以HRP及氚水作示踪剂研究脑脊液的回流途径
作者：董剑平孙善全
单位：董剑平 孙善全(重庆医科大学解剖学教研室，重庆 400016)
关键词：脑脊液循环；脑室周围器官；鼻粘膜下组织间隙；嗅丝周围间隙
解剖学报990308 【摘要】 目的 研究脑脊液(CSF)的正常回流途径。 方法 将HRP、氚水作为示踪剂分别缓慢注入两组大白鼠侧脑室。应用光、电镜技术和液闪、放射自显影技术对HRP和氚水在脑组织中分布状况进行观察。 结果 在脑室周围器官及脑室周围室管膜、软脑膜层有HRP反应产物的聚集，在鼻中隔的鼻粘膜下组织间隙、嗅丝周围间隙及静脉周围和管腔内也可见到HRP反应产物；液闪计数显示，大白鼠的脉络丛、脑垂体、最后区、松果体等脑室周围器官放射性活度明显高于本底；放射自显影显示大白鼠脑组织神经层细胞内有散在分布的银颗粒。 结论 CSF可经由脑室周围器官、脑膜及鼻粘膜下静脉网汇入体循环，同时CSF可回流至大脑神经细胞层，参与形成神经细胞层组织液，与维持脑的正常功能有关。
, http://www.100md.com
A STUDY ON THE ROUTE OF CSF ABSORPTION BY
USING HRP AND 3H2O AS TRACERS
Dong Jianping, Sun ShanquanΔ
(Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing)
【Abstract】 Objective To define the route for the cerebrospinal fluid(CSF) absorption. Methods Horseradish peroxidase(HRP) and 3H2O were injected into the lateral ventricle of two groups of the rats, respectively. To observe the distribution of HRP and 3H2O in the rat brain, light microscopy, electron microscopy, sintillation count and radioautography were applied. Results The choroid plexus, hypophysis, area postrema and pineal body, namely, circumventricular organs(CVOs) and ependyma as well as pia mater layers were stained by the HRP reaction products.The HRP reaction products were observed in the tissue space of membrane mucosa nasi, around the fila olfactoria and venules, and within the venules under the light microscopy and electron microscopy, also. Scintillation count showed that the radioactivity of the CVOs was higher than that of the background. The radioautography showed that the scattered grains of silver existed within the cells of neurocyte layer also. Conclusion The results indicate that the CSF drains into the general circulation through the venules of the CVOs and the meninges of the brain, and the venous plexus in the submucosa of the nasal; and CSF might be play an important role for the metabolism of the brain.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebrospinal fluid circulate; Circumventricular organs; Tissue space of membrane mucosa nasi; Peripheral space of fila olfactoria
脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF) 的生成、吸收与脑的血液循环有着密切关系。CSF循环一直受到国内外神经科学工作者的关注。长期以来，人们在这一领域做了大量研究工作[1～12]。CSF循环障碍可导致一系列急慢性中枢神经系统功能紊乱，因此，对CSF及其循环进行研究，不仅具有重要的理论意义，而且具有重要的临床意义。
目前国内外研究资料[1～5]表明，关于CSF的循环途径尚未形成统一意见。
本实验分别采用HRP及氚水作为示踪剂，运用光镜、酶标电镜、液闪计数、放射自显影技术，对CSF回流途径进行了研究，以完善CSF循环的概念。
, http://www.100md.com
材料和方法
选用成年健康Wistar大白鼠50只(150～250g)，雌雄不拘。经2%戊巴比妥(0.5 ml/100g)腹腔注射麻醉。继而在定位仪上将其固定于耳杆平面。经前囟旁1.5 mm打孔，垂直进针3.5 mm进入侧脑室，分别用HRP和氚水作为示踪剂或生理盐水作为对照剂注入其中。
