MSH27抗原在小鼠睾丸中的定位*
作者：庄大中 宋祥芬 齐跃敏 孙青原 陈大元
单位：中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室，北京 100080
关键词：MSH27抗原；精子形成；定位
解剖学报990414 【摘要】 目的 MSH27是与精、卵质膜融合相关的针对精子抗原的单克隆抗体，本研究检测了此抗体所识别的睾丸抗原分子及其分布。 方法 用免疫亲和层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化、分析了MSH27识别的小鼠睾丸抗原，并用免疫组织化学和免疫电镜进行了定位。 结果 单抗MSH27可识别睾丸提取蛋白中分子量为126kD和116kD的抗原分子，此抗原在睾丸的精原细胞至球形精子细胞的胞质内部均有表达，分布于内质网囊泡内或囊泡膜上。在精子形成过程中，此抗原由胞质内均匀分布变为聚集于顶体帽旁侧的区域，这一区域将形成顶体后区。 结论 126kD和116kD蛋白是单抗MSH27在睾丸中识别的抗原分子，它们可能是单抗MSH27在成熟精子中识别的39kD抗原的前体分子。
, 百拇医药
LOCATION OF THE MOUSE MSH27 ANTIGEN IN TESTES
Zhuang Dazhong Song Xiangfen Qi Yuemin Sun Qingyuan Chen DayuanΔ
(State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Academia Sinica, Beijing)
【Abstract】 Objective MSH27 antigen plays an important role in the process of sperm-egg membrane fusion. In this study, the molecular weights and distribution of the antigen were investigated. Methods Immuno-affinity chromatography, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, immunohistochemistry and immunoelectron microscopy were used. Results Two proteins with the molecular weight of 126kD and 116kD were separated from the testicular extraction by immuno-affinity chromatography. It was demonstrated that the antigens were located in the endoplasmic reticulum, or in the vesicles which were released from the endoplasmic reticulum of all the spermatogenic cells, from spermatogonia to spermitids. In the process of the spermiogenesis, the antigens were assembled in the cytoplasm other than the acrosomal cap region, which was destined to form the postacrosomal region of the spermatozoon. Conclusion The 126kD and 116kD proteins, testicular antigens of the mAb MSH27 were deduced to be the precursors of the sperm antigens of mAb MSH27(M.W.39kD).
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【Key words】 MSH27 antigen; Spermiogenesis; Location
抗小鼠精子蛋白的单克隆抗体MSH27在成熟精子中能识别分子量为39kD的抗原分子。过去的研究中发现，此抗原分子在精子顶体反应后位于精子与卵子质膜融合的起始区域即精子的赤道段和顶体后区；纯化的抗原分子及其单克隆抗体在体外受精实验中均可以阻止精、卵膜融合(待发表论文)。当精子在附睾成熟、获能和顶体反应过程中，精子MSH27抗原表位的逐渐暴露并与精子参与精、卵膜融合能力的增加同步(另一待发表论文)。因此，MSH27抗原可能在精、卵膜融合过程中发挥重要的作用。
