钙调素拮抗剂对HeLa细胞S期进程的影响*
作者：孙 霞 柳惠图 童迎凯 王端顺
单位：北京师范大学生物系细胞增殖与调控生物学开放实验室，北京 100875
关键词：钙调素；三氟拉嗪；S期；HeLa细胞
解剖学报990419 【摘要】 目的 探讨钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)对HeLa细胞S期进程的影响及其分子机理。 方法 通过TdR双阻断法获得同步化的S期HeLa细胞，以3H-TdR掺入法和Western技术分别观察了TFP对HeLa细胞S期进程和胸苷激酶(thymidine kinase,TK)活性及细胞周期引擎分子CyclinA、Cdk2和细胞周期调节蛋白p80cdc25B、PCNA、p21蛋白表达水平的影响。 结果 TFP(20μmol/L)能使3H-TdR的掺入峰值后移，并抑制了CyclinA、PCNA、p80cdc25B的表达和提高了p21蛋白的水平，但对Cdk2的表达几乎无影响。 结论 CaM除了能通过影响PCNA的水平直接作用于DNA合成，同时又可通过作用于CyclinA、p80cdc25B、p21等周期引擎分子和调控因子水平正调HeLa细胞S期进程。
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THE EFFECTS OF ANTAGONIST OF CaM ON THE PROGRESSION
OF S PHASE IN HeLa CELLS
Sun Xia, Liu HuituΔ, Tong Yingkai, Wang Duanshun
(Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation,Department of Biology,Beijing Normal University,Beijing)
【Abstract】 Objective To study the effects of antagonist of CaM(TFP) on the progression of S phase and the molecular mechanism in HeLa cells. Methods The synchronized S phase cells were obtained by the method of thymidine(TdR)double block.The progression of S phase and the activity of thymidine kinase were determined through 3H-TdR incorporation assay.Western blotting was used to analyze the levels of CyclinA,Cdk2,PCNA,p80cdc25B and p21 proteins. Results The TFP(20μmol/L)put off the appearing of the peak of 3H-TdR incorporation and inhibited S phase progression.The activity of thymidine kinase decreased after treatment with TFP.The TFP(20μmol/L)decreased the level of CyclinA,PCNA，p80cdc25B increased the expression of p21 protein,but not affected on the expression of Cdk2. Conclusion CaM could positively regulate the S phase progression in HeLa cells not only by affecting on the synthesis of DNA through PCNA,but also by influencing the expression of cell cycle engine molecules and related regulators including CyclinA,p80cdc25B,and p21 proteins.This may be one of the molecular mechanisms which is involved in the positive regulation of S phase progression in HeLa cells by CaM.
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【Key words】 Calmodulin(CaM); Trifluoperazine(TFP); S phase; HeLa cells
钙调素(calmodulin,CaM)与细胞增殖、分化、转化密切相关，虽然已有一些文献报道了它在不同细胞中的作用，但对细胞周期S期进程及引擎分子与相关调控因子的作用的报道较少。为此，我们利用TdR双阻断法，获得了S期细胞，研究了CaM在HeLa细胞S期进程中的作用及其作用机理。
材料和方法
1. 材料