1. 以HRP为示踪剂研究CSF回流途径的光、电镜标本制作过程
健康成年雌、雄性Wistar大白鼠16只，分为实验组14只，对照组2只。将20 mg HRP(中国科学院上海生化所东风生化技术公司生产)溶解于0.1ml蒸馏水中，15～30 min缓慢注入实验组大白鼠侧脑室。推注结束30min后，断颈处死大白鼠，迅速开颅、并将头部置于-18℃的丙酮中。冷冻后解剖出完整的脑，于-18℃的温度下，在恒冷切片机内作正中矢状切和偏正中矢状切，取鼻中隔作矢状切和水平切，切片厚度均为30 μm。切片在室温中干燥。后置于含2%多聚甲醛-戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液中漂洗3～4h。漂洗后的切片在加入50 mg DAB的100 ml Tris-HCl液中孵育10 min，pH7.6， 4℃。在孵育液中加入0.33%的H2O2 1 ml,20℃，继续孵育15 min。迅速用蒸馏水冲洗切片，苏木精复染，树脂封片。
, 百拇医药
对照实验将生理盐水注入侧脑室，其余实验步骤同实验组。电镜标本的制作则是将HRP注射完毕，动物处死后，取其脑垂体、松果体、鼻中隔，恒冷切片(片厚30 μm)。将上述组织切片与侧脑室脉络丛一道固定、漂洗、孵育，方法同光镜。然后用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗，再移入1%锇酸中固定、染色，经梯度酒精和丙酮脱水等步骤后，环氧树酯801包埋，超薄切片，透射电镜下观察、摄片。
2. 以氚水作为示踪剂研究CSF回流途径
成年健康雌、雄性Wistar大白鼠20只，实验组15只，对照组5只。实验组大白鼠经侧脑室注入5 μl氚水(1 mci/ml)，注射时间为5～10 min,注射结束后立即处死实验动物。在恒冷切片机上进行脑正中、偏正中矢状切，切片厚度3～5 μm。切片经酒精蒸气固定，涂布火棉胶保护层，于暗室内涂布核乳胶。待乳胶阴干后收入曝光盒中，在-4℃干燥条件下曝光，时间为15～30d。曝光完毕后显影、定影、水洗，最后用苏木精复染，树脂封片。
, 百拇医药
对照组注射生理盐水进入大白鼠侧脑室，其余步骤同实验组。
3. 液闪计数实验
成年健康雌、雄性Wistar大白鼠14只，实验组对照组各7只。将5 μl氚水注入实验大白鼠侧脑室后，处死大白鼠，解剖出脑组织，分别取其脉络丛、脑垂体、松果体、最后区并称重。将上述标本分别置于闪烁测量杯中，加入高氯酸0.1 ml作为消化剂，30%H2O2 0.2 ml作为脱色剂，放置于80℃的恒温水浴箱内消化1h。消化后加入POPPO闪烁液5 ml，进行匀相液闪示踪测定。
对照组除侧脑室注入生理盐水外，其余步骤同实验组。
结 果
1. HRP在脑组织的分布
, http://www.100md.com 将HRP经侧脑室注入，30min后处死大白鼠，可以发现脑的部分区域被酶浓染。在光镜下，可见脉络丛、最后区等脑室周围器官有HRP反应产物的浓集，在室管膜、软脑膜中也可见到HRP反应产物。应特别指出的是在鼻中隔及其粘膜的矢状切面上发现嗅丝周围及其附近的静脉血管网周围有大量HRP反应产物堆积，在微小静脉管腔内也可发现HRP反应产物结晶(图1，2)。并且在鼻中隔的水平切面可观察到部分嗅丝横断面旁存在“半月”形空白区。在其周围可见高度聚集的HRP反应产物(图1，2)。
透射电镜观察，在鼻粘膜上皮细胞间隙可见高电子密度的卵圆形HRP反应产物(图3)。在腺垂体细胞间可见形态不规则的高电子密度HRP反应产物(图4)。为防止污染，上述电镜标本的制作均用锇酸固定、染色，未经铅染。
2. 氚水在脑组织的分布
2.1 放射自显影结果：经侧脑室注入5 μl氚水，迅速处死大白鼠后，在放射自显影处理的脑组织切片中，于光镜下可见其神经细胞层有散在分布的银颗粒(图5)。
, 百拇医药
2.2 液闪计数结果：见附表
附表 大白鼠不同脑组织液闪计数统计表
Table The results of the scintillation count in the different brain tissues of the rat 组别
groups
脉络丛
choroid plexus
脑垂体
hypophysis
松果体
pineal body
, http://www.100md.com
极后区
area postrema
本底
background
实验组 (experiment group)
66 450.0±14 890.0
17 600.0±4 020.0
28 375.0±6 500.0
44 125.0±8 830.0
6 690.0±610.0
对照组 (control group)
, 百拇医药
6 600.0±605.0
6 950.0±660.0
6 250.0±560.0
6 575.0±605.0
6 430.0±565.0
数值单位为CMP，CMP为单位重量(g)的液闪计数值。
The unit in the table is CMP which refers to the number of scintillation of per gram
液闪计数实验采用BECKMAN LS1801液闪计数仪测定。
上述实验数据显示，实验鼠脉络丛、脑垂体、松果体、最后区等脑室周围器官液闪计数明显高于本底，有放射性增强。而空白对照组脑室周围器官液闪计数则与本底相似。
, 百拇医药
讨 论
本世纪初，人们对CSF循环即进行了研究。Weed[1]于1923年提出CSF吸收的特定部位是蛛网膜绒毛，从那时起人们普遍接受了这一观点。但从生物个体发育和种系发生的角度来看，这个观点存在着矛盾。因为某些低等动物的硬脑膜窦中不存在蛛网膜绒毛，而某些高等哺乳动物蛛网膜绒毛的出现却晚于CSF的产生[3]。Weed的观点显然不能解释在某些动物体内蛛网膜绒毛出现以前，CSF循环已经存在这一事实。
