pH10.5时消化系统各器官蛋白水解酶种类及活性
Table 4 On the condition of pH10.5 the kinds and activity of proteolytic enzymes in digestive system 分子量
kD
十二指肠
duodenum
空肠
jejunum
回肠
ileum
盲肠
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caecum
结肠
colon
直肠
rectum
腮腺
parotid gland
颌下腺
submandibular
gland
舌下腺
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, 百拇医药 gland
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liver
胰
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+和其前面系数的含义同表1。
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+and their coefficient here mean the same as those of table 1 do.
2. 用活性双向电泳分析蛋白水解酶的种类、性质和活性
2.1 在孵育液为pH7.0的条件下：在pH7.0时，十二指肠中检出18种不同分子量或等电点的酶(图4)；分别为113kD(pI6.0)、113kD(pI5.64)、94kD(pI6.0)、94kD(pI5.64)、86kD(pI6.0)、86kD(pI5.64)、78kD(pI5.64)、67kD(pI5.64)、64kD(pI6.0)、64kD(pI5.64)、59kD(pI5.64)、53kD(pI5.19)、49kD(pI5.64)、30kD(pI5.64)、25kD(pI6.0)、25kD(pI5.64)、22kD(pI5.64)和20kD(pI5.64)。用同样的方法显示胃体中含有12种不同分子量或等电点的酶(表5)；胰中含有34种不同分子量或等电点的酶(表6)。
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表5 活性双向电泳分析pH7.0时胃体蛋白水解酶的种类
Table 5 2D-G-PAGE analysis of the proteolytic
enzymes in stomach on the condition of pH7.0
分子量molecular weight(kD)
113
94
86
64
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36
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等电点(pI)
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表6 活性双向电泳分析pH7.0时胰蛋白水解酶的种类
Table 6 2D-G-PAGE analysis of the proteolytic enzymes
in pancreas on the condition of pH7.0
分子量 molecular weight (kD)
113
94
, http://www.100md.com
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2.2 在孵育液为pH10.5的条件下：在pH10.5时，胰中检出21种不同分子量或等电点的酶(表7)；十二指肠中检出12种不同分子量或等电点的酶(表8)。
表7 活性双向电泳分析pH10.5时胰蛋白水解酶的种类
Table 7 2D-D-PAGE analysis of the proteolytic enzymes
in pancreas on the condition of pH10.5
分子量 molecular weight(kD)
94
86
64
, 百拇医药
53
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39
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表8 活性双向电泳分析pH10.5时十二指肠蛋白水解酶的种类
Table 8 2D-G-PAGE analysis of the proteolytic enzymes
in duodenum on the condition of pH10.5
, 百拇医药
分子量 molecular weight (kD)
113
94
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等电点(pI)
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讨 论
蛋白质水解是细胞的重要代谢过程，这一代谢过程对生命是必不可少的，蛋白水解酶在其中起重要的作用。
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我们所采用的活性电泳方法是一种专门显示蛋白水解酶的方法。该方法既可用于测定分离纯化的酶活性，又可用于直接测定分析细胞匀浆液里的蛋白水解酶活性，我们正是通过这种方法直接测定分析了猕猴消化系统各器官组织匀浆液里的蛋白水解酶种类及活性，样品制备简便。活性电泳方法的基本原理是：SDS-聚丙烯酰胺凝胶里共聚有明胶(如果用Coomassie Brillant blue R250染色，整个胶板被染成蓝色)，电泳后，用非离子去垢剂(如Triton X-100)处理胶板，SDS被Triton X-100洗下来，蛋白水解酶活性恢复。恢复活性的蛋白水解酶可把其相应位置的明胶消化掉，成为不能被着色的透明带。