HeLa细胞(本室存)、(γ-32P)dATP(比活度>5 000Ci/mmol)、3H-TdR(比度：30Ci/mmol,浓度：1mCi/ml)分别购自北京亚辉生物工程公司和中国科学院上海核技术开发公司，CDK2、CyclinA、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、p21、p80cdc25B抗体购自Santa Cruz公司，ECL免疫印迹试剂盒购自Amersham公司，TdR和trifluoperazine(TFP)由Sigma公司提供。
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2. 方法
2.1 S期HeLa细胞的制备：HeLa细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养。
采用TdR双阻断法获得S期细胞：细胞进入对数生长期后，更换含2.5mmol/L TdR阻断剂的培养液，于37℃，CO2培养箱中培养16h后，重新加入培养液释放细胞9h，更换含2.5mmol/L TdR阻断剂的培养液继续培养16h，用无血清培养液洗细胞3次，加入培养液再次释放，即获得S期细胞。
2.2 生长曲线测定：取对数生长期细胞，按1×104/ml的浓度接种于24孔板，在37℃，5%CO2条件下培养，每24h用血细胞计数板平行计数3孔，绘制曲线。
2.3 3H-TdR掺入：取TdR双阻断后释放不同点的对照细胞与药物处理的样品细胞，在含3H-TdR(1μCi/ml)的培养液孵育1h后，经洗脱与裂解，用GF/C型玻璃纤维素膜抽滤，烘干，液闪计数，掺入强度用cpm/106细胞表示。
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2.4 胸苷激酶(TK)活性测定[1]：以2.5×107细胞/ml的浓度，用细胞抽提溶液(10mmol/L Tris-HCl,pH8.0;1.6×10-5mol/L thymidine,0.003mol/L β-mercaptoethanol)悬浮细胞，反复冻融，使细胞及细胞核完全破裂，4℃离心，取上清液15μl，加30μl反应液(15mmol/L MgCl2,30mmol/L Tris-HCl,pH7.5;30mmol/L ATP)，加10μCi3H-TdR及适量细胞抽提溶液，37℃反应20min，点样在DE81纤维素膜上，洗膜，烤干，用液体闪烁计数器测cpm值，经Bradford法测定蛋白浓度后计算每微克蛋白的酶活反应的cpm值。
2.5 Western blotting:收集细胞，离心，加入适量的细胞裂解液(10mmol/L Tris.Cl pH6.8,2.5%SDS,10% β-mercaptoethanol,1mmol/L PMSF,10%甘油)进行裂解。离心取上清作为电泳样品，Bradford法测定蛋白浓度，以血清白蛋白作为标准品。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(laemmli系统，1000V，30mA,1h)后，电转移到硝酸纤维素膜(Amersham公司)上，电转移的条件为0.75mA/cm2。膜经封闭后分别与一抗溶液(稀释度为1000～2000倍)和辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(稀释度为2 000倍)室温下振荡孵育，洗膜，按照ECL免疫检测试剂盒说明进行显色、曝光。
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结果
1. CaM拮抗剂TFP对HeLa细胞生长的影响
HeLa细胞在含TFP(20μmol/L)的培养液中培养，测定生长曲线，结果表明HeLa细胞的生长受到抑制，在第5d是对照组的45%(图1)。
图1 TFP(20μmol/L)对HeLa细胞生长的影响
Fig.1 Effect of TFP on growth of HeLa cells
2. TFP对HeLa细胞S期进程的影响
TdR双阻断将细胞阻断在G1/S交界处，对照组细胞释放后继续培养，实验组细胞在阻断释放时加入TFP(20μmol/L)处理，上述两组细胞分别取0.5、1、2、4、6、8、10h的细胞样品加入3H-TdR(1μCi/ml)孵育1h，液闪法测定3H-TdR掺入强度，可见TFP处理的实验组与对照组相比，S期峰值由4h延迟至6h，并且掺入水平也有所下降(图2)。
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图2 TFP对S期HeLa细胞3H-TdR掺入水平的影响
Fig.2 Effect of TFP on 3H-TdR incorporation in S phase HeLa cells
3. TFP对TK激酶活性的影响
释放处于G1/S交界处的细胞，用TFP(20μmol/L)处理4h后，测定TK活性，表明TFP抑制了TK激酶的活性(为对照组的71.6%)，这与图2中所见的TFP处理4h后3H-TdR掺入下降有密切关系，可见CaM拮抗剂可通过抑制TK活性影响S期进程(图3)。
图3 TFP对S期HeLa细胞TK激酶活性的影响
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Fig.3 Effect of TFP on TK activity in S phase HeLa cells4. TFP对与S期进程有关的细胞周期引擎分子表达的影响