虽然Weed提出了蛛网膜绒毛是吸收CSF进入静脉系统的部位，但他并没有找到蛛网膜绒毛吸收CSF的直接证据[2]。Welch 和 Friedman[4]给蛛网膜绒毛引入“阀”(valve)的概念，把蛛网膜绒毛看作是一个控制CSF回流的阀门，认为蛛网膜绒毛只有在CSF过多，颅内压升高时才开放，但他们也未能找到蛛网膜绒毛直接吸收CSF进入血循环的证据。Tripathi[5]提出蛛网膜绒毛的上皮细胞是一个有着“巨大窗孔”的上皮细胞(large opening on the kendothelium of the arachnoid villus)。但这种上皮细胞的“窗孔”只有在CSF高压的条件下才得以证实[11]。
, 百拇医药
日本桥本一成[6]的实验显示，在注入HRP后，于松果体、脑垂体、脉络丛等脑室周围器官内观察到HRP反应颗粒的聚集，并很快在Galen静脉系统内检测出HRP的存在。虽然目前对CSF如何进入脑室周围器官的机制还不十分清楚，但上述研究已经提示CSF可直接经脑室周围器官进入体循环。
同时，既往研究表明[3]，大白鼠的硬脑膜静脉窦内未见蛛网膜绒毛结构。而一些更高等哺乳动物在蛛网膜绒毛出现以前，CSF循环已经存在，其蛛网膜绒毛随着动物年龄的增长，逐渐发育成熟，体积和数量也相应增长。桥本[6]利用电镜观察了日本猴的蛛网膜绒毛，发现蛛网膜绒毛有着连续的，较易突破的上皮，上皮细胞表面并未见明显窗孔。反之，脑室周围器官的静脉端毛细血管多为有孔静脉端毛细血管。在我们的实验中，经大白鼠侧脑室注入HRP示踪剂30 min后，不仅包括脉络丛在内的脑室周围器官组织内发现有HRP反应产物的聚集，而且在室管膜层、软脑膜和鼻中隔粘膜下组织内也可见HRP反应产物。
, http://www.100md.com
综合我们的实验及其他学者的研究[3，6，7，12]，可以提示包含脉络丛在内的脑室周围器官的有孔静脉毛细血管为CSF进入血循环的基本通路，脑室周围器官是CSF回流的渠道之一；另外，CSF还可以通过室管膜及软脑膜层回流至体循环。脉络丛既参与CSF产生，又参与CSF回流。而蛛网膜绒毛可能在颅内压增加等条件下开放，引流CSF进入血循环，对CSF循环起调节作用。同时，蛛网膜绒毛可能在免疫应答中发挥一定的作用[12]，应特别指出的是，除上述观察结果外，我们还观察到在鼻中隔粘膜下组织的嗅丝及其附近的网状静脉血管周围有HRP反应产物的聚集，在微小静脉的管腔内也出现了HRP反应产物。嗅丝横断面旁可见“半月形”空白区，我们称它为“嗅丝周围间隙”。在这些间隙周围，可见HRP阳性反应产物。透射电镜也观察到在嗅粘膜细胞间隙有大小不等，形状不一的高电子密度HRP反应产物。这提示在正常状态下，CSF还可能经“嗅丝周围间隙”出筛孔，到达鼻粘膜下组织间隙，再经微静脉进入体循环。据文献查阅结果，描述这条途径尚属首次。
, 百拇医药
HRP作为一个蛋白质示踪剂，它的分子量为43kD。而CSF的主要成分为水、电解质以及少量蛋白质，因此仅用HRP来示踪CSF回流途径具有一定局限性。为了从另一侧面反应CSF的正常回流途径，我们选用了与CSF的主要成分及水理化性质基本相同的氚水作为示踪剂。
氚水注入大白鼠侧脑室后，液闪计数显示大白鼠的脉络丛、脑垂体、松果体、最后区等脑室周围器官的放射性明显高于本底，说明氚水可到达上述脑室周围器官，这进一步提示CSF可经脑室周围器官的微静脉回流到Galen静脉系统。
放射自显影实验显示大脑神经细胞层内可见散在银颗粒，证明氚水可从脑室到达神经细胞层，这与HRP示踪实验的HRP的反应产物分布范围有明显差别，而HRP反应物仅限于脑室周围器官及脑室室管膜层。上述实验结果可以看出，CSF可通过室管膜到达大脑神经细胞层，参与形成神经元、神经胶质细胞间的组织液，提示脑组织细胞间的组织液不仅来自于体循环，而且来自于CSF循环。一般认为，组织液在维持组织细胞正常代谢及保持其内环境稳定中起重要的作用。因此，我们认为CSF循环不仅与颅内压、脑灌注压等因素有关，同时在维持脑的正常代谢、神经元与神经胶质细胞内环境的稳定，并在保持其正常功能活动中发挥着积极作用。
, 百拇医药
图1 鼻中隔及其粘膜的矢状切面上，可见嗅丝(0)及其附近的静脉血管网周围有大量HRP反应产物(▲)聚集，在微小静脉管腔内也出现HRP反应产物。×20
图2 鼻中隔水平切面，部分嗅丝(0)横断面旁存在“半月”形空白区(▲)，即嗅丝周围间隙。其间隙周围有高度聚集的HRP反应产物。×20
图3 鼻粘膜支持细胞间可见大量高电子密度的，大小不等的椭圆形HRP反应产物(h)。×17 000
图4 于腺垂体细胞间可见不规则的高电子密度HRP反应产物(▲)，(n)为细胞核 ×15 000
图5 在丘脑及其周围结构脑组织神经细胞层可见散在银颗粒。×300
Fig. 1 Light micrograph of a sagittal section of the nasal septum. A number of HRP reaction production (▲) can be seen nearby the fila olfactorias(0) and venules as well as within the venule lumen.×20
, 百拇医药
Fig. 2 Light micrograph of a horizontal section of the nasal septum. Semilunar shaped space(▲) can be seen in some of the fila olfactorias(0), which were called peripheral space of fila olfactoria by us. The HRP reaction production exists around the edge of the spaces.×20