精子在顶体完整的条件下，不暴露MSH27抗原决定簇，但我们在以往的研究中注意到，一小部分睾丸中的变态精子经过胰蛋白酶处理后呈现MSH27免疫染色阳性，因而推测MSH27抗原是由睾丸产生的。本研究通过免疫组织化学和免疫电镜的方法，观察了睾丸内精子发生过程中MSH27抗原的分布和变化。
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材料和方法
1.材料
雄性昆明系小鼠，10～12周龄。
2.免疫亲和层析和电泳
断颈处死小鼠，取睾丸并去除白膜，于PBS中漂洗以除去分散的细胞，然后于预冷的匀浆器中制备睾丸匀浆。用10倍体积(含1%Triton X-100)的提取液(含5mmol/L EDTA,10mg/L aprotinin, 10mg/L leupeptin, 0.01mol/L PMSF的Tris-HCl缓冲液，pH8.0)提取蛋白30min。提取物经过(3 600×g，10min)和(100 000×g，45 min)两次离心，分别去除不溶的组织及细胞成分。上清经0.22μm孔径的滤膜过滤和普通的sepharose 4B(Pharmacia公司)预吸附。然后过单克隆抗体MSH27交联的sepharose 4B亲和柱，先后用含0.5%的脱氧胆酸钠和0.5 mol/L氯化钠的碳酸盐缓冲液(pH8.0)进行洗脱。免疫亲和层析分离的蛋白经过透析和冷冻干燥后，进行变性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[1]，检测单抗MSH27识别的睾丸中抗原的分子量。
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3.睾丸的免疫组织化学染色
取新鲜雄性小鼠睾丸，浸于OCT(Tissue-Tek公司)中，立刻于液氮中冻结。于-27℃恒冷箱制备冰冻切片，用4%多聚甲醛固定后进行免疫染色。首先用左旋咪唑和固蓝(fast blue)处理固定后的组织，封闭内源性碱性磷酸酶。然后用10%的小牛血清封闭非特异性结合位点。在组织切片上，依次加MSH27杂交瘤细胞培养上清作一抗、羊抗鼠IgG和碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物(APAAP)，于37℃各孵育1h，每步之后均用含0.05%Tween-20的PBS冲洗3次。其后，用萘酚AS-BI磷酸酯作底物和固红(fast red)偶联显色。对照组不经过单抗MSH27孵育，其他步骤与实验组相同。最后均用Harris苏木精复染。
4.免疫电镜
用1%巴比妥钠麻醉小鼠，打开腹腔，从睾丸动脉注射预冷的PLP固定液(0.01mol/L NaIO4-0.075mol/L赖氨酸-2%多聚甲醛，pH6.2)[2]。至睾丸变白后，剪下睾丸，浸入预冷的PLP液中过夜(固定2h后去除白膜)。睾丸经预冷的PBS漂洗后，用梯度蔗糖-PBS(分别经过含量10%、15%、20%蔗糖和20%蔗糖加10%甘油)逐步浸透，每步于4℃浸泡6h。最后将睾丸转入OCT中渗透。经液氮冷冻5min后，于-20℃制冰冻切片(厚度6μm)，切片贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。
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切片经10%正常羊血清封闭后，加MSH27杂交瘤细胞培养上清孵育1h。经PBS冲洗3次后，加含1%明胶、10%正常羊血清、0.05%Tween-20和0.5mol/L NaCl的PBS(pH8.0)封闭，然后加胶体金(5nm)标记的羊抗鼠IgG(中山生物技术公司产品)孵育1h，用封闭液冲洗。最后用1%锇酸做后固定、梯度酒精脱水，Epon812包埋。超薄切片，醋酸双氧铀染色，透射电镜观察[3]。
结 果
1.单抗MSH27在睾丸中识别的抗原
由免疫亲和层析分离睾丸中的抗原，获得了分子量为126kD和116kD两种蛋白，前者较后者相对含量高(图1)。睾丸中存在的单抗MSH27的抗原和成熟精子中存在的抗原的分子量(39kD)显然不同。
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图1 单抗MSH27睾丸抗原的电泳分析
1.MSH27亲和层析分离的睾丸抗原(如箭头所示)，2.标准蛋白
Fig.1 SDS-PAGE analysis of the testicular antigens of mAb MSH27.