已知细胞周期引擎分子CDK2和CyclinA的蛋白表达水平及活性与S期进程密切相关，为此，我们进一步探讨了TFP对这些蛋白表达水平的影响。释放TdR双阻断处于G1/S交界处的HeLa细胞时用TFP处理4h，Western blotting结果表明，TFP抑制了CyclinA的表达(图4a)，但对CDK2的表达影响不大(图4b)，由于CDK2的活性依赖于CyclinA与其形成复合物，因而CyclinA的水平会影响CDK2的活性。说明CaM可通过作用于CyclinA的表达影响CDK2活性，正调S期的进程。
图4 TFP对S期HeLa细胞中CyclinA(a)和Cdk2(b)蛋白表达水平的影响
, 百拇医药 Fig.4 Effect of TFP on the expressions of CyclinA and Cdk2 proteins in S phase HeLa cells
A.Control B.TFP(20μmol/L)
5. TFP对S期调控因子PCNA、p80cdc25B、p21表达的影响
已知PCNA作为DNA聚合酶δ的附属蛋白，在DNA的复制和修复中起重要作用；p21是细胞周期的负调因子；而p80cdc25是CDK活化所必须的磷酸酶，因而我们进一步探讨了TFP对上述蛋白表达的影响。释放处于G1/S交界处的细胞，加TFP处理4h，免疫印迹结果表明，TFP能降低PCNA的水平(图5a)，对p80cdc25B的表达也有抑制作用(图5b)，但能促进p21的表达(图5c)，实验结果显示，CaM可能分别通过作用于PCNA、p80cdc25B、p21调节S期进程。
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图5 TFP对S期HeLa细胞PCNA(a)、p80cdc25B(b)、p21(c)蛋白表达水平的影响
Fig.5 Effect of TFP on the expressions of PCNA(a),p80cdc25B(b)and p21(c) proteins in S phase HeLa cells
A.Control B.TFP(20μmol/L)
讨论
CaM在细胞代谢及增殖中的调控作用一直为人们所重视，研究表明CaM在细胞周期中是有规律变化的[2]。在晚G1期及早S期，CaM的水平剧增，在S期达最高水平[3]，并一直持续至细胞分裂周期的结束[4，5]。有关研究表明，在哺乳动物细胞周期中有3个位点是CaM作用的敏感位点：(1)G1/S交界处；(2)由G2进入分裂期；(3)通过分裂中期[6]。但对S期进程的影响及其作用的分子机理并不清楚。三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)是CaM的拮抗剂，能有效地抑制CaM的活性[7]。本实验观察到，处于G1/S交界处的HeLa细胞被释放进入S期时，CaM拮抗剂TFP使3H-TdR掺入峰值后移，抑制S期进程。进一步探讨其机理，显示出它与抑制引擎分子CyclinA和p80cdc25B的表达，从而与进一步阻抑Cdk2的活性有关。p80cdc25是一类有双重底物特异性的蛋白磷酸酶，它可激活Cyclin/Cdk复合物的活性。最近的报道表明，Cdc25B在G1/S，S及G2表达均较高，并在G1/S，S及G2/M中均有作用[8]。因此，通过实验表明，CaM拮抗剂不仅抑制CyclinA的蛋白表达水平并可能通过作用于p80cdc25B表达调节S期进程。已知PCNA是DNA聚合酶δ的一个附属蛋白，它能在双链DNA周围形成一个滑动夹板，从而与DNA聚合酶δ相互作用，并使之持续合成DNA[9]，因此，PCNA是DNA合成中的一个重要调节因子。我们的实验表明，CaM拮抗剂TFP不仅能抑制与DNA合成密切有关的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的活性，而且也能抑制PCNA的表达，直接影响了DNA复制。近年来研究资料证实了多种CKI可以通过与Cdk-Cyclin复合物的结合而抑制其激酶活性，同时p21又能抑制PCNA的活性直接抑制DNA的合成[10，11]。我们对同步的HeLa细胞S期的p21表达作了分析，发现TFP在抑制S期进程的同时明显提高了p21的表达水平。因此，通过作用于p21影响CyclinA/Cdk2的活性可能是TFP作用于S期进程的另一个分子机理。综上所述，不难看出，CaM对HeLa细胞S期进程的调节是一个多层次的复杂的调控过程，它既可以作用于DNA合成同时又可通过作用于CyclinA、p80cdc25B、p21等周期调控因子影响S期引擎分子CyclinA/Cdk2的表达与活性从而正调S期进程。
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*国家自然科学基金资助课题(No.39430080)
△ Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation,Department of Biology,Beijing Normal University,Beijing 100875,China
参考文献
1 Liu H T,Gibson G W,Hirschhorn R R,et al.Expression of thymidine kinase and dihydrofolate reductase genes in mammalian ts mutants of the cell cycle. J Biol Chem,1985,260(6):3269