Fig. 3 Transmission electron micrograph. The HRP reaction production(h) can be observed between the supporting cells of the membrane mucosa nasi.×17 000
Fig. 4 Transmission electron micrograph from the rat brain. The high dense irregular electronic particles (▲) can be seen between the cells of the adenohypophysis.n:nuclear ×15 000
, 百拇医药
Fig. 5 Radioautograph of the sagittal section of the rat brain. It shows the scattered grains of silver within the neurocyte layer of the rat thalamus and its surrounding structures.×300
* △ Department of Anatomy, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016,China
参考文献
[1]Weed LH. The absorption of cerebrospinal fluid into the venous system. Am J Anat, 1923,31(2)：191
, 百拇医药
[2]Weed LH. Forces concerned in the absorption of the cerebrospinal fluid. Am J Physiol, 1935,114(1):40
[3]Hashimoto PH, Gotow T, Ichimura T, et al. Visualization of the cerebrospinal fluid drainage into the Galen's vein. Arch Histol Jpn, 1985，48(2)：173
[4]Welch K, Friedman V. The cerebrospinal fluid valves. Brain, 1960,83(3)：454
[5]Tripathi R. Tracing the bulk outflow route of cerebrospinal fluid by transmission and scanning electron microscopy. Brain Res,1974,80(2)：503
, 百拇医药
[6]Hashimoto PH, Gotow T, Ichimura T, et al. Are the arachnoid villi really the main drainage route for the cerebrospinal fluid into the blood stream? An electron microscopic study. Okajimas Folia Anat Jpn, 1982，58：819
[7]Sun SQ, Hahimoto PH. Venous microvasculature of the pineal body and choroid plexus in the rat. J Electron Microsc,1992,40(1):29
[8]Cifuentes M, Fernandez LP, Perez J, et al. Distribution of intraventricularly injected horseradish peroxidase in cerebrospinal fluid compartments of rat spinal cord. Cell Tissue Res,1992,270(3):485
, 百拇医药
[9]Levin E, Sepulveda FV, Yudilevich DL.Pial vessels transport of substances from cerebrospinal fluid to blood. Nature,1974，249(5454)：266
[10]Saito Y, Wright EM. Regulation of bicarbonate transport across the brush border membrane of the bull-forg choroid plexus. J Physiol,1984,350:327
[11]Levine JE, Povlishock JT, Becker DP. The morphological correlates of primate cerebrospinal fluid absorption. Brain Res,1982,241(1):31
[12]Hashimoto PH. Aspects of normal cerebrospinal fluid circulation and circumventricular organs. Progress In Brain Research,1992，91(3)：439