为保持蛋白水解酶的活性，我们采取了以下几点措施：(1)制备SDS-PAGE电泳样品时，不煮样品，样品缓冲液不含破坏蛋白质结构的试剂，如β-疏基乙醇，DTT等；(2) 电泳在4℃、低电流(10mA/板)、低电压(样品在浓缩胶内电泳时，电压为50V；样品在分离胶内电泳时，电压为100V)进行；(3)用合适洗涤剂洗去胶板里和与蛋白水解酶结合的SDS、脲素；(4) 在合适的温度和保温液里使蛋白水解酶消化其相应位置的明胶。
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我们用这种活性电泳方法系统研究了蛋白水解酶在猕猴消化系统中的分布规律。从实验结果可以看出，同一系统不同器官之间蛋白水解酶的种类和活性有所不同，但同一系统中结构相似、执行相同或相近生理功能的器官具有种类、活性和pH依赖性相似的蛋白水解酶。例如：食管上段与食管下段之间；胃贲门与胃幽门之间；十二指肠、空肠与回肠之间；结肠、直肠与盲肠之间均具有十分相似的酶谱。
在pH3.5时，各器官均显出31、30、29kD 3条酶带，这些蛋白水解酶在中性、碱性条件下不表现活性或活性极弱。我们在猕猴生殖、泌尿、免疫等系统中也有相同发现[12]，其性质与文献报道的酸性溶酶体蛋白水解酶一致[1]。因此推测，这3种酶属于酸性溶酶体蛋白水解酶。
胃液呈酸性反应，胃蛋白酶只有在酸性较强的环境中才能发挥蛋白水解作用。结果表明，在酸性条件下，胃体中蛋白水解酶的活性最强，从而有助于蛋白质在胃内的初步消化。食糜由胃进入十二指肠后，开始了小肠内消化。小肠内消化是整个消化过程的最重要阶段。小肠液是一种弱碱性液体，pH约为7.6；胰液是碱性液体，pH约为7.8～8.4。实验结果表明，消化系统中蛋白水解酶的种类和数量比较多，其中，小肠和胰腺的蛋白水解酶种类最多，活性最强，食管以上、小肠以下部位的蛋白水解酶种类比较少，活性也较弱。就pH依赖性而言，最适pH为中性的蛋白水解酶占优势，这与小肠液在近中性条件下发挥作用相一致。在碱性条件下，除胰腺仍保持较高的蛋白水解酶活性外，其他部位的酶活性明显减弱或消失，这与胰液呈碱性反应相一致。由此可见，消化系统中，蛋白水解酶的种类、分布及pH依赖性与消化系统的正常生理功能相吻合。
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2D-G-PAGE发现在pH7.0时，胃体中检出12种、胰中检出34种、十二指肠中检出18种不同分子量或等电点的蛋白水解酶；在pH10.5时，十二指肠中检出12种、胰中检出21种不同分子量或等电点的蛋白水解酶。2D-G-PAGE显示出的蛋白水解酶的种类和数量比1D-G-PAGE明显增多，这可能是因为不同等电点的酶具有相同的分子量。
我们通过对太行山猕猴消化系统蛋白水解酶种类和性质研究，得到了1套较为完整的蛋白水解酶分布及活性数据，对诊断治疗人类的某些疾病有重要的临床意义。
在蛋白水解酶脱SDS和活性恢复过程中，保温液的pH值和所含的化学成分可影响蛋白水解酶的活性，因此，下一步我们将通过调节保温液的温度、pH值及保温时间和在保温液里加入酶的特异性底物、活化因子或抑制因子等来研究这些酶的性质、功能和鉴定这些酶的种类，以期探讨消化系统疾病与蛋白水解酶活性的关系。
* 国家自然科学基金资助课题(No.39670372)
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△ Department of Biology, Henan Normal University, Henan Xinxiang, 453002
参考文献
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图1 pH3.5时，消化系统的蛋白水解酶
a.舌 b.食管上段 c.食管中段 d.食管下段 e.胃贲门 f.胃体 g.胃幽门
图2 pH7.0时，消化系统的蛋白水解酶
a.舌 b.食管上段 c.食管中段 d.食管下段 e.胃贲门 f.胃体 g.胃幽门
图3 pH10.5时，消化系统的蛋白水解酶
a.舌 b.食管上段 c.食管中段 d.食管下段 e.胃贲门 f.胃体 g.胃幽门
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图4 pH7.0时十二指肠蛋白水解酶的分子量、等电点和活性
Fig.1 The activity of proteolytic enzymes in digestive system on the condition of pH3.5
a， tongue； b，upper esophagus； c，middle esophagus； d，bottom esophagus； e，stomachus cardiacus； f，stomachus body； g，stomachus pyloricus
Fig.2 The activity of proteolytic enzymes in digestive system on the condition of pH7.0
a， tongue； b，upper esophagus； c，middle esophagus； d，bottom esophagus； e，stomachus cardiacus； f，stomachus body； g，stomachus pyloricus
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Fig.3 The activity of proteolytic enzymes in digestive system on the condition of pH10.5
a， tongue； b，upper esophagus； c，middle esophagus； d，bottom esophagus； e，stomachus cardiacus； f，stomachus body； g，stomachus pyloricus
Fig.4 The MWS, pIs and activity of proteolytic enzymes in duodenum on the condition of pH7.0收稿1998-05 修回1998-12, 百拇医药