小鼠1-细胞胚胎体外培养条件的研究*
作者：刘忠华 谭景和 贺桂馨
单位：东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030
关键词：1-细胞胚胎；培养系统；小鼠
解剖学报990423 【摘要】 目的 检验培养基(Whitten、CZB、SOM和KSOM)、培养器皿(进口、国产新旧平皿)与配制培养基的水质对小鼠胚胎体外发育的影响。 方法 采用微滴培养法培养昆明种小白鼠1-细胞胚胎，以胚胎发育到囊胚的比例为判断培养效果的标准。 结果 Whitten、CZB、SOM和KSOM培养基中2-细胞发育率分别为100%、100%、100%和98.6%，而囊胚发育率却分别为0%、78.3%、4.8%和9.5%；用三蒸水、五蒸水和去离子水配制的CZB培养基，培养囊胚发育率分别为40.8%、54.1%和52.4%；国产和进口新平皿的囊胚发育率分别为68.0%和72.2%；国产和进口旧平皿的培养囊胚发育率为27.2%和46.1%。 结论 昆明小白鼠早期胚胎存在体外发育阻断现象；CZB培养基培养昆明小白鼠早期胚胎效果最好；用三蒸水、五蒸水和去离子水配制的CZB培养基培养结果无显著差别；进口和国产新平皿的培养效果相近，但再次使用时培养效果显著下降。
, 百拇医药
STUDIES ON THE CONDITIONS FOR THE CULTURE OF
ONE-CELL MOUSE EMBRYOS
Liu Zhonghua, Tan Jinghe△, He Guixin
(Department of Biotechnology, North-East Agricultural University, Harbin)
【Abstract】 Objective To study the effects of culture media, types of culture dish and types of water used for preparation of media on the in vitro development of one-cell embryos in the mice of Kunming breed. Method One-cell mouse embryos collected from the oviduct of the superovulated mice were cultured in microdrops of medium and the percentage of embryos developed to blastocyst stage was used as evaluation criteria. Results (1)When one-cell mouse embryos were cultured in the Whitten's, CZB, SOM and KSOM media, the cleavage percentages were 100%,100%,100% and 98.6%, respectively, and the blastocyst percentages were 0%, 78.3%, 4.8% and 9.5%, respectively. (2)The blastocyst percentages obtained from the CZB media prepared from the triple-distilled, fivefold-distilled and deionized water were 40.8%, 54.1% and 52.4%, respectively. (3)The blastocyst percentages produced from the Chinese-made and the imported culture dishes were 68.0% and 72.2%, respectively, but those obtained when the dishes were used for the second time were decreased significantly (being only 27.2% and 46.1%, respectively). Conclusions There existed a development block during the in vitro development of the mouse embryos of the Kunming breed. Among the media tested CZB was the best in supporting the development of one-cell mouse embryos to blastocyst stage. No significant difference was found among the CZB media prepared from the triple-distilled, fivefold-distilled and deionized water in blastocyst percentages. Both the Chinese-made and the imported culture dishes produced good results of embryo development when used for the first time but the blastocyst percentages decreased significantly when the culture dishes were washed and used for the second time.
