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编号:10258723
高渗刺激诱导大鼠下丘脑室旁核和视上核神经激肽B受体阳性神经元表达Fos*
http://www.100md.com 《解剖学报》 1999年第3期
     作者:吕葆真 丁玉强

    单位:吕葆真 丁玉强(第四军医大学解剖学教研室,梁锯脑研究中心,西安 710032)

    关键词:神经激肽B受体;Fos;下丘脑室旁核;视上核;大鼠

    解剖学报990303

    【摘要】 目的 研究神经激肽B受体(NK3受体)与机体渗透压调节之间的可能关系。 方法 用双重免疫组织化学染色技术,高渗刺激采用静脉内注射1.5 mol/L NaCl的方法,观察了下丘脑室旁核和视上核内NK3受体阳性神经元在高渗刺激下的Fos表达情况。 结果 高渗盐水可诱导下丘脑室旁核和视上核内大量神经元表达Fos。在室旁核,双标细胞约占NK3受体阳性神经元的88%,约占Fos阳性细胞的71%;在视上核的主部,双标细胞约占NK3受体阳性神经元的74%,约占Fos阳性细胞的43%。 结论 室旁核和视上核内NK3受体阳性神经元可能参与大鼠渗透压调节过程。
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    NEUROKININ B RECEPTOR-POSITIVE NEURONS IN THE

    PARAVENTRICULAR AND SUPRAOPTIC NUCLEI OF THE

    HYPOTHALAMUS EXPRESS Fos AFTER INTRA-

    VENOUS INJECTION OF HYPERTONIC

    SALINE IN THE RAT Baozhen, Ding YuqiangΔ

    (Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Center,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
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    【Abstract】 Objective In order to investigate possible relation of neurokinin B receptor(NK3) with osmoregulation,expression of Fos in NK3 receptor-containing neurons in the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothalamus was investigated in the rat after hypertonic stimuli.Methods A double immunohistochemical staining method was used;hypertonic stimuli was done with intravenous injection of 1.5 mol/L NaCl.Results Hypertonic treatment induced Fos expression in many neurons of the paraventricular and supraoptic nuclei.In the paraventricular nucleus,about 88% of NK3 receptor-positive neurons exhibited Fos-like immunoreactivity, which corresponded to about 71% of Fos-positive neurons.In the principal part of the supraoptic nucleus,about 74% of NK3 receptor-positive neurons was Fos-like immunoreactive,which corresponded to about 43% of Fos-positive neurons.Conclusion NK3 receptor-containing neurons in the paraventricular and supraoptic nuclei might be involved in osmoregulation of the rat.
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    【Key words】 Neurokinin B receptor; Fos; Hypothalamic paraventricular nucleus; Supraoptic nucleus; Rat

    速激肽家族主要包括P物质、K物质(又称神经激肽A)和神经激肽B(neurokinin B,NKB),它们在神经系统的功能活动中起着重要的作用[1]。速激肽的生理作用是通过它们各自相应的受体实现的,即NK1、NK2和NK3受体[2,3]。以往的研究表明,NKB/NK3受体在机体水盐代谢和渗透压调节中起着重要的作用。如脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可引起动物血压升高并抑制对盐的摄取,同时可引起下丘脑释放加压素[4~6]。c-fos作为即刻早期基因家族的成员,它的表达常被认为是神经元被激活的标记而广泛应用于神经科学的研究领域。以往文献证实,静脉内注射高渗盐水可使机体处于高渗环境并可诱导下丘脑室旁核和视上核等与渗透压调节有关的脑区表达c-fos[7,8],说明c-fos表达亦可应用于渗透压调节神经通路的研究。因此,为研究下丘脑室旁核和视上核NK3受体与机体渗透压调节之间的关系,本研究采用免疫双标记技术,观察了高渗条件刺激下大鼠下丘脑室旁核和视上核内NK3受体阳性神经元的Fos表达情况。
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    材料和方法