收稿1998-06 修回1998-11, 百拇医药
单位：董剑平 孙善全(重庆医科大学解剖学教研室，重庆 400016)
关键词：脑脊液循环；脑室周围器官；鼻粘膜下组织间隙；嗅丝周围间隙
解剖学报990308 【摘要】 目的 研究脑脊液(CSF)的正常回流途径。 方法 将HRP、氚水作为示踪剂分别缓慢注入两组大白鼠侧脑室。应用光、电镜技术和液闪、放射自显影技术对HRP和氚水在脑组织中分布状况进行观察。 结果 在脑室周围器官及脑室周围室管膜、软脑膜层有HRP反应产物的聚集，在鼻中隔的鼻粘膜下组织间隙、嗅丝周围间隙及静脉周围和管腔内也可见到HRP反应产物；液闪计数显示，大白鼠的脉络丛、脑垂体、最后区、松果体等脑室周围器官放射性活度明显高于本底；放射自显影显示大白鼠脑组织神经层细胞内有散在分布的银颗粒。 结论 CSF可经由脑室周围器官、脑膜及鼻粘膜下静脉网汇入体循环，同时CSF可回流至大脑神经细胞层，参与形成神经细胞层组织液，与维持脑的正常功能有关。
, http://www.100md.com
A STUDY ON THE ROUTE OF CSF ABSORPTION BY
USING HRP AND 3H2O AS TRACERS
Dong Jianping, Sun ShanquanΔ
(Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing)
【Abstract】 Objective To define the route for the cerebrospinal fluid(CSF) absorption. Methods Horseradish peroxidase(HRP) and 3H2O were injected into the lateral ventricle of two groups of the rats, respectively. To observe the distribution of HRP and 3H2O in the rat brain, light microscopy, electron microscopy, sintillation count and radioautography were applied. Results The choroid plexus, hypophysis, area postrema and pineal body, namely, circumventricular organs(CVOs) and ependyma as well as pia mater layers were stained by the HRP reaction products.The HRP reaction products were observed in the tissue space of membrane mucosa nasi, around the fila olfactoria and venules, and within the venules under the light microscopy and electron microscopy, also. Scintillation count showed that the radioactivity of the CVOs was higher than that of the background. The radioautography showed that the scattered grains of silver existed within the cells of neurocyte layer also. Conclusion The results indicate that the CSF drains into the general circulation through the venules of the CVOs and the meninges of the brain, and the venous plexus in the submucosa of the nasal; and CSF might be play an important role for the metabolism of the brain.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebrospinal fluid circulate; Circumventricular organs; Tissue space of membrane mucosa nasi; Peripheral space of fila olfactoria
脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF) 的生成、吸收与脑的血液循环有着密切关系。CSF循环一直受到国内外神经科学工作者的关注。长期以来，人们在这一领域做了大量研究工作[1～12]。CSF循环障碍可导致一系列急慢性中枢神经系统功能紊乱，因此，对CSF及其循环进行研究，不仅具有重要的理论意义，而且具有重要的临床意义。
目前国内外研究资料[1～5]表明，关于CSF的循环途径尚未形成统一意见。
本实验分别采用HRP及氚水作为示踪剂，运用光镜、酶标电镜、液闪计数、放射自显影技术，对CSF回流途径进行了研究，以完善CSF循环的概念。
, http://www.100md.com
材料和方法
选用成年健康Wistar大白鼠50只(150～250g)，雌雄不拘。经2%戊巴比妥(0.5 ml/100g)腹腔注射麻醉。继而在定位仪上将其固定于耳杆平面。经前囟旁1.5 mm打孔，垂直进针3.5 mm进入侧脑室，分别用HRP和氚水作为示踪剂或生理盐水作为对照剂注入其中。