, 百拇医药
【Key words】 One-cell embryo; Culture system; Mouse
胚胎体外培养是胚胎工程研究的重要基础条件。因此，建立稳定、可靠的哺乳动物胚胎体外培养系统已成为当前这一领域的重要研究课题之一。在体外培养哺乳动物早期胚胎时，几乎都会不同程度的发生体外发育阻断(in vitro block of develo-pment)现象[1]。采用体细胞与胚胎共同培养和改进培养基成分，以形成可克服体外发育阻断的化学成分明确培养基，是当前人们试图解决这一难题的两个主要方向，而化学成分明确培养基(chemically defined medium)培养胚胎，这种方法以其操作简便，有利于发育阻断机理研究而尤为人们重视。CZB，SOM和KSOM培养基就是最近出现的几种效果较好的成分明确培养基[2，3]。除培养基外，影响胚胎培养效果的因素还很多，其中培养器皿与配制培养基的水质是两个不容忽视的因素。William研究发现不同厂家，不同批次的培养器皿以及不同的清洗、灭菌和包装方法可明显影响小鼠胚胎体外发育效果[4]。因此，本次实验采用微滴培养法对昆明小白鼠1-细胞胚胎进行培养并依据胚胎发育到囊胚的比例为判断标准，对培养基、培养器皿及配制培养基的水质进行了研究，以期为建立完善的哺乳动物早期胚胎培养系统提供一些参考。
, http://www.100md.com
材料和方法
控光饲养(14h光照，10h黑暗)的8～12周龄昆明白雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10 IU/只，间隔48h腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 IU/只，进行超排处理。注hCG后与公鼠合笼，次日见阴道栓者于注射hCG后22～24h断颈椎处死，于输卵管中冲取1-细胞胚胎，用300 IU/ml的透明质酸酶去除卵丘细胞后用于实验。
CZB培养基，SOM培养基，KSOM培养基，Whitten培养基以及M2按文献[2，3]所载配方配制。
去离子水采用SYBROY BARNSTEAD(美国产)纯水器制取；三蒸水用自动双重纯水蒸馏器(上海玻璃仪器一厂生产)蒸馏制得；五蒸水为三蒸水再次经过自动双重纯水蒸馏器蒸馏制得。3种纯水经电导仪测量其电导值分别为2.1μΩ-1、2.6μΩ-1和1.8μΩ-1。
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进口平皿为美国COSTAR公司产，规格为35×10 mm；国产平皿购自安普公司，规格也为35×10 mm。培养用过的新平皿回收，用脱脂棉在碱液中擦洗干净，清水冲洗，干燥，4%盐酸浸泡24h，清水冲净，蒸馏水冲洗至少3遍，纯水冲洗2遍后烘干。用前紫外线灭菌30min。
用微量移液器吸取培养液在平皿中制成50μl的培养滴，覆盖石蜡油置CO2培养箱中平衡2h后，将待培养胚胎移入微滴，于5%CO2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，每滴中培养胚胎10个左右。
实验所得数据均采用百分数t检验进行统计学处理。
结果和讨论
实验用国产新平皿做为培养器皿，比较了用去离子水配制的Whitten、CZB、SOM和KSOM培养基培养体内取出的小鼠1-细胞胚胎的效果，结果见表1。各种培养基中2-细胞发育率几乎都是百分之百；培养48h后,Whitten、CZB、SOM和KSOM培养基中4-细胞发育率分别为7.4%、90.0%、72.4%和63.5%。Whitten培养基中的发育率极显著低于其他3组；培养96h，Whitten、CZB、SOM和KSOM中囊胚发育率分别为0、78.3%、11.8%和9.5%，CZB培养基中囊胚发育率极显著高于其他3种培养基。由此可以看出，在昆明小白鼠早期胚胎的培养中确实存在发育阻断现象，而CZB培养基可以成功的克服昆明小白鼠胚胎早期的体外发育阻断。尽管Gregory[3]用SOM和KSOM两种培养基培养小鼠早期胚胎获得了很高的囊胚率，但在我们的实验中虽然通过2-细胞阻断的比例较高，却未能成功维持胚胎由4-细胞到囊胚期的发育。
, 百拇医药
表1 不同培养基培养小鼠1-细胞胚胎发育结果
Table 1 In vitro development of 1-cell mouse embryos in different culture media 培养基
culture
media
重复次数
No.of
replicates
培养胚胎数
No.of embryos
cultured
, http://www.100md.com
发育胚胎数
No.of embryos developed(%)
2-细胞
4-细胞
囊胚
2-c
4-c
blastocyst
Whitten
5
54
54(100)
, http://www.100md.com
4(7.4)a
0(0)a
CZB
5
60
60(100)
54(90)b
47(78.3)b
SOM
5
76
76(100)
, http://www.100md.com
55(72.4)c
9(4.8)c
KSOM
5
74
73(98.6)
47(63.5)c
7(9.5)c
注：同一列中具不同上标者差异显著(P<0.05).
Note:the difference among values with different superscripts is significant(P<0.05).
