鸣禽发声控制核团古纹状体粗核壳区的投射研究*
作者：曾少举 彭卫民 张海珠 张信文 左明雪
单位：曾少举 彭卫民 左明雪(北京师范大学生物学系，北京 100875)；张信文(海南师范学院生物学系)；张海珠(山西师范大学生物学系)
关键词：发声核团；古纹状体粗核壳区；听觉通路；鸣禽
解剖学报990407 【摘要】 目的 研究鸣禽端脑古纹状体粗核(RA)壳区的神经联系。 方法 HRP和生物素结合的葡聚糖胺(BDA)的神经示踪技术。 结果 鸣禽古纹状体粗核壳区的传入纤维来自新纹状体听区L1、L3和高级发声中枢壳区(HVC shelf)；传出纤维投向间脑卵圆核壳(Ov shell)、中脑背外侧核与丘间核之间的界面区(MLd/ICo interface)。鸣禽古纹状体粗核壳区与高级发声中枢壳区间与已报道的非鸣禽相应脑区一样存在喙-尾投射关系。 结论 鸣禽古纹状体粗核壳区及与其有联系的其他听觉-发声核团壳区可能具有多种生理功能。鸣禽壳区在进化上较为保守。
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THE PROJECTIONS OF THE SHELL REGIONS
SURROUNDING THE VOCAL-CONTROL NUCLEI
OF ROBUST ARCHISTRIATUM(RA) IN SONGBIRDS
Zeng Shaoju, Peng Weimin, Zhang Haizhu**，Zhang Xinwen*，Zuo MingxueΔ
(Department of Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875；*Department of Biology, Hai Nan Normal College;
, 百拇医药
**Department of Biology, Shanxi Normal University)
【Abstract】 Objective To study the connections of the shell regions surrounding the nuclei of robust archistriatum(RA) in songbirds. Methods The neuronal tract-tracing by applying HRP(horseradish peroxidase),BDA(biotinylated dextran amine). Results RA cup receives the projections from the neostriatum auditory field L1, field L3 and from the high vocal control center shelf(HVC shelf) in the telencephalon. RA cup sends its projections to the nucleus ovoidalis shell(Ov shell) in the diencephalon and the mesencephalicus lateralis pars dorsalis(MLd) and nucleus intercollicularis(ICo) interface(MLd/ICo interface) in the midbrain.The projections between RA cup and HVC shelf in songbirds are complied with the rostral-to-caudal topographical pattern as the corresponding regions in non-songbirds. Conclusion RA cup and the other shell regions, which surround auditory-vocal nuclei and have relations with RA cup, may play different physiological roles. The shell regions surrounding auditory-vocal nuclei probably are more conservative in evolution than the auditory-vocal nuclei.
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【Key words】 Vocal control nuclei; Auditory-vocal pathways; Shell regions; Songbirds
鸟类是研究高等脊椎动物控制发声学习行为的独特的动物模型。到目前为止，已对鸟类控制听觉发声神经核团进行了大量研究，然而对涉及鸟类听觉发声的一些生理活动如鸣唱的学习、记忆，听觉发声与其他感觉及内分泌系统相互作用的神经生物学机制，至今仍缺乏较为深入的认识。近年来，人们发现听觉发声系统各核团周围区域可能参与上述活动。这些区域包括：中脑外侧核背部(nucleus mesencephalicus lateralis, pars dorsalis, MLd)与丘间核(nucleus intercollicularis,ICo)的界面区(MLd/ICo interface)、间脑卵圆核壳区(nucleus ovoidalis shell, Ov shell)、端脑高级发声中枢壳区(high vocal center shelf, HVC shelf)、端脑古纹状体粗核壳区(robust archistriatum cup, RA cup)。目前的电生理实验证明这些区域与它们包绕的听觉发声核团共同参与了听觉发声的整合活动，但壳区内神经元与它们所包绕的核团内神经元在电生理特性方面，有着明显不同，两者对不同的听觉刺激表现出不同的选择性反应[1]。免疫组织化学方面的研究表明，听觉发声核团周围区域大都存在丰富的脑啡肽(enkephalin)神经元和神经纤维、P物质(substance P)、黄体生成素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone)神经元、雌激素受体(estrogen receptor)等，而这些区域包绕的听觉发声核团本身则不存在或很少存在上述神经递质及受体[2]，这表明壳区不仅参与了鸟类的听觉发声活动，还可能参与了以上物质所介导的生理活动。Mello等[3]利用分子原位杂交技术，发现在端脑控制发声听觉神经核团的壳区，存在有听觉刺激引起的ZENK即刻早基因表达，这表明听觉发声核团周围壳区可能参与了鸟类听觉、发声活动的整合以及鸣叫的学习和记忆等复杂活动。近年对非鸣禽环鸽的MLd/ICo界面区和Ov壳进行了较深入的研究，结果表明MLd/ICo界面区和Ov壳均与下丘脑有联系，且MLd/ICo界面区和Ov壳相互间也存在神经投射联系[1，4]，这为鸟类的某些叫声能诱发雌性生殖活动的研究提供了神经解剖学基础。然而对鸣禽端脑控制发声听觉神经核团壳区的研究还较少[5，6]，直至目前尚未见对HVC壳、RA壳相互间神经联系的系统报道[7]。为揭示端脑听觉发声系统核团周围区域与核团本身在结构、生理机能及进化等方面的关系，我们对RA壳及相关区域进行了神经示踪研究，以便阐明鸣禽控制发声、学习等行为的神经生物学机制。
