蛋白激酶C在培养神经元突起生长中的作用
作者：杨萍 殷玉芹 李振强 宋林 刘光久
单位：杨萍 殷玉芹 李振强 宋林 刘光久(第三军医大学解剖学教研室，重庆 400038)
关键词：
解剖学报000226
[中图分类号]Q55 [文献标识码]D
[文章编号]0529-1356(2000)02-107
为探讨蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)在神经再生中的作用，本研究在对培养神经元生长规律与PKC活性作相关分析的基础上，观察PKC活性改变对原代培养的脊髓前角神经元突起生长状态的影响。以5-氟尿嘧啶(5-Fu)抑制有丝分裂代替免疫淘汰法提高神经元的纯度进行胎鼠脊髓前角神经元的原代培养。取孕14d左右的SD大鼠，行无菌操作取出胎鼠，于脑干以下平面取出脊髓，经胰酶消化吸管吹打，过200目钢网后，滤过液在1ml 4%牛血清白蛋白中300g离心10min，沉淀经L15培养基溶解后，于1ml 6.8% Metrizamide中500g离心15min，得到两液面间宽约5mm的浅色带，吸出此浅色带液体，再于1ml 4%牛血清白蛋白中，300g离心10min，所得沉淀溶于L15种植培养基，即为脊髓前角神经元的单细胞悬液。用台盼蓝拒染法测定所得细胞活性后，调整细胞悬液的浓度为4.5×105/ml，将之种植于经多聚赖氨酸和Laminin预处理过的内置盖玻片的24孔培养板内，置37℃、5%CO2、95%湿度的CO2孵箱内培养，24h后换维持培养基，48h后加入12.5mg/L 5-Fu作用24h吸出。换上新鲜的维持培养基和分别含PKC激动剂PMA 1nmol/L、PKC抑制剂GF 109203X 1μmol/L的维持培养基培养，以及施加GF109203X作用30min后，再施加PMA处理各96h，观察神经突起生长状况。结果发现，正常对照组细胞接种24h，部分开始长出突起，96h后整个视野内突起众横交错，5～7d，神经突起生长最快，突起粗大，7d后开始萎缩。当施加PMA激活PKC后，神经突起生长加快，培养的第5d和第7d时的突起长度均较正常对照组长(P<0.05)，PKC基础活性变化与神经突起延长之间呈正相关关系(r=0.95，P<0.01)，而且培养神经元的突起均呈一定方向性生长，它们互相平行，整个视野神经突起排列整齐，与对照组突起生长方式明显不同。施加GF 109203X抑制PKC的活性后，神经突起的生长受到一定的限制，培养第7d时神经突起的长度明显短于对照组和PMA组(P<0.05)，突起生长无方向性。施加GF109203X作用30min后，再施加PMA处理，神经突起生长仍然受到一定的抑制，在培养的第7d，其长度明显短于对照组和PMA作用组(P<0.05)，而且神经突起的生长亦无方向性，此时的生长状态与单独使用GF 109203X处理96h时相似。实验结果表明，PKC在培养脊髓神经元突起生长中起支持调控作用，其活性增加不仅可促进培养神经元突起的生长，也可改变其生长的方式，使突起生长呈一定方向性。
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39570373)
【收稿日期】1999-11-30, http://www.100md.com
单位：杨萍 殷玉芹 李振强 宋林 刘光久(第三军医大学解剖学教研室，重庆 400038)
关键词：
解剖学报000226
[中图分类号]Q55 [文献标识码]D
[文章编号]0529-1356(2000)02-107
为探讨蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)在神经再生中的作用，本研究在对培养神经元生长规律与PKC活性作相关分析的基础上，观察PKC活性改变对原代培养的脊髓前角神经元突起生长状态的影响。以5-氟尿嘧啶(5-Fu)抑制有丝分裂代替免疫淘汰法提高神经元的纯度进行胎鼠脊髓前角神经元的原代培养。取孕14d左右的SD大鼠，行无菌操作取出胎鼠，于脑干以下平面取出脊髓，经胰酶消化吸管吹打，过200目钢网后，滤过液在1ml 4%牛血清白蛋白中300g离心10min，沉淀经L15培养基溶解后，于1ml 6.8% Metrizamide中500g离心15min，得到两液面间宽约5mm的浅色带，吸出此浅色带液体，再于1ml 4%牛血清白蛋白中，300g离心10min，所得沉淀溶于L15种植培养基，即为脊髓前角神经元的单细胞悬液。用台盼蓝拒染法测定所得细胞活性后，调整细胞悬液的浓度为4.5×105/ml，将之种植于经多聚赖氨酸和Laminin预处理过的内置盖玻片的24孔培养板内，置37℃、5%CO2、95%湿度的CO2孵箱内培养，24h后换维持培养基，48h后加入12.5mg/L 5-Fu作用24h吸出。换上新鲜的维持培养基和分别含PKC激动剂PMA 1nmol/L、PKC抑制剂GF 109203X 1μmol/L的维持培养基培养，以及施加GF109203X作用30min后，再施加PMA处理各96h，观察神经突起生长状况。结果发现，正常对照组细胞接种24h，部分开始长出突起，96h后整个视野内突起众横交错，5～7d，神经突起生长最快，突起粗大，7d后开始萎缩。当施加PMA激活PKC后，神经突起生长加快，培养的第5d和第7d时的突起长度均较正常对照组长(P<0.05)，PKC基础活性变化与神经突起延长之间呈正相关关系(r=0.95，P<0.01)，而且培养神经元的突起均呈一定方向性生长，它们互相平行，整个视野神经突起排列整齐，与对照组突起生长方式明显不同。施加GF 109203X抑制PKC的活性后，神经突起的生长受到一定的限制，培养第7d时神经突起的长度明显短于对照组和PMA组(P<0.05)，突起生长无方向性。施加GF109203X作用30min后，再施加PMA处理，神经突起生长仍然受到一定的抑制，在培养的第7d，其长度明显短于对照组和PMA作用组(P<0.05)，而且神经突起的生长亦无方向性，此时的生长状态与单独使用GF 109203X处理96h时相似。实验结果表明，PKC在培养脊髓神经元突起生长中起支持调控作用，其活性增加不仅可促进培养神经元突起的生长，也可改变其生长的方式，使突起生长呈一定方向性。
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39570373)
【收稿日期】1999-11-30, http://www.100md.com