, 百拇医药
配制培养基所使用的水质不同也往往会造成培养效果的差异。实验采用国产新平皿做为培养器皿，用3种不同纯水配制的CZB培养基培养小鼠1-细胞胚胎，结果见表2。三蒸水，五蒸水和去离子水配制的CZB培养基中4-细胞发育率分别为73.2%、71.6%和77.85%，三者无显著差异；囊胚发育率分别为40.8%、54.1%和42.4%，三者差异也未达显著水平。本次实验所用的3种纯水全部是由同一种来源的一蒸水制得。三蒸水和五蒸水是单纯靠蒸馏次数的增加制得的，而去离子水是通过离子交换，反渗透压作用以及超滤最终获得的。由于单纯蒸馏并不能除去所有离子，所以理论上应该是去离子水配制的培养基培养效果要好一些。但事实并非如此，这可能是由于所使用的一蒸水水质较好，通过单纯蒸馏就达到了纯化水质的目的。
表2 不同水质对小鼠1-细胞胚胎发育的影响
Table 2 In vitro development of 1-cell mouse embryos in CZB made from different types of water 水质
, http://www.100md.com
types of water
重复次数
No.of
replicates
培养胚胎数
No.of embryos
cultured
发育胚胎数
No.of embryos
developed(%)
桑葚胚
囊胚
, 百拇医药
morula
blastocyst
三蒸水
triple
distrilled
6
71
52(73.2)
29(40.8)
五蒸水
five-times
distrilled
, 百拇医药
6
74
53(71.6)
40(54.1)
去离子水
deionized
water
5
63
49(77.8)
33(52.4)
不同来源的培养皿，以及再次使用前的清洗方法都会造成胚胎培养效果的差异。实验采用去离子水配制的CZB培养基，分别用进口新平皿和旧平皿及国产新平皿和旧平皿做为培养器皿进行小鼠1-细胞胚胎培养，结果见表3。在上述4种平皿中培养的4-细胞发育率别为96.3%、67.1%、84.0%和43.2%；囊胚发育率分别为72.2%、46.1%、68.0%和27.2%。进口新平皿与国产新平皿的4-细胞发育率及囊胚发育率均无显著差异；两者与旧平皿间的4-细胞发育率和囊胚发育率均具显著差异；而进口旧平皿的4-细胞发育率和囊胚发育率又均显著高于国产旧平皿的发育率。其原因，我们认为有可能是由于现用的平皿清洗方法不够完善，致使平皿上的一些有害因子未能清除掉，或者清洗过程本身又使平皿沾染上了一些对细胞有害的因子，从而造成囊胚发育率下降。因此，进行胚胎培养一次性使用国产平皿是较为明智的。表3 不同平皿对小鼠1-细胞胚胎发育的影响
, http://www.100md.com
Table 3 Effect of culture dish on in vitro development of 1-cell mouse embryos 平皿类型
types of
culture dish
重复次数
No.of
replicates
培养胚胎数
No.of embryos
cultured
发育胚胎数
, 百拇医药
No.of embryos developed(%)
桑葚胚
囊胚
morula
blastocyst
国产新
new,Chinese-made
4
50
42(84.0)
34(68.0)a
国产旧
, 百拇医药
old,Chinese-made
6
81
35(43.2)
22(27.2)b
进口新
new,imported
4
54
52(96.3)
39(72.2)a
进口旧
, 百拇医药
old,imported
6
76
51(67.1)
35(46.1)c
注：具不同上标者间差异显著(P<0.05)
Note:the difference among values with different supercripts is significant (P<0.05)*国家教委跨世纪优秀人才基金资助课题(94年度)和黑龙江省杰出青年基金资助课题(No.95004)
△ Department of Biotechnology, North-East Agricultural University, Harbin 150030, China
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bavister B D.Role of ovidutal secretions in embryonic growth in vivo and in vitros. Theriogenology, 1988,29(1):143
2 Chatot C L, Ziomek C A, Bavster BD, et al. An improved culture medium supports development of random breed 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil, 1989,86(2):679
3 Gregory T E, Lawitts J A, Virginia E P. Differential growth of the mouse preimplantation embryo in chemically defined media. Biol Reprod, 1994,50(5):1027
4 William R B, Sander S S. Quality control in the in vitro fertilization laboratory. Theriogenology,1990,33(1):23