1. 以HRP为示踪剂研究CSF回流途径的光、电镜标本制作过程
健康成年雌、雄性Wistar大白鼠16只，分为实验组14只，对照组2只。将20 mg HRP(中国科学院上海生化所东风生化技术公司生产)溶解于0.1ml蒸馏水中，15～30 min缓慢注入实验组大白鼠侧脑室。推注结束30min后，断颈处死大白鼠，迅速开颅、并将头部置于-18℃的丙酮中。冷冻后解剖出完整的脑，于-18℃的温度下，在恒冷切片机内作正中矢状切和偏正中矢状切，取鼻中隔作矢状切和水平切，切片厚度均为30 μm。切片在室温中干燥。后置于含2%多聚甲醛-戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液中漂洗3～4h。漂洗后的切片在加入50 mg DAB的100 ml Tris-HCl液中孵育10 min，pH7.6， 4℃。在孵育液中加入0.33%的H2O2 1 ml,20℃，继续孵育15 min。迅速用蒸馏水冲洗切片，苏木精复染，树脂封片。
, 百拇医药
对照实验将生理盐水注入侧脑室，其余实验步骤同实验组。电镜标本的制作则是将HRP注射完毕，动物处死后，取其脑垂体、松果体、鼻中隔，恒冷切片(片厚30 μm)。将上述组织切片与侧脑室脉络丛一道固定、漂洗、孵育，方法同光镜。然后用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗，再移入1%锇酸中固定、染色，经梯度酒精和丙酮脱水等步骤后，环氧树酯801包埋，超薄切片，透射电镜下观察、摄片。
2. 以氚水作为示踪剂研究CSF回流途径
成年健康雌、雄性Wistar大白鼠20只，实验组15只，对照组5只。实验组大白鼠经侧脑室注入5 μl氚水(1 mci/ml)，注射时间为5～10 min,注射结束后立即处死实验动物。在恒冷切片机上进行脑正中、偏正中矢状切，切片厚度3～5 μm。切片经酒精蒸气固定，涂布火棉胶保护层，于暗室内涂布核乳胶。待乳胶阴干后收入曝光盒中，在-4℃干燥条件下曝光，时间为15～30d。曝光完毕后显影、定影、水洗，最后用苏木精复染，树脂封片。
, 百拇医药
对照组注射生理盐水进入大白鼠侧脑室，其余步骤同实验组。
3. 液闪计数实验
成年健康雌、雄性Wistar大白鼠14只，实验组对照组各7只。将5 μl氚水注入实验大白鼠侧脑室后，处死大白鼠，解剖出脑组织，分别取其脉络丛、脑垂体、松果体、最后区并称重。将上述标本分别置于闪烁测量杯中，加入高氯酸0.1 ml作为消化剂，30%H2O2 0.2 ml作为脱色剂，放置于80℃的恒温水浴箱内消化1h。消化后加入POPPO闪烁液5 ml，进行匀相液闪示踪测定。
对照组除侧脑室注入生理盐水外，其余步骤同实验组。
结 果
1. HRP在脑组织的分布
, http://www.100md.com 将HRP经侧脑室注入，30min后处死大白鼠，可以发现脑的部分区域被酶浓染。在光镜下，可见脉络丛、最后区等脑室周围器官有HRP反应产物的浓集，在室管膜、软脑膜中也可见到HRP反应产物。应特别指出的是在鼻中隔及其粘膜的矢状切面上发现嗅丝周围及其附近的静脉血管网周围有大量HRP反应产物堆积，在微小静脉管腔内也可发现HRP反应产物结晶(图1，2)。并且在鼻中隔的水平切面可观察到部分嗅丝横断面旁存在“半月”形空白区。在其周围可见高度聚集的HRP反应产物(图1，2)。
透射电镜观察，在鼻粘膜上皮细胞间隙可见高电子密度的卵圆形HRP反应产物(图3)。在腺垂体细胞间可见形态不规则的高电子密度HRP反应产物(图4)。为防止污染，上述电镜标本的制作均用锇酸固定、染色，未经铅染。
2. 氚水在脑组织的分布
2.1 放射自显影结果：经侧脑室注入5 μl氚水，迅速处死大白鼠后，在放射自显影处理的脑组织切片中，于光镜下可见其神经细胞层有散在分布的银颗粒(图5)。
, 百拇医药
2.2 液闪计数结果：见附表
附表 大白鼠不同脑组织液闪计数统计表
Table The results of the scintillation count in the different brain tissues of the rat 组别
groups
脉络丛
choroid plexus
脑垂体
hypophysis
松果体
pineal body
, http://www.100md.com
极后区
area postrema
本底
background
实验组 (experiment group)
66 450.0±14 890.0
17 600.0±4 020.0
28 375.0±6 500.0
44 125.0±8 830.0
6 690.0±610.0
对照组 (control group)
, 百拇医药
6 600.0±605.0
6 950.0±660.0
6 250.0±560.0
6 575.0±605.0
6 430.0±565.0
数值单位为CMP，CMP为单位重量(g)的液闪计数值。
The unit in the table is CMP which refers to the number of scintillation of per gram
液闪计数实验采用BECKMAN LS1801液闪计数仪测定。
上述实验数据显示，实验鼠脉络丛、脑垂体、松果体、最后区等脑室周围器官液闪计数明显高于本底，有放射性增强。而空白对照组脑室周围器官液闪计数则与本底相似。
, 百拇医药
讨 论
本世纪初，人们对CSF循环即进行了研究。Weed[1]于1923年提出CSF吸收的特定部位是蛛网膜绒毛，从那时起人们普遍接受了这一观点。但从生物个体发育和种系发生的角度来看，这个观点存在着矛盾。因为某些低等动物的硬脑膜窦中不存在蛛网膜绒毛，而某些高等哺乳动物蛛网膜绒毛的出现却晚于CSF的产生[3]。Weed的观点显然不能解释在某些动物体内蛛网膜绒毛出现以前，CSF循环已经存在这一事实。