Lane 1, the antigens (pointed by the arrowheads) separated by immuno-affinity chromatography; Lane 2, standard protein markers.2.MSH27睾丸抗原的定位
在免疫组织化学染色图片上可以观察到，MSH27在精子发生的各级精细胞中均呈阳性染色，特别是在曲细精管由基部至管腔中心，染色逐渐加深，这种变化反映了MSH27抗原的密度随生精细胞分化的程度而逐渐增加。同时，在变态过程的精子细胞中，位于精子头后面、将要丢弃的细胞质内也有MSH27着色阳性的区域，因而推测有一部分MSH27抗原随这些细胞质而丢弃(图2)。
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图2 睾丸的免疫组织化学定位(APAAP法)(10×40)
2a。阴性对照；2b.单抗MSH27免疫化学染色
Fig. 2 Immunohisiochemical location of the MSH27 aniigen in testes (APAAP meihod) ( 10×40).2a ,negative control；2b ,lmmuno-location by mAb MSH27
电镜图片可见，胶体金标示的MSH27抗原在各级生精细胞中均有分布，密度变化与免疫组织化学染色变化的趋势相同。睾丸中的MSH27抗原早在精原细胞中就已表达，在各级生精细胞中MSH27抗原均位于细胞内质网及其外侧的囊泡或囊泡膜上(图3a，3c)；在球形精子细胞的变态发育过程中，MSH27抗原由细胞质中均匀分布逐渐集中在顶体帽旁侧的区域(图3b、3d)。而在已变态的精子中却未发现胶体金颗粒的存在。
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图3单抗MSH27的胶体金兔疫电镜图。3a和3c分别为低倍(×15000)和高倍(×60000)的B型精原细胞；3b和3d分别为低倍(×20000)和高倍(×80000)的长型的球形精子细胞。N：细胞核；A：顶体帽；ER：内质网；3b中白色箭头指示顶体帽的膜；3a和3b中黑色箭头指示核膜；3c和3d中箭头指示胶体金颗粒，颗粒周围为囊泡膜
Fig. 3. Immuno-location of the MSH27 antigens by colloid-gold pariicles in eleciron micrographs. One B-type spermatogonium is shown in 3a(×15000) and 3c (×60000) ,and a long spermatid is shown in 3b (×20000)and 3d (×80000). N . nuclei ; A,acrosomes . ER ,endoplasmicreticulum. The white arrowheads(in 3b) point to the rnembrane of acrosome cap. In 3a and 3b, the nuclear membrane is noted (solid arrowheads ) , while in 3c and 3d . the gold particles in vesicles are noted (solid arrowheads ).
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讨 论
从免疫亲和层析分离抗原的结果看，单抗MSH27在睾丸中识别126kD和116kD的蛋白；而以往的研究结果表明，单抗MSH27在成熟精子中识别的抗原分子量为39kD。那么精子中39kD的蛋白和睾丸中126kD及116kD蛋白的关系是怎样的呢?
首先，两者都可以被单抗MSH27识别，而且均是由MSH27的免疫亲和层析分离获得。根据单克隆抗体的特性[4]，精子的39kD蛋白和睾丸中的126kD及116kD蛋白具有相同的抗原决定簇。第二，生理条件下，精子中的MSH27抗原在精子顶体反应后才可以检测到，那么此抗原最初产生于何处呢?在我们以前的研究中，用0.05%(W/V)的胰蛋白酶或高浓度的氯化钠可以使睾丸和附睾头中的精子在顶体完整的状态下暴露MSH27抗原决定簇，因而MSH27抗原在顶体反应前就位于精子的顶体后区，可能是由于和其他蛋白质分子结合而掩蔽了抗原决定簇，使之不能为抗体所识别(待发表论文)。另一方面，免疫组织化学染色也未发现附睾组织中存在或分泌MSH27抗原(未发表的结果)。说明MSH27的精子抗原与其生精细胞抗原一样，都来源于睾丸。第三，126kD及116kD蛋白在精原细胞中就有表达，在此后的各级生精细胞中，抗原分子均位于细胞内质网及内质网形成的囊泡或囊泡膜上；而在长形精子细胞中，抗原所在的囊泡主要集中于顶体帽的旁侧区域。那么在精子细胞变态的过程中，MSH27抗原分子将去往何处呢?一种可能随着细胞质一起被丢弃，另一种可能是随着所在的囊泡被外排到顶体帽旁侧的细胞膜表面，这个区域在精子变态后形成精子的顶体后区，而39kD的单抗MSH27的精子抗原恰恰定位于成熟精子顶体后区的质膜上。
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如系第二种可能，那么单抗MSH27的睾丸抗原及其精子抗原在精子细胞变态过程中于精子的顶体后段产生联系——其中前者在此消失，后者最早在此处被检测到。两者为同源分子，即126kD和116kD蛋白质分子是39kD蛋白的前体。可以这样推测：单抗MSH27识别的睾丸抗原在由囊泡内(或囊泡膜上)向细胞膜迁移的过程中或迁移后，发生了变化，其中包括分子量的变化。以上只是列举了推测MSH27睾丸抗原和精子抗原之间关系的依据，尚有待分子结构方面的证据进行验证。
实际上，在睾丸的精子发生中，表面成分的添加大多是在精子发生的后期才完成的。自身抗原-T是豚鼠生殖细胞的表面蛋白，但是在初级精母细胞和“高尔基”期的球形精子细胞中却检测不到其存在[5，6]；其他的自身抗原也只在精子发生的顶体期之后才出现在质膜上[7，8]。某些特异抗原成分最初可以在粗线期的精母细胞和早期的球形精子细胞表面检测到，这时含量甚少，只有到精子发生的晚期才有大量表达[8，9]。
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抗原成分在精子发生后期插入精子质膜是精子细胞形成膜镶嵌结构的基本策略之一。但是，睾丸中126kD与116kD的蛋白和39kD蛋白之间的关系，以及126kD和116kD的蛋白是如何由细胞内转运到细胞膜上并发生分子量改变的，仍有待深入研究。
* 中国科学院“八五”重点资助课题(S852001)
△ State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Academia Sinica, Beijing 100080,China
参考文献
1 Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature,1970,277(5259):680