收稿1998-07 修回1998-09, 百拇医药
单位：东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030
关键词：1-细胞胚胎；培养系统；小鼠
解剖学报990423 【摘要】 目的 检验培养基(Whitten、CZB、SOM和KSOM)、培养器皿(进口、国产新旧平皿)与配制培养基的水质对小鼠胚胎体外发育的影响。 方法 采用微滴培养法培养昆明种小白鼠1-细胞胚胎，以胚胎发育到囊胚的比例为判断培养效果的标准。 结果 Whitten、CZB、SOM和KSOM培养基中2-细胞发育率分别为100%、100%、100%和98.6%，而囊胚发育率却分别为0%、78.3%、4.8%和9.5%；用三蒸水、五蒸水和去离子水配制的CZB培养基，培养囊胚发育率分别为40.8%、54.1%和52.4%；国产和进口新平皿的囊胚发育率分别为68.0%和72.2%；国产和进口旧平皿的培养囊胚发育率为27.2%和46.1%。 结论 昆明小白鼠早期胚胎存在体外发育阻断现象；CZB培养基培养昆明小白鼠早期胚胎效果最好；用三蒸水、五蒸水和去离子水配制的CZB培养基培养结果无显著差别；进口和国产新平皿的培养效果相近，但再次使用时培养效果显著下降。
, 百拇医药
STUDIES ON THE CONDITIONS FOR THE CULTURE OF
ONE-CELL MOUSE EMBRYOS
Liu Zhonghua, Tan Jinghe△, He Guixin
(Department of Biotechnology, North-East Agricultural University, Harbin)
【Abstract】 Objective To study the effects of culture media, types of culture dish and types of water used for preparation of media on the in vitro development of one-cell embryos in the mice of Kunming breed. Method One-cell mouse embryos collected from the oviduct of the superovulated mice were cultured in microdrops of medium and the percentage of embryos developed to blastocyst stage was used as evaluation criteria. Results (1)When one-cell mouse embryos were cultured in the Whitten's, CZB, SOM and KSOM media, the cleavage percentages were 100%,100%,100% and 98.6%, respectively, and the blastocyst percentages were 0%, 78.3%, 4.8% and 9.5%, respectively. (2)The blastocyst percentages obtained from the CZB media prepared from the triple-distilled, fivefold-distilled and deionized water were 40.8%, 54.1% and 52.4%, respectively. (3)The blastocyst percentages produced from the Chinese-made and the imported culture dishes were 68.0% and 72.2%, respectively, but those obtained when the dishes were used for the second time were decreased significantly (being only 27.2% and 46.1%, respectively). Conclusions There existed a development block during the in vitro development of the mouse embryos of the Kunming breed. Among the media tested CZB was the best in supporting the development of one-cell mouse embryos to blastocyst stage. No significant difference was found among the CZB media prepared from the triple-distilled, fivefold-distilled and deionized water in blastocyst percentages. Both the Chinese-made and the imported culture dishes produced good results of embryo development when used for the first time but the blastocyst percentages decreased significantly when the culture dishes were washed and used for the second time.