    实验共用成年SD大鼠6只。在腹腔内注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉下,将含有0.9%肝素的塑料管插入颈外静脉并用丝线固定,该管在皮下沿颈部绕至大鼠的背部。动物存活3d后,通过塑料管将等渗的0.15 mol/L的生理盐水(2只)或1.5 mol/L的高渗盐水(4只)缓慢注入颈外静脉(5.5 ml/kg)[7]。在操作过程中,动物处于自由活动状态,未见明显不适反应。90 min后,在腹腔注射戊巴比妥钠(100 mg/kg)的深麻醉状态下,开胸经升主动脉插管,先用100ml生理盐水冲净血液,然后用500 ml含4%的多聚甲醛和0.5%的苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)灌注固定,灌毕取全脑,然后置于含有30%的蔗糖的0.1 mol/L PB(pH7.4)过夜。取含下丘脑的脑块,冰冻冠状切片,片厚15 μm。切片先用PAP法进行NK3受体免疫组织化学反应,然后用ABC法进行Fos免疫组织化学反应。切片经0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)漂洗后,依次进入兔抗大鼠NK3受体多克隆抗体(0.8 μg/ml,关于此抗体的制备和鉴定请参照文献[9])孵育过夜;羊抗兔IgG(Vector,1∶50)4h;PAP复合物(Sigma,1∶100)2h。其中一抗和二抗用含1%的正常驴血清和0.3%的Triton X-100的0.01 mol/L PBS(pH7.4)稀释,PAP复合物用含0.3%的Triton X-100的0.01mol/L PBS(pH7.4)稀释。切片最后在含有0.05%DAB和0.003%的H2O2的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)内呈色20~30 min。NK3受体免疫反应产物呈棕褐色。免疫染色后的切片经0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗30 min,然后用ABC法进行Fos免疫组织化学染色。切片首先进入羊抗Fos血清(Cambridge,1∶3 000)孵育过夜,然后依次进入生物素标记的驴抗羊IgG(Jackson,1∶100)2h和ABC复合物(Vector,1∶50)1h。最后切片经H2O2/DAB/硫酸镍胺呈色,Fos阳性胞核为黑色。
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    对照实验在省略一抗、或用正常兔血清代替兔抗NK3受体抗体、或用羊血清代替羊抗Fos血清的情况下进行,结果为阴性。

    结果

    在注射0.15 mol/L等渗生理盐水的大鼠,有一定数量的Fos阳性神经元恒定出现于大脑皮质(包括梨状皮质、运动和感觉皮质)、下丘脑的视前区、下丘脑外侧区和丘脑室旁核。视上核的主部内有个别散在分布且染色浅淡的Fos阳性细胞(<3个细胞/切片),但下丘脑室旁核、视上核的视交叉后部及下丘脑的其他区域为阴性。给予高渗刺激大鼠的Fos免疫染色发现,除大脑皮质和下丘脑视前区等脑区外,大量浓染的Fos阳性细胞出现于下丘脑的室旁核和视上核内。Fos阳性细胞主要位于室旁核的后大细胞部和视上核的主部,少量散在分布于视上核视交叉后部和室旁核的小细胞部。此外,还有一定数量聚集成团的Fos阳性细胞出现于下丘脑前部的圆形核和血管周围。

    与我们[9,10]先前的研究结果一致,NK3受体免疫阳性反应神经元广泛分布于大鼠下丘脑内。在室旁核和视上核,NK3受体阳性神经元主要见于室旁核的后大细胞部和视上核的主部。免疫双标染色结果显示,NK3受体阳性神经元与Fos阳性神经元在下丘脑室旁核和视上核呈重叠分布,即NK3受体阳性神经元与Fos样阳性神经元均主要位于室旁核的后大细胞部和视上核的主部,并有相当数量的NK3受体同时为Fos阳性(图A~D)。Fos免疫反应产物定位于神经元的胞核内,呈黑色,而NK3受体阳性反应产物主要位于胞膜下,呈黄褐色,两者易于区分。在室旁核的后大细胞部,大约有88%(127/144)的NK3受体阳性神经元表达Fos,占Fos阳性神经元的71%(127/180)(图A)。在视上核的主部,NK3受体/Fos双标细胞占NK3受体阳性神经元的74%(76/103),占Fos阳性神经元的43%(76/176)(图C)。此外,在室旁核的小细胞部(图B)、视上核的视交叉后部(图D)和下丘脑前部的圆形核(图E)和血管周(图F)也分布有少量NK3受体/Fos双标细胞。在下丘脑的其他区域未见有NK3受体/Fos双标细胞出现。
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    讨论