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材料和方法
1.动物及试剂
成年雄性白腰文鸟(十姐妹)(Lonchura striata)(27只)(体重12.5～14.5g)和成年雄性黄雀(Carduelis spinus)(16只)(体重13.1～15.8g)均购自北京鸟类市场。示踪剂采用HRP(美国Sigma公司产品)和生物素结合的葡聚糖胺(biotinylated dextran amine, BDA)(美国Molecular Probe公司产品)。ABC试剂盒为美国Vector公司产品。
2. 神经示踪方法
鸟经10%氨基甲酸乙酯麻醉后，鸟头被固定在立体定位仪上。参照Stokes等[8]金丝雀脑的定位图谱，使用尖端直径为25～40μm的玻璃微电极，通过微电泳(间断电流5μA、7s开、7s关，电泳时间20～30min)或压力注射方法(注射量约为0.01～0.02μl，注射时间约15min)，将5%BDA或25%HRP注入所选脑区(每只鸟仅选择1个注射点)。动物存活4～5d(BDA)或2d(HRP)后，先用生理盐水经左心室灌流，后用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液灌流固定。在冰冻切片机上，脑被切制成40μm厚的矢状切片，隔片取一，经0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤后，直接入ABC复合物4℃孵育12h，DAB-Nickel增色(示踪物为BDA)[9]或TMB呈色反应(示踪剂为HRP)[10]，中性红复染或不复染，另一套切片作焦油紫染色，以辅助确定核团位置。在Olympus(BH-2)显微镜绘图系统下(Camera lucida)绘制实验结果。
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结 果
本实验未发现白腰文鸟与黄雀的投射结果存在差别。古纹状体粗核(RA)的焦油紫染色轮廓清楚，因而较易确定RA壳的内侧界线，但RA壳的外侧边界不清楚，按Vates[6]的投射结果，将RA壳的范围确定在距RA壳内侧界线500μm以内。
1.注射点位于RA壳喙侧
在RA壳喙侧的注射点(图1A，1B)大部分分布在RA边界外200～500μm的范围，仅个别注射点有少量示踪剂扩散入RA核。图1A及图3显示白腰文鸟RA壳喙侧的BDA注射点。该注射点最外侧距RA边界大约300μm左右。在背侧方向，注射点没有超出古纹状体背层(lamina archistriatal dorsalis,LAD)。
图1 矢状切面示RA壳在雄性白腰文鸟端脑和间脑中的投射
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A、B分别示RA壳喙侧的注射点及投射，C、D分别示RA壳背侧、尾侧的注射点及投射。图中脑切片A～D分别距脑正中矢状面约2.30、0.90、2.25、2.30mm。上、下为背腹方向，左右为喙、尾方向。图中的方框区分别对应文后显微照片图3～6。图中大小圆点分别表示注射点和标记细胞，短曲线表示标记纤维。 HVC.高级发声中枢 L1、L2a、L2b、L3.端脑听区 LH.上纹状体板 LAD.古纹状体背层 NC.新纹状体尾部 RA.古纹状体粗核 Ov.卵圆核 Uva.葡萄形核
Fig.1 Parasagittal sections show the projections to telencephalons and diencenphalons from the injection points into RA cup of the adult male white-rumped munias(Lonchura striata). A and B show the injection site of rostral RA cup and its projections, respectively. C and D show the injection sites of dorsal and caudal zone in RA cup and the projections form these injections, respectively. The distance to the brain saggital midline for A-D section is approximately 2.30,0.90，2.25 and 2.30mm,respectively. The dorsal side is upward and the rostral side is on the left for A-D. The boxed area in A-D delineates the scope of Fig.3-6, respectively. In the figures, large and small dots represent injection sites and labeled cells, respectively, and short curves represent labeled fibers.
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HVC, high vocal center; L1,L2a,L2b,L3,auditory neostriatum zones; LH, lamina hyperstriatica; LAD lamina archistriatalis dorsalis; MLd, mesencephalicus lateralis, pars dorsalis; NC, neostriatum caudale; RA, robust archistriatum; Ov, nucleus ovoidalis; Uva, uvaeform nucleus.