2 Hammond R A,Foster K A,Berchthold M W,et al.Calcium-dependent calmodulin-binding proteins associated with mammalian DNA polymerase alpha. Biochem Biophys Acta,1988,951(2-3):315
, 百拇医药
3 Subramanyam C,Honn S C,Reed W C,et al.Nuclear localization of 68 kDa calmodulin-binding protein is associated with the onset of DNA replication. J Cell Physiol,1990,144(3):423
4 Joan S M,Jesus P,Orilo B,et al.Rearrangement of nuclear calmodulin during proliferative liver cell activation.Biochem Biophys Res Commun,1988,150(3),1162
5 Steinhardt R A,Alderton J.Intracelular free calcium rise triggers nuclear envelope breakdown in the sea urchin embryo.Nature,1988,332(6162):364
, 百拇医药
6 Muller R,Mumberg D,Lucibello FC.Signals and genes in the control of cell-cycle progression. Biochem Biophys Acta,1993,1155(2):151
7 Dalgarno D,Kleuit R E,Levine B A et al.The nature of the trifluoperazine binding sites on calmodulin and troponin-C. Biochem Biophys Acta,1984,791(2):164
8 Gaspartto D,Maestro R,Piccinin S,et al.Overexpression of CDC25A and CDC25B in head and neck cancers. Cancer Research,1997,57(12):236
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9 Levin D S,Bai W,Yao N,et al.An interaction between DNA ligase I and proliferating cell nuclear antigen:implications for okazaki fragment synthesis and joining. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(24):12863
10 Zhang H,Kokayashi R,Galaktionov K,et al.p19Skp1and p45Skp2are essential elements of the cyclinA-CDK2 S phase kinase.Cell,1995,82(6):915
11 Pan Z Q,Reardon J T,Li L,et al.Inhibition of nucleotide excision repair by the cyclin-dependent kinase inhibitor p21.J Biol Chem,1995,270(37):22008
收稿1999-02 修回1999-06, http://www.100md.com
单位：北京师范大学生物系细胞增殖与调控生物学开放实验室，北京 100875
关键词：钙调素；三氟拉嗪；S期；HeLa细胞
解剖学报990419 【摘要】 目的 探讨钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)对HeLa细胞S期进程的影响及其分子机理。 方法 通过TdR双阻断法获得同步化的S期HeLa细胞，以3H-TdR掺入法和Western技术分别观察了TFP对HeLa细胞S期进程和胸苷激酶(thymidine kinase,TK)活性及细胞周期引擎分子CyclinA、Cdk2和细胞周期调节蛋白p80cdc25B、PCNA、p21蛋白表达水平的影响。 结果 TFP(20μmol/L)能使3H-TdR的掺入峰值后移，并抑制了CyclinA、PCNA、p80cdc25B的表达和提高了p21蛋白的水平，但对Cdk2的表达几乎无影响。 结论 CaM除了能通过影响PCNA的水平直接作用于DNA合成，同时又可通过作用于CyclinA、p80cdc25B、p21等周期引擎分子和调控因子水平正调HeLa细胞S期进程。
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THE EFFECTS OF ANTAGONIST OF CaM ON THE PROGRESSION
OF S PHASE IN HeLa CELLS