, 百拇医药
【Key words】 One-cell embryo; Culture system; Mouse
胚胎体外培养是胚胎工程研究的重要基础条件。因此，建立稳定、可靠的哺乳动物胚胎体外培养系统已成为当前这一领域的重要研究课题之一。在体外培养哺乳动物早期胚胎时，几乎都会不同程度的发生体外发育阻断(in vitro block of develo-pment)现象[1]。采用体细胞与胚胎共同培养和改进培养基成分，以形成可克服体外发育阻断的化学成分明确培养基，是当前人们试图解决这一难题的两个主要方向，而化学成分明确培养基(chemically defined medium)培养胚胎，这种方法以其操作简便，有利于发育阻断机理研究而尤为人们重视。CZB，SOM和KSOM培养基就是最近出现的几种效果较好的成分明确培养基[2，3]。除培养基外，影响胚胎培养效果的因素还很多，其中培养器皿与配制培养基的水质是两个不容忽视的因素。William研究发现不同厂家，不同批次的培养器皿以及不同的清洗、灭菌和包装方法可明显影响小鼠胚胎体外发育效果[4]。因此，本次实验采用微滴培养法对昆明小白鼠1-细胞胚胎进行培养并依据胚胎发育到囊胚的比例为判断标准，对培养基、培养器皿及配制培养基的水质进行了研究，以期为建立完善的哺乳动物早期胚胎培养系统提供一些参考。
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材料和方法
控光饲养(14h光照，10h黑暗)的8～12周龄昆明白雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10 IU/只，间隔48h腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 IU/只，进行超排处理。注hCG后与公鼠合笼，次日见阴道栓者于注射hCG后22～24h断颈椎处死，于输卵管中冲取1-细胞胚胎，用300 IU/ml的透明质酸酶去除卵丘细胞后用于实验。
CZB培养基，SOM培养基，KSOM培养基，Whitten培养基以及M2按文献[2，3]所载配方配制。
去离子水采用SYBROY BARNSTEAD(美国产)纯水器制取；三蒸水用自动双重纯水蒸馏器(上海玻璃仪器一厂生产)蒸馏制得；五蒸水为三蒸水再次经过自动双重纯水蒸馏器蒸馏制得。3种纯水经电导仪测量其电导值分别为2.1μΩ-1、2.6μΩ-1和1.8μΩ-1。
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进口平皿为美国COSTAR公司产，规格为35×10 mm；国产平皿购自安普公司，规格也为35×10 mm。培养用过的新平皿回收，用脱脂棉在碱液中擦洗干净，清水冲洗，干燥，4%盐酸浸泡24h，清水冲净，蒸馏水冲洗至少3遍，纯水冲洗2遍后烘干。用前紫外线灭菌30min。
用微量移液器吸取培养液在平皿中制成50μl的培养滴，覆盖石蜡油置CO2培养箱中平衡2h后，将待培养胚胎移入微滴，于5%CO2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，每滴中培养胚胎10个左右。
实验所得数据均采用百分数t检验进行统计学处理。
结果和讨论
实验用国产新平皿做为培养器皿，比较了用去离子水配制的Whitten、CZB、SOM和KSOM培养基培养体内取出的小鼠1-细胞胚胎的效果，结果见表1。各种培养基中2-细胞发育率几乎都是百分之百；培养48h后,Whitten、CZB、SOM和KSOM培养基中4-细胞发育率分别为7.4%、90.0%、72.4%和63.5%。Whitten培养基中的发育率极显著低于其他3组；培养96h，Whitten、CZB、SOM和KSOM中囊胚发育率分别为0、78.3%、11.8%和9.5%，CZB培养基中囊胚发育率极显著高于其他3种培养基。由此可以看出，在昆明小白鼠早期胚胎的培养中确实存在发育阻断现象，而CZB培养基可以成功的克服昆明小白鼠胚胎早期的体外发育阻断。尽管Gregory[3]用SOM和KSOM两种培养基培养小鼠早期胚胎获得了很高的囊胚率，但在我们的实验中虽然通过2-细胞阻断的比例较高，却未能成功维持胚胎由4-细胞到囊胚期的发育。
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表1 不同培养基培养小鼠1-细胞胚胎发育结果
Table 1 In vitro development of 1-cell mouse embryos in different culture media 培养基
culture
media
重复次数
No.of
replicates
培养胚胎数
No.of embryos
cultured
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发育胚胎数
No.of embryos developed(%)
2-细胞
4-细胞
囊胚
2-c
4-c
blastocyst
Whitten
5
54
54(100)
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4(7.4)a
0(0)a
CZB
5
60
60(100)
54(90)b
47(78.3)b
SOM
5
76
76(100)
, http://www.100md.com
55(72.4)c
9(4.8)c
KSOM
5
74
73(98.6)
47(63.5)c
7(9.5)c
注：同一列中具不同上标者差异显著(P<0.05).
Note:the difference among values with different superscripts is significant(P<0.05).