在HVC壳的标记细胞分布在HVC边缘外200～800μm范围。许多标记细胞主要分布于HVC壳喙侧和L3区，少数标记细胞出现在L1区、HVC壳喙腹侧(图1A，图4)。当注射点由喙侧移向喙背侧时，也出现以上标记结果，但HVC壳喙腹侧的标记细胞则明显增多(未显示)，HVC壳尾侧未获得标记细胞。图4的HVC核团内几乎没有标记细胞，说明注射点未扩散到RA。另外，间脑的Ov壳(图5)和Uva(uvaeform nucleus)壳、中脑的MLd/ICo界面均获得一些标记纤维(图1B)。
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2.注射点位于RA壳背侧
BDA注射入白腰文鸟和黄雀端脑中的RA壳背侧。注射点范围基本上位于LAD与RA背部边界之间。该注射点所获得的标记细胞较少，仅在HVC壳腹侧有少量标记细胞(图1C)，但环绕RA却获得了极为浓密的标记纤维(图6)。
3.注射点位于RA壳尾侧
BDA注射入白腰文鸟和黄雀端脑中的RA壳尾侧。标记细胞主要出现于HVC壳尾侧及HVC壳下方的新纹状体尾侧区域(neostriatum caudale,NC)，在HVC壳喙侧、腹侧及整个听区均没有获得标记细胞(图1D)。
4.RA壳注射点投射结果的验证
为检验RA壳注射点投射的结果，分别对上述注射RA壳获得标记神经纤维或细胞的区域，即HVC壳的喙侧、腹侧和尾侧，Ov壳，中脑MLd/ICo界面区注射BDA进行逆行示踪。图2A～C及图7～9示HVC壳注射点及投射结果。图2D示Ov壳和中脑MLd/ICo界面处的注射点位置及在RA壳获得的标记细胞。
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图2 矢状切面A～C分别示成年雄黄雀HVC壳注射点及投射
图2D示Ov壳、MLd/ICo界面区的注射点位置及在RA壳的投射。图中脑切片A～C距脑正中矢状面分别为2.40、2.35、2.20mm。上、下为背腹方向，左右为喙、尾方向。图2A、B、D中的方框区分别对应显微照片图7、8、10；图2C对应于显微照片图9的范围。图9中上为喙侧方向，右为背侧方向。大、小圆点分别表示注射点和标记细胞，短曲线表示标记纤维
Fig.2 The parasagittal section A-C shows the injection site of the rostral, ventral, and caudal HVC shelf and its projections, respectively, in adult male siskin(Carduelis spinus).Fig.2D indicates the projections to the RA cup form the injection sites of Ov shell and MLd/ICo interface. The distance to the brain sagittal midline for the section A-C is approximately 2.40，2.35,2.20mm,respectively. Dorsal side is upward and rostral side is on the left for sections A-D. The boxed area in Fig.2 A-D delineates the scope of Fig.7-10, respectively. Dorsal side in Fig. 9 is on the right and rostral side is upward. In the figures, large and small dots represent injection sites and labeled cells, respectively, and short curves represent labeled fibers.
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4.1 HVC壳注射点及其投射：根据Vates等[6]研究结果，HVC壳的界线大约可达HVC外缘的500～800μm。注射点位于HVC壳喙侧时(图2A，图7)，在RA壳喙侧、喙背侧得到了纤维标记。注射点越靠近HVC壳喙侧，在RA壳喙侧得到的标记纤维就越多，而喙背侧、尾侧的标记纤维则很少或完全没有标记。标记纤维大致分布在RA边界外的300μm范围内。当注射点位于HVC壳的喙腹侧时，在RA壳的喙侧、喙背侧均得到了纤维标记(图7)。当注射点位于HVC壳腹侧(图2B)、腹尾侧(图2C)时，在RA壳背侧(图8)、背尾侧(图9)均得到标记。同时在RA核团内也获得少量标记纤维，这是由于该注射点较大，致使部分示踪物扩散至HVC所致。尽管如此，大量标记纤维主要集中分布于RA尾侧。
为检验投射结果，还对HVC核本身电泳，仅在RA核内获得纤维标记，而未在RA壳获任何标记。
4.2 注射点位于中脑MLd/ICo界面处：当注射点位于MLd/ICo界面处时(图2D)，在RA壳喙侧及附近区域获得标记细胞(图10)。
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注射点位于Ov壳：注射点位于Ov壳时，在RA壳喙侧获得标记细胞，标记细胞分布的区域与图10大体一致，主要分布于RA壳喙侧或更靠喙端的区域。两种鸟注射的部位、例数及投射结果显示于附表。
附表 神经示踪的部位及投射结果总结
Table The summary of the injection sites and the projectional results 注射部位
injection sites
投射结果 projectional results
数量
numbers
HVC壳
, 百拇医药
HVC shelf
RA 壳
RA cup
Ov 壳
Ov shell
MLd/ICo界面
MLd/ICo
interface
Ⅰ
Ⅱ
喙侧
rostral
腹侧
, 百拇医药
ventral
尾侧
caudal
喙侧
rostral
背侧
dorsal
尾侧
caudal
HVC壳
HVC shelf
喙侧
rostral
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4
3
—
—
—
+++*
+*
—
—
—
腹侧
Ventral
3
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2
—
—
—
+*
+++*
—
—
—
尾侧
caudal
1
3
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—
—
—
—
—
—
—
—
RA 壳
RA cup
喙侧
rostral
5
3
, 百拇医药
+++
+
—
—
—
—
++*
++*
背侧
dorsal
2
2
—
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++
—
+++
+++*
+++*
—
—
尾侧
caudal
3
2
—
—
, 百拇医药
—
—
—
—
—
—
Ov 壳
Ov shell
5
2
—
—
—
++
, 百拇医药
—
—
—
++
MLd/ICo界面
MLd/ICo interface
4
2
—
—
—
++
—
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—
++*
—
投射纤维或细胞的相对数量：+++.多 ++.中等 +.少 —.无；*表示标记纤维，无*表示标记细胞；数量列中Ⅰ表示使用的十姐妹数量，Ⅱ表示使用的黄雀数量
Relative numbers of labeled neurons or fibers:+++,very high; ++,high;+,low;—,no.*represent labeled fibers and the others;without * represent labeled neurons. Ⅰand Ⅱ in the ‘numbers’column indicate the numbers of white-rumped munias and siskin used in this study, respectively.讨 论