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2 McLean IW, Nakane PK. Periodate-lysine-paraformaldehyde fixative: a new fixative for immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem,1974,22(12)：1077
3 Zhuang DZ, Zhang TY, Chen DY. A protein extracted from mouse sperm that plays an important role in fertilization. Dev Biol Reprod,1994,3(1):1
4 Campbell AM. General properties and applications of monoclonal antibodies. In:laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Vol 13:Monoclonal antibody technology. Amsterdam:Elsevier,1984:1-32
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5 Rado I, Voison GA. Ontogenesis of spermatozoa auto-antigens in guinea pig. Differentiation, 1975,3(1):107
6 Le Bouteiller PP, Toullet F, Righenzi S, et al. Ultrastructural localization of guinea pig spermazoal autoantigens on germinal cells by immunoperoxidase techniques. J Histochem Cytochem 1979,27(4):857
7 Tung KSK, Han LPB, Evan AP. Differentiation autoantigen of testicular cells and spermatozoa in the guinea pig. Dev Biol,1979,68(1):224
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8 O'Rand MG, Romrell LJ. Appearance of regional surface autoantigens during spermatogenesis comparison of antitestis and anti-sperm autoantisera. Dev Biol,1980,75(2):431
9 Romrell LJ, O'Rand MG. Capping and ultrastructural localization of sperm surface isoantigens during spermatogenesis. Dev Biol,1978,63(1):76
收稿1998-09 修回1999-01, 百拇医药
单位：中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室，北京 100080
关键词：MSH27抗原；精子形成；定位
解剖学报990414 【摘要】 目的 MSH27是与精、卵质膜融合相关的针对精子抗原的单克隆抗体，本研究检测了此抗体所识别的睾丸抗原分子及其分布。 方法 用免疫亲和层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化、分析了MSH27识别的小鼠睾丸抗原，并用免疫组织化学和免疫电镜进行了定位。 结果 单抗MSH27可识别睾丸提取蛋白中分子量为126kD和116kD的抗原分子，此抗原在睾丸的精原细胞至球形精子细胞的胞质内部均有表达，分布于内质网囊泡内或囊泡膜上。在精子形成过程中，此抗原由胞质内均匀分布变为聚集于顶体帽旁侧的区域，这一区域将形成顶体后区。 结论 126kD和116kD蛋白是单抗MSH27在睾丸中识别的抗原分子，它们可能是单抗MSH27在成熟精子中识别的39kD抗原的前体分子。
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LOCATION OF THE MOUSE MSH27 ANTIGEN IN TESTES
Zhuang Dazhong Song Xiangfen Qi Yuemin Sun Qingyuan Chen DayuanΔ
(State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Academia Sinica, Beijing)
【Abstract】 Objective MSH27 antigen plays an important role in the process of sperm-egg membrane fusion. In this study, the molecular weights and distribution of the antigen were investigated. Methods Immuno-affinity chromatography, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, immunohistochemistry and immunoelectron microscopy were used. Results Two proteins with the molecular weight of 126kD and 116kD were separated from the testicular extraction by immuno-affinity chromatography. It was demonstrated that the antigens were located in the endoplasmic reticulum, or in the vesicles which were released from the endoplasmic reticulum of all the spermatogenic cells, from spermatogonia to spermitids. In the process of the spermiogenesis, the antigens were assembled in the cytoplasm other than the acrosomal cap region, which was destined to form the postacrosomal region of the spermatozoon. Conclusion The 126kD and 116kD proteins, testicular antigens of the mAb MSH27 were deduced to be the precursors of the sperm antigens of mAb MSH27(M.W.39kD).