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配制培养基所使用的水质不同也往往会造成培养效果的差异。实验采用国产新平皿做为培养器皿，用3种不同纯水配制的CZB培养基培养小鼠1-细胞胚胎，结果见表2。三蒸水，五蒸水和去离子水配制的CZB培养基中4-细胞发育率分别为73.2%、71.6%和77.85%，三者无显著差异；囊胚发育率分别为40.8%、54.1%和42.4%，三者差异也未达显著水平。本次实验所用的3种纯水全部是由同一种来源的一蒸水制得。三蒸水和五蒸水是单纯靠蒸馏次数的增加制得的，而去离子水是通过离子交换，反渗透压作用以及超滤最终获得的。由于单纯蒸馏并不能除去所有离子，所以理论上应该是去离子水配制的培养基培养效果要好一些。但事实并非如此，这可能是由于所使用的一蒸水水质较好，通过单纯蒸馏就达到了纯化水质的目的。
表2 不同水质对小鼠1-细胞胚胎发育的影响
Table 2 In vitro development of 1-cell mouse embryos in CZB made from different types of water 水质
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types of water
重复次数
No.of
replicates
培养胚胎数
No.of embryos
cultured
发育胚胎数
No.of embryos
developed(%)
桑葚胚
囊胚
, 百拇医药
morula
blastocyst
三蒸水
triple
distrilled
6
71
52(73.2)
29(40.8)
五蒸水
five-times
distrilled
, 百拇医药
6
74
53(71.6)
40(54.1)
去离子水
deionized
water
5
63
49(77.8)
33(52.4)
不同来源的培养皿，以及再次使用前的清洗方法都会造成胚胎培养效果的差异。实验采用去离子水配制的CZB培养基，分别用进口新平皿和旧平皿及国产新平皿和旧平皿做为培养器皿进行小鼠1-细胞胚胎培养，结果见表3。在上述4种平皿中培养的4-细胞发育率别为96.3%、67.1%、84.0%和43.2%；囊胚发育率分别为72.2%、46.1%、68.0%和27.2%。进口新平皿与国产新平皿的4-细胞发育率及囊胚发育率均无显著差异；两者与旧平皿间的4-细胞发育率和囊胚发育率均具显著差异；而进口旧平皿的4-细胞发育率和囊胚发育率又均显著高于国产旧平皿的发育率。其原因，我们认为有可能是由于现用的平皿清洗方法不够完善，致使平皿上的一些有害因子未能清除掉，或者清洗过程本身又使平皿沾染上了一些对细胞有害的因子，从而造成囊胚发育率下降。因此，进行胚胎培养一次性使用国产平皿是较为明智的。表3 不同平皿对小鼠1-细胞胚胎发育的影响
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Table 3 Effect of culture dish on in vitro development of 1-cell mouse embryos 平皿类型
types of
culture dish
重复次数
No.of
replicates
培养胚胎数
No.of embryos
cultured
发育胚胎数
, 百拇医药
No.of embryos developed(%)
桑葚胚
囊胚
morula
blastocyst
国产新
new,Chinese-made
4
50
42(84.0)
34(68.0)a
国产旧
, 百拇医药
old,Chinese-made
6
81
35(43.2)
22(27.2)b
进口新
new,imported
4
54
52(96.3)
39(72.2)a
进口旧
, 百拇医药
old,imported
6
76
51(67.1)
35(46.1)c
注：具不同上标者间差异显著(P<0.05)
Note:the difference among values with different supercripts is significant (P<0.05)*国家教委跨世纪优秀人才基金资助课题(94年度)和黑龙江省杰出青年基金资助课题(No.95004)
△ Department of Biotechnology, North-East Agricultural University, Harbin 150030, China
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参考文献
1 Bavister B D.Role of ovidutal secretions in embryonic growth in vivo and in vitros. Theriogenology, 1988,29(1):143
2 Chatot C L, Ziomek C A, Bavster BD, et al. An improved culture medium supports development of random breed 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil, 1989,86(2):679
3 Gregory T E, Lawitts J A, Virginia E P. Differential growth of the mouse preimplantation embryo in chemically defined media. Biol Reprod, 1994,50(5):1027
4 William R B, Sander S S. Quality control in the in vitro fertilization laboratory. Theriogenology,1990,33(1):23
收稿1998-07 修回1998-09, 百拇医药