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Mello等[6，7]近期对RA壳作了神经投射方面的研究，推测RA壳与HVC壳之间可能存在喙尾投射关系。但由于实验中注射点少(仅选择了两个RA壳注射点，且一个注射点已经扩散到了RA核团的1/3)，因而未能作出肯定的结论。本实验通过对RA和HVC壳双向逆行示踪的结果证明，RA和HVC壳间存在较为严格的喙尾投射的空间对应关系，因而充分肯定了上述推论。
一些研究者认为HVC壳和RA壳均有纤维广泛投射至端脑听区。我们此次的实验结果显示，HVC壳(喙侧)主要投射至L1区(图2A)，RA壳主要投射到L3区(图1A)，这表明HVC壳和RA壳虽然都与端脑的听区存在投射关系，但并不是弥散投射到整个端脑的L听区，它们的投射具有一定的空间对应关系，这个结果与Bonke等[11]认为听区L1、L2和L3是功能上不连续的区域的推测相一致。
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已往的实验表明，与RA壳有投射关系的Ov壳及中脑MLd/ICo的界面处，均与下丘脑存在有神经联系，推测RA壳可能通过以上与其相联系的区域参与听刺激引起的内分泌、生殖等活动[3，4]。本次实验发现RA壳除接受新纹状体听区L1、L3和高级发声中枢壳区的传入投射外，还与视觉、体感觉有关[15]的核团Uva发生联系。这样，RA壳可能通过这些广泛的神经联系，在参与视觉、体感觉、听觉和发声活动之间的相互作用中发挥重要功能。与哺乳类相比，由于鸟类大脑新皮层几乎未得到发育，推测通常在哺乳类由大脑新皮层完成的整合功能在鸟类可能由RA壳或相关结构承担，这些推测尚需通过电生理等实验加以证实。
Wild[12，13]曾指出，非鸣禽新纹状体与古纹状体间的感觉投射(视、听、体感觉)普遍存在喙尾投射关系，即新纹体喙侧、尾侧分别投射到古纹状体的喙侧、尾侧对应区。由于鸣禽中HVC、RA之间已被确认不存在喙尾关系[5]，而它们周围的壳区却存在这种与非鸣禽相似的投射模式，这表明HVC壳、RA壳可能比HVC、RA在进化上更加保守。由于HVC是鸣禽的听觉发声高级中枢，RA是端脑发声控制中枢传出通路中的最后一个核团，这两个核团仅存在于鸟类鸣禽端脑中，它们在鸣禽的发声学习中起着重要作用。许多实验已表明，即使在同一种鸣禽中，雌、雄间的这两个核团也存在极其明显的性双态性[14]，这也说明它们结构上的保守性较差。通过比较RA和HVC核团与周围壳区的投射联系，以及通过比较这些脑区与非鸣禽相应脑区的进化关系，将有助于理解鸟类控制发声、学习脑区发生、发育的进化机制，并为最终理解人类语言中枢的产生和发展提供有益的参考资料。
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本实验选择的黄雀、白腰文鸟是具有不同鸣叫能力和鸣啭特征的鸣禽。黄雀属雀科，与金丝雀同属，鸣叫成分复杂，属“开放性”鸣禽。白腰文鸟属文鸟科，与Mello[6]采用的斑胸草雀(Zebra finch)相似，鸣叫成分相对简单，属“临界性”鸣禽。本实验在两种鸣禽的研究中获得了相似的结果，这表明鸣禽发声控制核周围“壳”区的神经投射在不同鸣禽中可能是基本相似的。
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图版说明
图3 示RA壳喙、背侧的注射点。虚线示RA壳内侧的喙、背侧边界 标尺示350μm
图4 示RA壳喙侧的投射。HVC壳(注射BDA)中的标记细胞(小箭头) 标尺示350μm
图4～5 示RA壳喙侧的投射。Ov壳中的(注射HRP)标记纤维。图5～10标尺均示350μm
图6 示在RA壳获得的标记纤维(注射点位于RA壳背部)
图7～9 示RA壳的标记纤维。注射点位于HVC壳喙侧、腹侧、尾侧，分别在RA壳喙背侧(图7)、背侧(图8)、背尾侧(图9)出现的标记纤维(箭头)。图7中，标记的RA纤维所在位置与图3中的RA壳喙、背侧的注射点区域大体一致
图10 示RA壳喙侧及附近区域的标记细胞。注射点位于MLd/ICo界面区，在RA壳喙侧及附近区域获得的标记细胞(箭头)，该切面的RA靠近正中矢状面(大约距正中矢状面2.10mm)，因而RA体积较小
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除图5的上方为喙侧方向，向左为腹侧方向外，其余各图上方为背侧方向，向左为喙侧方向。图中缩写词见文中
Explanation of figures
Fig.3 Indicating the injection site of the rostrodorsal RA cup. Dashed lines represent the inner rostrodorsal margin of RA cup. Bar=350μm
Fig.4 Indicating the projections from the rostral RA cup. Retrogradely labeled cells(small arrows) in the rostral HVC shell from the injection of BDA into the rostral RA cup. Bar=350μm
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Figs.4-5 Indicating the projections from the rostral RA cup. Anterogradely labeled fibers in the Ov shell from the injection of HRP into the rostral RA cup. Bar=350μm
Fig.6 Indicating the labeled fibers around the RA cup from the injection into the dorsomedial RA cup.
Figs.7-9 Indicating labeled fibers in the RA cup. Anterogradely labeled fibers(arrows) in the dorsorostral RA cup(Fig.7), dorsal RA cup(Fig.8) and dorsocaudal RA cup (Fig.9)following the injection into the rostral, ventral and caudal shell of HVC. Note that the location of labeled fibers in Fig.7 is approximately consistent with the injection site in Fig.3.
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Fig.10 Indicating the retrogradely labeled cells in the regions around the RA cup. Labeled cells(arrows) in the regions around the rostral RA cup from the injection into the MLd/ICo interface. RA in the section is near to the brain midline(about 2.10 mm) and RA is small.
For the Figs.,dorsal side is upward and rostral side is on left except Fig.5 where rostral side is upward and ventral side is on the left.The abbreviations are given in the article.