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【Key words】 MSH27 antigen; Spermiogenesis; Location
抗小鼠精子蛋白的单克隆抗体MSH27在成熟精子中能识别分子量为39kD的抗原分子。过去的研究中发现，此抗原分子在精子顶体反应后位于精子与卵子质膜融合的起始区域即精子的赤道段和顶体后区；纯化的抗原分子及其单克隆抗体在体外受精实验中均可以阻止精、卵膜融合(待发表论文)。当精子在附睾成熟、获能和顶体反应过程中，精子MSH27抗原表位的逐渐暴露并与精子参与精、卵膜融合能力的增加同步(另一待发表论文)。因此，MSH27抗原可能在精、卵膜融合过程中发挥重要的作用。
精子在顶体完整的条件下，不暴露MSH27抗原决定簇，但我们在以往的研究中注意到，一小部分睾丸中的变态精子经过胰蛋白酶处理后呈现MSH27免疫染色阳性，因而推测MSH27抗原是由睾丸产生的。本研究通过免疫组织化学和免疫电镜的方法，观察了睾丸内精子发生过程中MSH27抗原的分布和变化。
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材料和方法
1.材料
雄性昆明系小鼠，10～12周龄。
2.免疫亲和层析和电泳
断颈处死小鼠，取睾丸并去除白膜，于PBS中漂洗以除去分散的细胞，然后于预冷的匀浆器中制备睾丸匀浆。用10倍体积(含1%Triton X-100)的提取液(含5mmol/L EDTA,10mg/L aprotinin, 10mg/L leupeptin, 0.01mol/L PMSF的Tris-HCl缓冲液，pH8.0)提取蛋白30min。提取物经过(3 600×g，10min)和(100 000×g，45 min)两次离心，分别去除不溶的组织及细胞成分。上清经0.22μm孔径的滤膜过滤和普通的sepharose 4B(Pharmacia公司)预吸附。然后过单克隆抗体MSH27交联的sepharose 4B亲和柱，先后用含0.5%的脱氧胆酸钠和0.5 mol/L氯化钠的碳酸盐缓冲液(pH8.0)进行洗脱。免疫亲和层析分离的蛋白经过透析和冷冻干燥后，进行变性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[1]，检测单抗MSH27识别的睾丸中抗原的分子量。
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3.睾丸的免疫组织化学染色
取新鲜雄性小鼠睾丸，浸于OCT(Tissue-Tek公司)中，立刻于液氮中冻结。于-27℃恒冷箱制备冰冻切片，用4%多聚甲醛固定后进行免疫染色。首先用左旋咪唑和固蓝(fast blue)处理固定后的组织，封闭内源性碱性磷酸酶。然后用10%的小牛血清封闭非特异性结合位点。在组织切片上，依次加MSH27杂交瘤细胞培养上清作一抗、羊抗鼠IgG和碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物(APAAP)，于37℃各孵育1h，每步之后均用含0.05%Tween-20的PBS冲洗3次。其后，用萘酚AS-BI磷酸酯作底物和固红(fast red)偶联显色。对照组不经过单抗MSH27孵育，其他步骤与实验组相同。最后均用Harris苏木精复染。
4.免疫电镜
用1%巴比妥钠麻醉小鼠，打开腹腔，从睾丸动脉注射预冷的PLP固定液(0.01mol/L NaIO4-0.075mol/L赖氨酸-2%多聚甲醛，pH6.2)[2]。至睾丸变白后，剪下睾丸，浸入预冷的PLP液中过夜(固定2h后去除白膜)。睾丸经预冷的PBS漂洗后，用梯度蔗糖-PBS(分别经过含量10%、15%、20%蔗糖和20%蔗糖加10%甘油)逐步浸透，每步于4℃浸泡6h。最后将睾丸转入OCT中渗透。经液氮冷冻5min后，于-20℃制冰冻切片(厚度6μm)，切片贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。
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切片经10%正常羊血清封闭后，加MSH27杂交瘤细胞培养上清孵育1h。经PBS冲洗3次后，加含1%明胶、10%正常羊血清、0.05%Tween-20和0.5mol/L NaCl的PBS(pH8.0)封闭，然后加胶体金(5nm)标记的羊抗鼠IgG(中山生物技术公司产品)孵育1h，用封闭液冲洗。最后用1%锇酸做后固定、梯度酒精脱水，Epon812包埋。超薄切片，醋酸双氧铀染色，透射电镜观察[3]。