Sun Xia, Liu HuituΔ, Tong Yingkai, Wang Duanshun
(Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation,Department of Biology,Beijing Normal University,Beijing)
【Abstract】 Objective To study the effects of antagonist of CaM(TFP) on the progression of S phase and the molecular mechanism in HeLa cells. Methods The synchronized S phase cells were obtained by the method of thymidine(TdR)double block.The progression of S phase and the activity of thymidine kinase were determined through 3H-TdR incorporation assay.Western blotting was used to analyze the levels of CyclinA,Cdk2,PCNA,p80cdc25B and p21 proteins. Results The TFP(20μmol/L)put off the appearing of the peak of 3H-TdR incorporation and inhibited S phase progression.The activity of thymidine kinase decreased after treatment with TFP.The TFP(20μmol/L)decreased the level of CyclinA,PCNA，p80cdc25B increased the expression of p21 protein,but not affected on the expression of Cdk2. Conclusion CaM could positively regulate the S phase progression in HeLa cells not only by affecting on the synthesis of DNA through PCNA,but also by influencing the expression of cell cycle engine molecules and related regulators including CyclinA,p80cdc25B,and p21 proteins.This may be one of the molecular mechanisms which is involved in the positive regulation of S phase progression in HeLa cells by CaM.
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【Key words】 Calmodulin(CaM); Trifluoperazine(TFP); S phase; HeLa cells
钙调素(calmodulin,CaM)与细胞增殖、分化、转化密切相关，虽然已有一些文献报道了它在不同细胞中的作用，但对细胞周期S期进程及引擎分子与相关调控因子的作用的报道较少。为此，我们利用TdR双阻断法，获得了S期细胞，研究了CaM在HeLa细胞S期进程中的作用及其作用机理。
材料和方法
1. 材料
HeLa细胞(本室存)、(γ-32P)dATP(比活度>5 000Ci/mmol)、3H-TdR(比度：30Ci/mmol,浓度：1mCi/ml)分别购自北京亚辉生物工程公司和中国科学院上海核技术开发公司，CDK2、CyclinA、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、p21、p80cdc25B抗体购自Santa Cruz公司，ECL免疫印迹试剂盒购自Amersham公司，TdR和trifluoperazine(TFP)由Sigma公司提供。
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2. 方法
2.1 S期HeLa细胞的制备：HeLa细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养。
采用TdR双阻断法获得S期细胞：细胞进入对数生长期后，更换含2.5mmol/L TdR阻断剂的培养液，于37℃，CO2培养箱中培养16h后，重新加入培养液释放细胞9h，更换含2.5mmol/L TdR阻断剂的培养液继续培养16h，用无血清培养液洗细胞3次，加入培养液再次释放，即获得S期细胞。
2.2 生长曲线测定：取对数生长期细胞，按1×104/ml的浓度接种于24孔板，在37℃，5%CO2条件下培养，每24h用血细胞计数板平行计数3孔，绘制曲线。
2.3 3H-TdR掺入：取TdR双阻断后释放不同点的对照细胞与药物处理的样品细胞，在含3H-TdR(1μCi/ml)的培养液孵育1h后，经洗脱与裂解，用GF/C型玻璃纤维素膜抽滤，烘干，液闪计数，掺入强度用cpm/106细胞表示。