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* 国家自然科学基金资助课题(No.39570250和39870097)
△ Department of Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875,China
参考文献
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收稿1998-10 修回1999-03, 百拇医药
单位：曾少举 彭卫民 左明雪(北京师范大学生物学系，北京 100875)；张信文(海南师范学院生物学系)；张海珠(山西师范大学生物学系)
关键词：发声核团；古纹状体粗核壳区；听觉通路；鸣禽
解剖学报990407 【摘要】 目的 研究鸣禽端脑古纹状体粗核(RA)壳区的神经联系。 方法 HRP和生物素结合的葡聚糖胺(BDA)的神经示踪技术。 结果 鸣禽古纹状体粗核壳区的传入纤维来自新纹状体听区L1、L3和高级发声中枢壳区(HVC shelf)；传出纤维投向间脑卵圆核壳(Ov shell)、中脑背外侧核与丘间核之间的界面区(MLd/ICo interface)。鸣禽古纹状体粗核壳区与高级发声中枢壳区间与已报道的非鸣禽相应脑区一样存在喙-尾投射关系。 结论 鸣禽古纹状体粗核壳区及与其有联系的其他听觉-发声核团壳区可能具有多种生理功能。鸣禽壳区在进化上较为保守。
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THE PROJECTIONS OF THE SHELL REGIONS
SURROUNDING THE VOCAL-CONTROL NUCLEI
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Zeng Shaoju, Peng Weimin, Zhang Haizhu**，Zhang Xinwen*，Zuo MingxueΔ
(Department of Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875；*Department of Biology, Hai Nan Normal College;
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【Abstract】 Objective To study the connections of the shell regions surrounding the nuclei of robust archistriatum(RA) in songbirds. Methods The neuronal tract-tracing by applying HRP(horseradish peroxidase),BDA(biotinylated dextran amine). Results RA cup receives the projections from the neostriatum auditory field L1, field L3 and from the high vocal control center shelf(HVC shelf) in the telencephalon. RA cup sends its projections to the nucleus ovoidalis shell(Ov shell) in the diencephalon and the mesencephalicus lateralis pars dorsalis(MLd) and nucleus intercollicularis(ICo) interface(MLd/ICo interface) in the midbrain.The projections between RA cup and HVC shelf in songbirds are complied with the rostral-to-caudal topographical pattern as the corresponding regions in non-songbirds. Conclusion RA cup and the other shell regions, which surround auditory-vocal nuclei and have relations with RA cup, may play different physiological roles. The shell regions surrounding auditory-vocal nuclei probably are more conservative in evolution than the auditory-vocal nuclei.
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【Key words】 Vocal control nuclei; Auditory-vocal pathways; Shell regions; Songbirds
鸟类是研究高等脊椎动物控制发声学习行为的独特的动物模型。到目前为止，已对鸟类控制听觉发声神经核团进行了大量研究，然而对涉及鸟类听觉发声的一些生理活动如鸣唱的学习、记忆，听觉发声与其他感觉及内分泌系统相互作用的神经生物学机制，至今仍缺乏较为深入的认识。近年来，人们发现听觉发声系统各核团周围区域可能参与上述活动。这些区域包括：中脑外侧核背部(nucleus mesencephalicus lateralis, pars dorsalis, MLd)与丘间核(nucleus intercollicularis,ICo)的界面区(MLd/ICo interface)、间脑卵圆核壳区(nucleus ovoidalis shell, Ov shell)、端脑高级发声中枢壳区(high vocal center shelf, HVC shelf)、端脑古纹状体粗核壳区(robust archistriatum cup, RA cup)。目前的电生理实验证明这些区域与它们包绕的听觉发声核团共同参与了听觉发声的整合活动，但壳区内神经元与它们所包绕的核团内神经元在电生理特性方面，有着明显不同，两者对不同的听觉刺激表现出不同的选择性反应[1]。免疫组织化学方面的研究表明，听觉发声核团周围区域大都存在丰富的脑啡肽(enkephalin)神经元和神经纤维、P物质(substance P)、黄体生成素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone)神经元、雌激素受体(estrogen receptor)等，而这些区域包绕的听觉发声核团本身则不存在或很少存在上述神经递质及受体[2]，这表明壳区不仅参与了鸟类的听觉发声活动，还可能参与了以上物质所介导的生理活动。Mello等[3]利用分子原位杂交技术，发现在端脑控制发声听觉神经核团的壳区，存在有听觉刺激引起的ZENK即刻早基因表达，这表明听觉发声核团周围壳区可能参与了鸟类听觉、发声活动的整合以及鸣叫的学习和记忆等复杂活动。近年对非鸣禽环鸽的MLd/ICo界面区和Ov壳进行了较深入的研究，结果表明MLd/ICo界面区和Ov壳均与下丘脑有联系，且MLd/ICo界面区和Ov壳相互间也存在神经投射联系[1，4]，这为鸟类的某些叫声能诱发雌性生殖活动的研究提供了神经解剖学基础。然而对鸣禽端脑控制发声听觉神经核团壳区的研究还较少[5，6]，直至目前尚未见对HVC壳、RA壳相互间神经联系的系统报道[7]。为揭示端脑听觉发声系统核团周围区域与核团本身在结构、生理机能及进化等方面的关系，我们对RA壳及相关区域进行了神经示踪研究，以便阐明鸣禽控制发声、学习等行为的神经生物学机制。
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材料和方法
1.动物及试剂
成年雄性白腰文鸟(十姐妹)(Lonchura striata)(27只)(体重12.5～14.5g)和成年雄性黄雀(Carduelis spinus)(16只)(体重13.1～15.8g)均购自北京鸟类市场。示踪剂采用HRP(美国Sigma公司产品)和生物素结合的葡聚糖胺(biotinylated dextran amine, BDA)(美国Molecular Probe公司产品)。ABC试剂盒为美国Vector公司产品。
2. 神经示踪方法