结 果
1.单抗MSH27在睾丸中识别的抗原
由免疫亲和层析分离睾丸中的抗原，获得了分子量为126kD和116kD两种蛋白，前者较后者相对含量高(图1)。睾丸中存在的单抗MSH27的抗原和成熟精子中存在的抗原的分子量(39kD)显然不同。
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图1 单抗MSH27睾丸抗原的电泳分析
1.MSH27亲和层析分离的睾丸抗原(如箭头所示)，2.标准蛋白
Fig.1 SDS-PAGE analysis of the testicular antigens of mAb MSH27.
Lane 1, the antigens (pointed by the arrowheads) separated by immuno-affinity chromatography; Lane 2, standard protein markers.2.MSH27睾丸抗原的定位
在免疫组织化学染色图片上可以观察到，MSH27在精子发生的各级精细胞中均呈阳性染色，特别是在曲细精管由基部至管腔中心，染色逐渐加深，这种变化反映了MSH27抗原的密度随生精细胞分化的程度而逐渐增加。同时，在变态过程的精子细胞中，位于精子头后面、将要丢弃的细胞质内也有MSH27着色阳性的区域，因而推测有一部分MSH27抗原随这些细胞质而丢弃(图2)。
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图2 睾丸的免疫组织化学定位(APAAP法)(10×40)
2a。阴性对照；2b.单抗MSH27免疫化学染色
Fig. 2 Immunohisiochemical location of the MSH27 aniigen in testes (APAAP meihod) ( 10×40).2a ,negative control；2b ,lmmuno-location by mAb MSH27
电镜图片可见，胶体金标示的MSH27抗原在各级生精细胞中均有分布，密度变化与免疫组织化学染色变化的趋势相同。睾丸中的MSH27抗原早在精原细胞中就已表达，在各级生精细胞中MSH27抗原均位于细胞内质网及其外侧的囊泡或囊泡膜上(图3a，3c)；在球形精子细胞的变态发育过程中，MSH27抗原由细胞质中均匀分布逐渐集中在顶体帽旁侧的区域(图3b、3d)。而在已变态的精子中却未发现胶体金颗粒的存在。
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图3单抗MSH27的胶体金兔疫电镜图。3a和3c分别为低倍(×15000)和高倍(×60000)的B型精原细胞；3b和3d分别为低倍(×20000)和高倍(×80000)的长型的球形精子细胞。N：细胞核；A：顶体帽；ER：内质网；3b中白色箭头指示顶体帽的膜；3a和3b中黑色箭头指示核膜；3c和3d中箭头指示胶体金颗粒，颗粒周围为囊泡膜
Fig. 3. Immuno-location of the MSH27 antigens by colloid-gold pariicles in eleciron micrographs. One B-type spermatogonium is shown in 3a(×15000) and 3c (×60000) ,and a long spermatid is shown in 3b (×20000)and 3d (×80000). N . nuclei ; A,acrosomes . ER ,endoplasmicreticulum. The white arrowheads(in 3b) point to the rnembrane of acrosome cap. In 3a and 3b, the nuclear membrane is noted (solid arrowheads ) , while in 3c and 3d . the gold particles in vesicles are noted (solid arrowheads ).