虽然Weed提出了蛛网膜绒毛是吸收CSF进入静脉系统的部位，但他并没有找到蛛网膜绒毛吸收CSF的直接证据[2]。Welch 和 Friedman[4]给蛛网膜绒毛引入“阀”(valve)的概念，把蛛网膜绒毛看作是一个控制CSF回流的阀门，认为蛛网膜绒毛只有在CSF过多，颅内压升高时才开放，但他们也未能找到蛛网膜绒毛直接吸收CSF进入血循环的证据。Tripathi[5]提出蛛网膜绒毛的上皮细胞是一个有着“巨大窗孔”的上皮细胞(large opening on the kendothelium of the arachnoid villus)。但这种上皮细胞的“窗孔”只有在CSF高压的条件下才得以证实[11]。
, 百拇医药
日本桥本一成[6]的实验显示，在注入HRP后，于松果体、脑垂体、脉络丛等脑室周围器官内观察到HRP反应颗粒的聚集，并很快在Galen静脉系统内检测出HRP的存在。虽然目前对CSF如何进入脑室周围器官的机制还不十分清楚，但上述研究已经提示CSF可直接经脑室周围器官进入体循环。
同时，既往研究表明[3]，大白鼠的硬脑膜静脉窦内未见蛛网膜绒毛结构。而一些更高等哺乳动物在蛛网膜绒毛出现以前，CSF循环已经存在，其蛛网膜绒毛随着动物年龄的增长，逐渐发育成熟，体积和数量也相应增长。桥本[6]利用电镜观察了日本猴的蛛网膜绒毛，发现蛛网膜绒毛有着连续的，较易突破的上皮，上皮细胞表面并未见明显窗孔。反之，脑室周围器官的静脉端毛细血管多为有孔静脉端毛细血管。在我们的实验中，经大白鼠侧脑室注入HRP示踪剂30 min后，不仅包括脉络丛在内的脑室周围器官组织内发现有HRP反应产物的聚集，而且在室管膜层、软脑膜和鼻中隔粘膜下组织内也可见HRP反应产物。
, http://www.100md.com
综合我们的实验及其他学者的研究[3，6，7，12]，可以提示包含脉络丛在内的脑室周围器官的有孔静脉毛细血管为CSF进入血循环的基本通路，脑室周围器官是CSF回流的渠道之一；另外，CSF还可以通过室管膜及软脑膜层回流至体循环。脉络丛既参与CSF产生，又参与CSF回流。而蛛网膜绒毛可能在颅内压增加等条件下开放，引流CSF进入血循环，对CSF循环起调节作用。同时，蛛网膜绒毛可能在免疫应答中发挥一定的作用[12]，应特别指出的是，除上述观察结果外，我们还观察到在鼻中隔粘膜下组织的嗅丝及其附近的网状静脉血管周围有HRP反应产物的聚集，在微小静脉的管腔内也出现了HRP反应产物。嗅丝横断面旁可见“半月形”空白区，我们称它为“嗅丝周围间隙”。在这些间隙周围，可见HRP阳性反应产物。透射电镜也观察到在嗅粘膜细胞间隙有大小不等，形状不一的高电子密度HRP反应产物。这提示在正常状态下，CSF还可能经“嗅丝周围间隙”出筛孔，到达鼻粘膜下组织间隙，再经微静脉进入体循环。据文献查阅结果，描述这条途径尚属首次。
, 百拇医药
HRP作为一个蛋白质示踪剂，它的分子量为43kD。而CSF的主要成分为水、电解质以及少量蛋白质，因此仅用HRP来示踪CSF回流途径具有一定局限性。为了从另一侧面反应CSF的正常回流途径，我们选用了与CSF的主要成分及水理化性质基本相同的氚水作为示踪剂。
氚水注入大白鼠侧脑室后，液闪计数显示大白鼠的脉络丛、脑垂体、松果体、最后区等脑室周围器官的放射性明显高于本底，说明氚水可到达上述脑室周围器官，这进一步提示CSF可经脑室周围器官的微静脉回流到Galen静脉系统。
放射自显影实验显示大脑神经细胞层内可见散在银颗粒，证明氚水可从脑室到达神经细胞层，这与HRP示踪实验的HRP的反应产物分布范围有明显差别，而HRP反应物仅限于脑室周围器官及脑室室管膜层。上述实验结果可以看出，CSF可通过室管膜到达大脑神经细胞层，参与形成神经元、神经胶质细胞间的组织液，提示脑组织细胞间的组织液不仅来自于体循环，而且来自于CSF循环。一般认为，组织液在维持组织细胞正常代谢及保持其内环境稳定中起重要的作用。因此，我们认为CSF循环不仅与颅内压、脑灌注压等因素有关，同时在维持脑的正常代谢、神经元与神经胶质细胞内环境的稳定，并在保持其正常功能活动中发挥着积极作用。
, 百拇医药
图1 鼻中隔及其粘膜的矢状切面上，可见嗅丝(0)及其附近的静脉血管网周围有大量HRP反应产物(▲)聚集，在微小静脉管腔内也出现HRP反应产物。×20
图2 鼻中隔水平切面，部分嗅丝(0)横断面旁存在“半月”形空白区(▲)，即嗅丝周围间隙。其间隙周围有高度聚集的HRP反应产物。×20
图3 鼻粘膜支持细胞间可见大量高电子密度的，大小不等的椭圆形HRP反应产物(h)。×17 000
图4 于腺垂体细胞间可见不规则的高电子密度HRP反应产物(▲)，(n)为细胞核 ×15 000
图5 在丘脑及其周围结构脑组织神经细胞层可见散在银颗粒。×300
Fig. 1 Light micrograph of a sagittal section of the nasal septum. A number of HRP reaction production (▲) can be seen nearby the fila olfactorias(0) and venules as well as within the venule lumen.×20
, 百拇医药
Fig. 2 Light micrograph of a horizontal section of the nasal septum. Semilunar shaped space(▲) can be seen in some of the fila olfactorias(0), which were called peripheral space of fila olfactoria by us. The HRP reaction production exists around the edge of the spaces.×20