    以往的研究表明,通过腹腔内注射、皮下注射或静脉内注射高渗盐水可使动物血浆内钠浓度升高而处于高渗环境,并可诱导下丘脑视上核和室旁核等与渗透压调节有关的脑区表达Fos[7,8]。但采用腹腔内或皮下注射的方法常可引起动物产生痛反应,并可引起下丘脑室旁核小细胞部的神经元表达Fos,而下丘脑室旁核小细胞部神经元表达Fos被认为是与动物应激反应有关[11]。故本实验采用静脉内插管然后通过插管注入高渗盐水的方法给予动物高渗刺激。尽管如此,在本实验条件下,下丘脑室旁核小细胞部内仍有少量神经元表达Fos。这可能是由于注射高渗盐水的速度不恒定而使动物产生痛反应引起的,因为在采用机械恒速缓慢注射生理盐水时,室旁核小细胞部内只有个别神经元表达Fos[7]

    众所周知,下丘脑室旁核和视上核合成加压素并通过视上垂体束释放至垂体后叶的血管而发挥其调节机体渗透压的作用。我们以往的研究表明,大鼠下丘脑室旁核和视上核含有大量NK3受体阳性神经元,它们主要位于室旁核的后大细胞部和视上核的主部,且约有半数的NK3受体阳性神经元含有加压素[9,10]。药理学和生理学研究表明,脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可抑制动物的盐欲,并可引起动物血压升高、心率加快等类似加压素的生理效应[5,6]。后来的研究证实这种效应就是通过下丘脑释放加压素实现的,因为这种效应可被加压素受体阻断剂阻断,且动物血浆内加压素的含量在给予NKB或NK3受体的激动剂后升高[4,5,12,13]。本实验发现大鼠下丘脑室旁核的后大细胞部和视上核的主部内约有3/4的NK3受体阳性神经元为Fos阳性,提示高渗刺激可激活室旁核和视上核内的NK3受体阳性神经元。综上,可以认为下丘脑室旁核和视上核内NK3受体阳性神经元可能通过调节加压素的释放而参与机体渗透压的调节过程。
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    图A~F 示静脉注射高渗盐水后,大鼠下丘脑室旁核后大细胞部(图A)、室旁核小细胞部(图B)、视上核主部(图C)、视上核视交叉后部(图D)、圆形核(图E)和血管周(图F)内的NK3受体阳性神经元表达Fos。三角箭头示部分双标细胞,大箭头示部分Fos单标细胞,小箭头示部分NKR单标细胞。图C和图F中的星号示血管。标尺示30 μm

    Figs.A-F Showing NK3 receptor-positive neurons expressed Fos-LI in the posterior magnocellular part of the paraventricular nucleus(Fig.A),parveocellular part of the paraventricular nucleus(Fig.B),principal part of the supraoptic nucleus(Fig.C),retrochiasmatic part of the supraoptic nucleus(Fig.D),circular nucleus(Fig.E), and the region around blood vessels(Fig.F) in the rat hypothalamus following intravenous injection of hypertonic saline.A part of double-labeled neurons are indicated by triangles.Large and small arrowheads indicated Fos-and NKR-single-labeled neurons,respectively.Note that blood vessels in Fig.C and Fig.F are indicated by stars.Bar=30 μm
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    * 国家自然科学基金资助课题(No.39600045)

    Δ Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Center,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

    参考文献

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    收稿1998-04 修回1998-08, http://www.100md.com