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从免疫亲和层析分离抗原的结果看，单抗MSH27在睾丸中识别126kD和116kD的蛋白；而以往的研究结果表明，单抗MSH27在成熟精子中识别的抗原分子量为39kD。那么精子中39kD的蛋白和睾丸中126kD及116kD蛋白的关系是怎样的呢?
首先，两者都可以被单抗MSH27识别，而且均是由MSH27的免疫亲和层析分离获得。根据单克隆抗体的特性[4]，精子的39kD蛋白和睾丸中的126kD及116kD蛋白具有相同的抗原决定簇。第二，生理条件下，精子中的MSH27抗原在精子顶体反应后才可以检测到，那么此抗原最初产生于何处呢?在我们以前的研究中，用0.05%(W/V)的胰蛋白酶或高浓度的氯化钠可以使睾丸和附睾头中的精子在顶体完整的状态下暴露MSH27抗原决定簇，因而MSH27抗原在顶体反应前就位于精子的顶体后区，可能是由于和其他蛋白质分子结合而掩蔽了抗原决定簇，使之不能为抗体所识别(待发表论文)。另一方面，免疫组织化学染色也未发现附睾组织中存在或分泌MSH27抗原(未发表的结果)。说明MSH27的精子抗原与其生精细胞抗原一样，都来源于睾丸。第三，126kD及116kD蛋白在精原细胞中就有表达，在此后的各级生精细胞中，抗原分子均位于细胞内质网及内质网形成的囊泡或囊泡膜上；而在长形精子细胞中，抗原所在的囊泡主要集中于顶体帽的旁侧区域。那么在精子细胞变态的过程中，MSH27抗原分子将去往何处呢?一种可能随着细胞质一起被丢弃，另一种可能是随着所在的囊泡被外排到顶体帽旁侧的细胞膜表面，这个区域在精子变态后形成精子的顶体后区，而39kD的单抗MSH27的精子抗原恰恰定位于成熟精子顶体后区的质膜上。
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如系第二种可能，那么单抗MSH27的睾丸抗原及其精子抗原在精子细胞变态过程中于精子的顶体后段产生联系——其中前者在此消失，后者最早在此处被检测到。两者为同源分子，即126kD和116kD蛋白质分子是39kD蛋白的前体。可以这样推测：单抗MSH27识别的睾丸抗原在由囊泡内(或囊泡膜上)向细胞膜迁移的过程中或迁移后，发生了变化，其中包括分子量的变化。以上只是列举了推测MSH27睾丸抗原和精子抗原之间关系的依据，尚有待分子结构方面的证据进行验证。
实际上，在睾丸的精子发生中，表面成分的添加大多是在精子发生的后期才完成的。自身抗原-T是豚鼠生殖细胞的表面蛋白，但是在初级精母细胞和“高尔基”期的球形精子细胞中却检测不到其存在[5，6]；其他的自身抗原也只在精子发生的顶体期之后才出现在质膜上[7，8]。某些特异抗原成分最初可以在粗线期的精母细胞和早期的球形精子细胞表面检测到，这时含量甚少，只有到精子发生的晚期才有大量表达[8，9]。
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抗原成分在精子发生后期插入精子质膜是精子细胞形成膜镶嵌结构的基本策略之一。但是，睾丸中126kD与116kD的蛋白和39kD蛋白之间的关系，以及126kD和116kD的蛋白是如何由细胞内转运到细胞膜上并发生分子量改变的，仍有待深入研究。
* 中国科学院“八五”重点资助课题(S852001)
△ State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Academia Sinica, Beijing 100080,China
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收稿1998-09 修回1999-01, 百拇医药