Fig. 3 Transmission electron micrograph. The HRP reaction production(h) can be observed between the supporting cells of the membrane mucosa nasi.×17 000
Fig. 4 Transmission electron micrograph from the rat brain. The high dense irregular electronic particles (▲) can be seen between the cells of the adenohypophysis.n:nuclear ×15 000
, 百拇医药
Fig. 5 Radioautograph of the sagittal section of the rat brain. It shows the scattered grains of silver within the neurocyte layer of the rat thalamus and its surrounding structures.×300
* △ Department of Anatomy, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016,China
参考文献
[1]Weed LH. The absorption of cerebrospinal fluid into the venous system. Am J Anat, 1923,31(2)：191
, 百拇医药
[2]Weed LH. Forces concerned in the absorption of the cerebrospinal fluid. Am J Physiol, 1935,114(1):40
[3]Hashimoto PH, Gotow T, Ichimura T, et al. Visualization of the cerebrospinal fluid drainage into the Galen's vein. Arch Histol Jpn, 1985，48(2)：173
[4]Welch K, Friedman V. The cerebrospinal fluid valves. Brain, 1960,83(3)：454
[5]Tripathi R. Tracing the bulk outflow route of cerebrospinal fluid by transmission and scanning electron microscopy. Brain Res,1974,80(2)：503
, 百拇医药
[6]Hashimoto PH, Gotow T, Ichimura T, et al. Are the arachnoid villi really the main drainage route for the cerebrospinal fluid into the blood stream? An electron microscopic study. Okajimas Folia Anat Jpn, 1982，58：819
[7]Sun SQ, Hahimoto PH. Venous microvasculature of the pineal body and choroid plexus in the rat. J Electron Microsc,1992,40(1):29
[8]Cifuentes M, Fernandez LP, Perez J, et al. Distribution of intraventricularly injected horseradish peroxidase in cerebrospinal fluid compartments of rat spinal cord. Cell Tissue Res,1992,270(3):485
, 百拇医药
[9]Levin E, Sepulveda FV, Yudilevich DL.Pial vessels transport of substances from cerebrospinal fluid to blood. Nature,1974，249(5454)：266
[10]Saito Y, Wright EM. Regulation of bicarbonate transport across the brush border membrane of the bull-forg choroid plexus. J Physiol,1984,350:327
[11]Levine JE, Povlishock JT, Becker DP. The morphological correlates of primate cerebrospinal fluid absorption. Brain Res,1982,241(1):31
[12]Hashimoto PH. Aspects of normal cerebrospinal fluid circulation and circumventricular organs. Progress In Brain Research,1992，91(3)：439
收稿1998-06 修回1998-11, 百拇医药