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2.4 胸苷激酶(TK)活性测定[1]：以2.5×107细胞/ml的浓度，用细胞抽提溶液(10mmol/L Tris-HCl,pH8.0;1.6×10-5mol/L thymidine,0.003mol/L β-mercaptoethanol)悬浮细胞，反复冻融，使细胞及细胞核完全破裂，4℃离心，取上清液15μl，加30μl反应液(15mmol/L MgCl2,30mmol/L Tris-HCl,pH7.5;30mmol/L ATP)，加10μCi3H-TdR及适量细胞抽提溶液，37℃反应20min，点样在DE81纤维素膜上，洗膜，烤干，用液体闪烁计数器测cpm值，经Bradford法测定蛋白浓度后计算每微克蛋白的酶活反应的cpm值。
2.5 Western blotting:收集细胞，离心，加入适量的细胞裂解液(10mmol/L Tris.Cl pH6.8,2.5%SDS,10% β-mercaptoethanol,1mmol/L PMSF,10%甘油)进行裂解。离心取上清作为电泳样品，Bradford法测定蛋白浓度，以血清白蛋白作为标准品。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(laemmli系统，1000V，30mA,1h)后，电转移到硝酸纤维素膜(Amersham公司)上，电转移的条件为0.75mA/cm2。膜经封闭后分别与一抗溶液(稀释度为1000～2000倍)和辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(稀释度为2 000倍)室温下振荡孵育，洗膜，按照ECL免疫检测试剂盒说明进行显色、曝光。
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结果
1. CaM拮抗剂TFP对HeLa细胞生长的影响
HeLa细胞在含TFP(20μmol/L)的培养液中培养，测定生长曲线，结果表明HeLa细胞的生长受到抑制，在第5d是对照组的45%(图1)。
图1 TFP(20μmol/L)对HeLa细胞生长的影响Fig.1 Effect of TFP on growth of HeLa cells
2. TFP对HeLa细胞S期进程的影响
TdR双阻断将细胞阻断在G1/S交界处，对照组细胞释放后继续培养，实验组细胞在阻断释放时加入TFP(20μmol/L)处理，上述两组细胞分别取0.5、1、2、4、6、8、10h的细胞样品加入3H-TdR(1μCi/ml)孵育1h，液闪法测定3H-TdR掺入强度，可见TFP处理的实验组与对照组相比，S期峰值由4h延迟至6h，并且掺入水平也有所下降(图2)。
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图2 TFP对S期HeLa细胞3H-TdR掺入水平的影响
Fig.2 Effect of TFP on 3H-TdR incorporation in S phase HeLa cells
3. TFP对TK激酶活性的影响
释放处于G1/S交界处的细胞，用TFP(20μmol/L)处理4h后，测定TK活性，表明TFP抑制了TK激酶的活性(为对照组的71.6%)，这与图2中所见的TFP处理4h后3H-TdR掺入下降有密切关系，可见CaM拮抗剂可通过抑制TK活性影响S期进程(图3)。
图3 TFP对S期HeLa细胞TK激酶活性的影响
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Fig.3 Effect of TFP on TK activity in S phase HeLa cells4. TFP对与S期进程有关的细胞周期引擎分子表达的影响
已知细胞周期引擎分子CDK2和CyclinA的蛋白表达水平及活性与S期进程密切相关，为此，我们进一步探讨了TFP对这些蛋白表达水平的影响。释放TdR双阻断处于G1/S交界处的HeLa细胞时用TFP处理4h，Western blotting结果表明，TFP抑制了CyclinA的表达(图4a)，但对CDK2的表达影响不大(图4b)，由于CDK2的活性依赖于CyclinA与其形成复合物，因而CyclinA的水平会影响CDK2的活性。说明CaM可通过作用于CyclinA的表达影响CDK2活性，正调S期的进程。
图4 TFP对S期HeLa细胞中CyclinA(a)和Cdk2(b)蛋白表达水平的影响, 百拇医药 Fig.4 Effect of TFP on the expressions of CyclinA and Cdk2 proteins in S phase HeLa cells
A.Control B.TFP(20μmol/L)
5. TFP对S期调控因子PCNA、p80cdc25B、p21表达的影响
已知PCNA作为DNA聚合酶δ的附属蛋白，在DNA的复制和修复中起重要作用；p21是细胞周期的负调因子；而p80cdc25是CDK活化所必须的磷酸酶，因而我们进一步探讨了TFP对上述蛋白表达的影响。释放处于G1/S交界处的细胞，加TFP处理4h，免疫印迹结果表明，TFP能降低PCNA的水平(图5a)，对p80cdc25B的表达也有抑制作用(图5b)，但能促进p21的表达(图5c)，实验结果显示，CaM可能分别通过作用于PCNA、p80cdc25B、p21调节S期进程。