鸟经10%氨基甲酸乙酯麻醉后，鸟头被固定在立体定位仪上。参照Stokes等[8]金丝雀脑的定位图谱，使用尖端直径为25～40μm的玻璃微电极，通过微电泳(间断电流5μA、7s开、7s关，电泳时间20～30min)或压力注射方法(注射量约为0.01～0.02μl，注射时间约15min)，将5%BDA或25%HRP注入所选脑区(每只鸟仅选择1个注射点)。动物存活4～5d(BDA)或2d(HRP)后，先用生理盐水经左心室灌流，后用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液灌流固定。在冰冻切片机上，脑被切制成40μm厚的矢状切片，隔片取一，经0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤后，直接入ABC复合物4℃孵育12h，DAB-Nickel增色(示踪物为BDA)[9]或TMB呈色反应(示踪剂为HRP)[10]，中性红复染或不复染，另一套切片作焦油紫染色，以辅助确定核团位置。在Olympus(BH-2)显微镜绘图系统下(Camera lucida)绘制实验结果。
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结 果
本实验未发现白腰文鸟与黄雀的投射结果存在差别。古纹状体粗核(RA)的焦油紫染色轮廓清楚，因而较易确定RA壳的内侧界线，但RA壳的外侧边界不清楚，按Vates[6]的投射结果，将RA壳的范围确定在距RA壳内侧界线500μm以内。
1.注射点位于RA壳喙侧
在RA壳喙侧的注射点(图1A，1B)大部分分布在RA边界外200～500μm的范围，仅个别注射点有少量示踪剂扩散入RA核。图1A及图3显示白腰文鸟RA壳喙侧的BDA注射点。该注射点最外侧距RA边界大约300μm左右。在背侧方向，注射点没有超出古纹状体背层(lamina archistriatal dorsalis,LAD)。
图1 矢状切面示RA壳在雄性白腰文鸟端脑和间脑中的投射
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A、B分别示RA壳喙侧的注射点及投射，C、D分别示RA壳背侧、尾侧的注射点及投射。图中脑切片A～D分别距脑正中矢状面约2.30、0.90、2.25、2.30mm。上、下为背腹方向，左右为喙、尾方向。图中的方框区分别对应文后显微照片图3～6。图中大小圆点分别表示注射点和标记细胞，短曲线表示标记纤维。 HVC.高级发声中枢 L1、L2a、L2b、L3.端脑听区 LH.上纹状体板 LAD.古纹状体背层 NC.新纹状体尾部 RA.古纹状体粗核 Ov.卵圆核 Uva.葡萄形核
Fig.1 Parasagittal sections show the projections to telencephalons and diencenphalons from the injection points into RA cup of the adult male white-rumped munias(Lonchura striata). A and B show the injection site of rostral RA cup and its projections, respectively. C and D show the injection sites of dorsal and caudal zone in RA cup and the projections form these injections, respectively. The distance to the brain saggital midline for A-D section is approximately 2.30,0.90，2.25 and 2.30mm,respectively. The dorsal side is upward and the rostral side is on the left for A-D. The boxed area in A-D delineates the scope of Fig.3-6, respectively. In the figures, large and small dots represent injection sites and labeled cells, respectively, and short curves represent labeled fibers.
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HVC, high vocal center; L1,L2a,L2b,L3,auditory neostriatum zones; LH, lamina hyperstriatica; LAD lamina archistriatalis dorsalis; MLd, mesencephalicus lateralis, pars dorsalis; NC, neostriatum caudale; RA, robust archistriatum; Ov, nucleus ovoidalis; Uva, uvaeform nucleus.
在HVC壳的标记细胞分布在HVC边缘外200～800μm范围。许多标记细胞主要分布于HVC壳喙侧和L3区，少数标记细胞出现在L1区、HVC壳喙腹侧(图1A，图4)。当注射点由喙侧移向喙背侧时，也出现以上标记结果，但HVC壳喙腹侧的标记细胞则明显增多(未显示)，HVC壳尾侧未获得标记细胞。图4的HVC核团内几乎没有标记细胞，说明注射点未扩散到RA。另外，间脑的Ov壳(图5)和Uva(uvaeform nucleus)壳、中脑的MLd/ICo界面均获得一些标记纤维(图1B)。
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2.注射点位于RA壳背侧
BDA注射入白腰文鸟和黄雀端脑中的RA壳背侧。注射点范围基本上位于LAD与RA背部边界之间。该注射点所获得的标记细胞较少，仅在HVC壳腹侧有少量标记细胞(图1C)，但环绕RA却获得了极为浓密的标记纤维(图6)。
3.注射点位于RA壳尾侧
BDA注射入白腰文鸟和黄雀端脑中的RA壳尾侧。标记细胞主要出现于HVC壳尾侧及HVC壳下方的新纹状体尾侧区域(neostriatum caudale,NC)，在HVC壳喙侧、腹侧及整个听区均没有获得标记细胞(图1D)。
4.RA壳注射点投射结果的验证
为检验RA壳注射点投射的结果，分别对上述注射RA壳获得标记神经纤维或细胞的区域，即HVC壳的喙侧、腹侧和尾侧，Ov壳，中脑MLd/ICo界面区注射BDA进行逆行示踪。图2A～C及图7～9示HVC壳注射点及投射结果。图2D示Ov壳和中脑MLd/ICo界面处的注射点位置及在RA壳获得的标记细胞。
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图2 矢状切面A～C分别示成年雄黄雀HVC壳注射点及投射
图2D示Ov壳、MLd/ICo界面区的注射点位置及在RA壳的投射。图中脑切片A～C距脑正中矢状面分别为2.40、2.35、2.20mm。上、下为背腹方向，左右为喙、尾方向。图2A、B、D中的方框区分别对应显微照片图7、8、10；图2C对应于显微照片图9的范围。图9中上为喙侧方向，右为背侧方向。大、小圆点分别表示注射点和标记细胞，短曲线表示标记纤维
Fig.2 The parasagittal section A-C shows the injection site of the rostral, ventral, and caudal HVC shelf and its projections, respectively, in adult male siskin(Carduelis spinus).Fig.2D indicates the projections to the RA cup form the injection sites of Ov shell and MLd/ICo interface. The distance to the brain sagittal midline for the section A-C is approximately 2.40，2.35,2.20mm,respectively. Dorsal side is upward and rostral side is on the left for sections A-D. The boxed area in Fig.2 A-D delineates the scope of Fig.7-10, respectively. Dorsal side in Fig. 9 is on the right and rostral side is upward. In the figures, large and small dots represent injection sites and labeled cells, respectively, and short curves represent labeled fibers.