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图5 TFP对S期HeLa细胞PCNA(a)、p80cdc25B(b)、p21(c)蛋白表达水平的影响
Fig.5 Effect of TFP on the expressions of PCNA(a),p80cdc25B(b)and p21(c) proteins in S phase HeLa cells
A.Control B.TFP(20μmol/L)
讨论
CaM在细胞代谢及增殖中的调控作用一直为人们所重视，研究表明CaM在细胞周期中是有规律变化的[2]。在晚G1期及早S期，CaM的水平剧增，在S期达最高水平[3]，并一直持续至细胞分裂周期的结束[4，5]。有关研究表明，在哺乳动物细胞周期中有3个位点是CaM作用的敏感位点：(1)G1/S交界处；(2)由G2进入分裂期；(3)通过分裂中期[6]。但对S期进程的影响及其作用的分子机理并不清楚。三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)是CaM的拮抗剂，能有效地抑制CaM的活性[7]。本实验观察到，处于G1/S交界处的HeLa细胞被释放进入S期时，CaM拮抗剂TFP使3H-TdR掺入峰值后移，抑制S期进程。进一步探讨其机理，显示出它与抑制引擎分子CyclinA和p80cdc25B的表达，从而与进一步阻抑Cdk2的活性有关。p80cdc25是一类有双重底物特异性的蛋白磷酸酶，它可激活Cyclin/Cdk复合物的活性。最近的报道表明，Cdc25B在G1/S，S及G2表达均较高，并在G1/S，S及G2/M中均有作用[8]。因此，通过实验表明，CaM拮抗剂不仅抑制CyclinA的蛋白表达水平并可能通过作用于p80cdc25B表达调节S期进程。已知PCNA是DNA聚合酶δ的一个附属蛋白，它能在双链DNA周围形成一个滑动夹板，从而与DNA聚合酶δ相互作用，并使之持续合成DNA[9]，因此，PCNA是DNA合成中的一个重要调节因子。我们的实验表明，CaM拮抗剂TFP不仅能抑制与DNA合成密切有关的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的活性，而且也能抑制PCNA的表达，直接影响了DNA复制。近年来研究资料证实了多种CKI可以通过与Cdk-Cyclin复合物的结合而抑制其激酶活性，同时p21又能抑制PCNA的活性直接抑制DNA的合成[10，11]。我们对同步的HeLa细胞S期的p21表达作了分析，发现TFP在抑制S期进程的同时明显提高了p21的表达水平。因此，通过作用于p21影响CyclinA/Cdk2的活性可能是TFP作用于S期进程的另一个分子机理。综上所述，不难看出，CaM对HeLa细胞S期进程的调节是一个多层次的复杂的调控过程，它既可以作用于DNA合成同时又可通过作用于CyclinA、p80cdc25B、p21等周期调控因子影响S期引擎分子CyclinA/Cdk2的表达与活性从而正调S期进程。
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*国家自然科学基金资助课题(No.39430080)
△ Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation,Department of Biology,Beijing Normal University,Beijing 100875,China
参考文献
1 Liu H T,Gibson G W,Hirschhorn R R,et al.Expression of thymidine kinase and dihydrofolate reductase genes in mammalian ts mutants of the cell cycle. J Biol Chem,1985,260(6):3269
2 Hammond R A,Foster K A,Berchthold M W,et al.Calcium-dependent calmodulin-binding proteins associated with mammalian DNA polymerase alpha. Biochem Biophys Acta,1988,951(2-3):315
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3 Subramanyam C,Honn S C,Reed W C,et al.Nuclear localization of 68 kDa calmodulin-binding protein is associated with the onset of DNA replication. J Cell Physiol,1990,144(3):423
4 Joan S M,Jesus P,Orilo B,et al.Rearrangement of nuclear calmodulin during proliferative liver cell activation.Biochem Biophys Res Commun,1988,150(3),1162
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收稿1999-02 修回1999-06, http://www.100md.com