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4.1 HVC壳注射点及其投射：根据Vates等[6]研究结果，HVC壳的界线大约可达HVC外缘的500～800μm。注射点位于HVC壳喙侧时(图2A，图7)，在RA壳喙侧、喙背侧得到了纤维标记。注射点越靠近HVC壳喙侧，在RA壳喙侧得到的标记纤维就越多，而喙背侧、尾侧的标记纤维则很少或完全没有标记。标记纤维大致分布在RA边界外的300μm范围内。当注射点位于HVC壳的喙腹侧时，在RA壳的喙侧、喙背侧均得到了纤维标记(图7)。当注射点位于HVC壳腹侧(图2B)、腹尾侧(图2C)时，在RA壳背侧(图8)、背尾侧(图9)均得到标记。同时在RA核团内也获得少量标记纤维，这是由于该注射点较大，致使部分示踪物扩散至HVC所致。尽管如此，大量标记纤维主要集中分布于RA尾侧。
为检验投射结果，还对HVC核本身电泳，仅在RA核内获得纤维标记，而未在RA壳获任何标记。
4.2 注射点位于中脑MLd/ICo界面处：当注射点位于MLd/ICo界面处时(图2D)，在RA壳喙侧及附近区域获得标记细胞(图10)。
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注射点位于Ov壳：注射点位于Ov壳时，在RA壳喙侧获得标记细胞，标记细胞分布的区域与图10大体一致，主要分布于RA壳喙侧或更靠喙端的区域。两种鸟注射的部位、例数及投射结果显示于附表。
附表 神经示踪的部位及投射结果总结
Table The summary of the injection sites and the projectional results 注射部位
injection sites
投射结果 projectional results
数量
numbers
HVC壳
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HVC shelf
RA 壳
RA cup
Ov 壳
Ov shell
MLd/ICo界面
MLd/ICo
interface
Ⅰ
Ⅱ
喙侧
rostral
腹侧
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ventral
尾侧
caudal
喙侧
rostral
背侧
dorsal
尾侧
caudal
HVC壳
HVC shelf
喙侧
rostral
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4
3
—
—
—
+++*
+*
—
—
—
腹侧
Ventral
3
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2
—
—
—
+*
+++*
—
—
—
尾侧
caudal
1
3
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—
—
—
—
—
—
—
—
RA 壳
RA cup
喙侧
rostral
5
3
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+++
+
—
—
—
—
++*
++*
背侧
dorsal
2
2
—
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++
—
+++
+++*
+++*
—
—
尾侧
caudal
3
2
—
—
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—
—
—
—
—
—
Ov 壳
Ov shell
5
2
—
—
—
++
, 百拇医药
—
—
—
++
MLd/ICo界面
MLd/ICo interface
4
2
—
—
—
++
—
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—
++*
—
投射纤维或细胞的相对数量：+++.多 ++.中等 +.少 —.无；*表示标记纤维，无*表示标记细胞；数量列中Ⅰ表示使用的十姐妹数量，Ⅱ表示使用的黄雀数量
Relative numbers of labeled neurons or fibers:+++,very high; ++,high;+,low;—,no.*represent labeled fibers and the others;without * represent labeled neurons. Ⅰand Ⅱ in the ‘numbers’column indicate the numbers of white-rumped munias and siskin used in this study, respectively.讨 论
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Mello等[6，7]近期对RA壳作了神经投射方面的研究，推测RA壳与HVC壳之间可能存在喙尾投射关系。但由于实验中注射点少(仅选择了两个RA壳注射点，且一个注射点已经扩散到了RA核团的1/3)，因而未能作出肯定的结论。本实验通过对RA和HVC壳双向逆行示踪的结果证明，RA和HVC壳间存在较为严格的喙尾投射的空间对应关系，因而充分肯定了上述推论。
一些研究者认为HVC壳和RA壳均有纤维广泛投射至端脑听区。我们此次的实验结果显示，HVC壳(喙侧)主要投射至L1区(图2A)，RA壳主要投射到L3区(图1A)，这表明HVC壳和RA壳虽然都与端脑的听区存在投射关系，但并不是弥散投射到整个端脑的L听区，它们的投射具有一定的空间对应关系，这个结果与Bonke等[11]认为听区L1、L2和L3是功能上不连续的区域的推测相一致。
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已往的实验表明，与RA壳有投射关系的Ov壳及中脑MLd/ICo的界面处，均与下丘脑存在有神经联系，推测RA壳可能通过以上与其相联系的区域参与听刺激引起的内分泌、生殖等活动[3，4]。本次实验发现RA壳除接受新纹状体听区L1、L3和高级发声中枢壳区的传入投射外，还与视觉、体感觉有关[15]的核团Uva发生联系。这样，RA壳可能通过这些广泛的神经联系，在参与视觉、体感觉、听觉和发声活动之间的相互作用中发挥重要功能。与哺乳类相比，由于鸟类大脑新皮层几乎未得到发育，推测通常在哺乳类由大脑新皮层完成的整合功能在鸟类可能由RA壳或相关结构承担，这些推测尚需通过电生理等实验加以证实。
Wild[12，13]曾指出，非鸣禽新纹状体与古纹状体间的感觉投射(视、听、体感觉)普遍存在喙尾投射关系，即新纹体喙侧、尾侧分别投射到古纹状体的喙侧、尾侧对应区。由于鸣禽中HVC、RA之间已被确认不存在喙尾关系[5]，而它们周围的壳区却存在这种与非鸣禽相似的投射模式，这表明HVC壳、RA壳可能比HVC、RA在进化上更加保守。由于HVC是鸣禽的听觉发声高级中枢，RA是端脑发声控制中枢传出通路中的最后一个核团，这两个核团仅存在于鸟类鸣禽端脑中，它们在鸣禽的发声学习中起着重要作用。许多实验已表明，即使在同一种鸣禽中，雌、雄间的这两个核团也存在极其明显的性双态性[14]，这也说明它们结构上的保守性较差。通过比较RA和HVC核团与周围壳区的投射联系，以及通过比较这些脑区与非鸣禽相应脑区的进化关系，将有助于理解鸟类控制发声、学习脑区发生、发育的进化机制，并为最终理解人类语言中枢的产生和发展提供有益的参考资料。
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本实验选择的黄雀、白腰文鸟是具有不同鸣叫能力和鸣啭特征的鸣禽。黄雀属雀科，与金丝雀同属，鸣叫成分复杂，属“开放性”鸣禽。白腰文鸟属文鸟科，与Mello[6]采用的斑胸草雀(Zebra finch)相似，鸣叫成分相对简单，属“临界性”鸣禽。本实验在两种鸣禽的研究中获得了相似的结果，这表明鸣禽发声控制核周围“壳”区的神经投射在不同鸣禽中可能是基本相似的。
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图版说明
图3 示RA壳喙、背侧的注射点。虚线示RA壳内侧的喙、背侧边界 标尺示350μm
图4 示RA壳喙侧的投射。HVC壳(注射BDA)中的标记细胞(小箭头) 标尺示350μm
图4～5 示RA壳喙侧的投射。Ov壳中的(注射HRP)标记纤维。图5～10标尺均示350μm
图6 示在RA壳获得的标记纤维(注射点位于RA壳背部)
图7～9 示RA壳的标记纤维。注射点位于HVC壳喙侧、腹侧、尾侧，分别在RA壳喙背侧(图7)、背侧(图8)、背尾侧(图9)出现的标记纤维(箭头)。图7中，标记的RA纤维所在位置与图3中的RA壳喙、背侧的注射点区域大体一致
图10 示RA壳喙侧及附近区域的标记细胞。注射点位于MLd/ICo界面区，在RA壳喙侧及附近区域获得的标记细胞(箭头)，该切面的RA靠近正中矢状面(大约距正中矢状面2.10mm)，因而RA体积较小
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除图5的上方为喙侧方向，向左为腹侧方向外，其余各图上方为背侧方向，向左为喙侧方向。图中缩写词见文中
Explanation of figures
Fig.3 Indicating the injection site of the rostrodorsal RA cup. Dashed lines represent the inner rostrodorsal margin of RA cup. Bar=350μm
Fig.4 Indicating the projections from the rostral RA cup. Retrogradely labeled cells(small arrows) in the rostral HVC shell from the injection of BDA into the rostral RA cup. Bar=350μm
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Figs.4-5 Indicating the projections from the rostral RA cup. Anterogradely labeled fibers in the Ov shell from the injection of HRP into the rostral RA cup. Bar=350μm
Fig.6 Indicating the labeled fibers around the RA cup from the injection into the dorsomedial RA cup.
Figs.7-9 Indicating labeled fibers in the RA cup. Anterogradely labeled fibers(arrows) in the dorsorostral RA cup(Fig.7), dorsal RA cup(Fig.8) and dorsocaudal RA cup (Fig.9)following the injection into the rostral, ventral and caudal shell of HVC. Note that the location of labeled fibers in Fig.7 is approximately consistent with the injection site in Fig.3.
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Fig.10 Indicating the retrogradely labeled cells in the regions around the RA cup. Labeled cells(arrows) in the regions around the rostral RA cup from the injection into the MLd/ICo interface. RA in the section is near to the brain midline(about 2.10 mm) and RA is small.
For the Figs.,dorsal side is upward and rostral side is on left except Fig.5 where rostral side is upward and ventral side is on the left.The abbreviations are given in the article.
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* 国家自然科学基金资助课题(No.39570250和39870097)
△ Department of Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875,China
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收稿1998-10 修回1999-03, 百拇医药