人胎盘脱氢表雄酮的免疫组织化学研究
作者：蒲若蕾 孙岚 黄威权吕葆真
单位：蒲若蕾 孙岚 黄威权 吕葆真(第四军医大学基础部组织学胚胎学教研室，西安 710032)
关键词：脱氢表雄酮；定量；免疫组织化学；人胎盘绒毛
解剖学报000219 【摘要】 目的 观察脱氢表雄酮(DHEA)在人胎盘的定位及其含量的周龄变化。 方法 用免疫组织化学及定量方法。 结果 人胎盘两层滋养层细胞和基质细胞均呈DHEA免疫反应性，反应物质分布于胞质，胞核无免疫反应。在人胎盘绒毛的不同发育阶段中，DHEA的相对含量随周龄的增加而增加。 结论 DHEA对胚胎及胎盘的发育可能具有重要的调节功能。
【中图分类号】 R321.4 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-171
, http://www.100md.com
IMMUNOHISTOCHEMICAL LOCALIZATION OF DEHYDRO EPIANDROSTERONE IN DEVELOPING HUMAN PLACENTA
PU Ruolei, SUN Lan, HUANG Weiquan, LU Baozhen
(Department of Histology and Embryology, the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)
【Abstract】 Objective To study the localization and the weekaged change of dehyd
roepiandrosterone(DHEA) in human placenta. Methods Immunohistochemistry and quantit
, 百拇医药
ation were used in the experiment. Results The syncytiotrophoblast,cytotrophoblast and stromal cells were all appeared DHEA immunoreactivity. The immunoreactivematerial was distributed in cytoplasm with immunonegative nucleus. The relative amounts of DHEA rose with increasing week ages of gestation. Conclusions DHEA might implicate in the development of the placenta and fetus.
【Key words】 Dehydroepiandrosterone; Quantitation; Immunohistochemistry; Human placenta
, 百拇医药
脱氢表雄酮(DHEA)是由肾上腺皮质分泌的一类重要的甾体类激素前体，在人体含量最高，分布最广泛[1]，具有重要的生物学效应[2]，胎儿体内的DHEA是胎儿生成性激素的前体物质[3]，同时它自身也具有参与调节胚胎大脑皮质神经元生长的生物学效应[4]。但是，至今未见有关它在妊娠期胎盘中含量变化规律的研究报道。本实验应用免疫组织化学ABC法，观察了DHEA在人胎盘绒毛的定位，同时结合图像分析技术，检测了不同发育阶段人胎盘绒毛上皮DHEA相对含量的变化，为DHEA对胎盘的功能意义研究提供形态学依据。
材料和方法
1. 试剂和组织材料
兔抗DHEA抗体为本室自制[5]，ABC药盒为武汉博士德公司产品。
第6、7、8、9、10、16、24、40周人胎盘绒毛各5例，由我校唐都医院妇产科提供。分别取小块新鲜的胎盘绒毛，用4℃生理盐水洗去血液，入4%多聚甲醛固定液固定24h，按常规石蜡包埋法，以熔点50～52℃的石蜡将各组标本分别包埋在同一蜡块内，制成4μm厚的连续切片，并裱贴在同一载玻片上，于37℃恒温箱烤干备用。
, 百拇医药
2. 免疫组织化学
石蜡切片经脱蜡水化后入PBS(pH7.4)，经甲醇H2O2室温孵育20min，除去内源性过氧化物酶活性，然后按免疫组织化学ABC法进行反应。兔抗DHEA抗体稀释度为1∶1 000，在4℃冰箱内孵育时间为24h，生物素标记的羊抗兔IgG抗体的稀释度为1∶200，ABC复合物的稀释度为1∶100，分别在室温下孵育1h和30min。对照实验设以下两组：(1)用正常兔血清替代DHEA抗血清孵育；(2)DHEA抗血清(1∶1 000)经过量DHEABSA(1g/L)复合物预先吸收后，作为第一抗体孵育。
3. DHEA免疫反应产物的定量分析
用Q500图像分析系统(美国Leica公司)对不同发育阶段人胎盘绒毛的DHEA免疫反应产物的相对含量进行测定，在光镜下(×100)每例随机取样测5个绒毛断面，10个单位面积，每组共测50个单位面积，计算出每个单位面积的DHEA免疫反应产物的相对含量，用组间t检验方法作统计学处理。
, 百拇医药
结 果
胎盘绒毛DHEA免疫反应性细胞为深棕色，背底着色淡或不着色，对比鲜明，阳性细胞较易辨认。两组对照实验均为阴性反应(图1)。绒毛的合体滋养层、细胞滋养层和基质细胞均呈DHEA免疫反应性，免疫染色物质分布于胞质内，胞核无免疫反应。在妊娠早期(孕6周)，两层滋养层细胞已出现免疫反应，强度较弱，基质细胞反应比滋养层细胞稍强(图2)。此后DHEA免疫染色逐渐增强，免疫反应物质充满胞质(图3，4)。
图1 正常兔血清替代DHEA抗血清孵育后无免疫反应 ×100
, 百拇医药
图2 妊娠第6周人胎盘绒毛上皮两层滋养层细胞及基质细胞呈DHEA免疫反应性 ×100
图3 妊娠第16周人胎盘绒毛上皮两层滋养层细胞及基质细胞呈DHEA免疫反应性，反应较第6周强 ×100
图4 妊娠第40周人胎盘绒毛上皮两层滋养层细胞呈DHEA免疫反应性，反应较第16周强 ×100
Fig.1 The negative control shows the negative reaction. ×100
Fig.2 The cytotrophoblasts,syncytiotrophoblasts and stromal cells in 6week placenta, showing DHEA immunoreactivity. ×100
, 百拇医药 Fig.3 The cytotrophoblasts,syncytiotrophoblasts and stromal cells in 16week placenta, showing DHEA stronger immunoreactivity than that in 6week placenta. ×100
Fig.4 The cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts in 6week placenta, showing DHEA stronger immunoreactivity than that in 16week placenta. ×100
不同发育阶段人胎盘绒毛上皮中DHEA免疫染色图像分析结果见附表。从表中可见，DHEA的相对含量随妊娠周龄的增加而增加。在第7、8、10、24、40周龄组间(附表)，DHEA的相对含量存在非常显著性差异(P<0.01)。图像分析结果与观察结果基本一致。
, 百拇医药
附表 不同周龄人胎盘绒毛DHEA含量的变化
Table 1 Changes of the content of DHEA immunoreactive
product in developing chorionic villi of human placenta 组别
group
妊娠周龄
gestational
age(weeks)
检测例数
number of
cases
, http://www.100md.com
检测单位
面积数
number of
unit area
DHEA相对含量/
单位面积
relative amount of
DHEA/unit area
±
Ⅰ
6
, 百拇医药
5
50
0.0270±0.0065
Ⅱ
7
5
50
0.0461±0.0083*
Ⅲ
8
5
50
0.0862±0.0076*
, 百拇医药
Ⅳ
9
5
50
0.1080±0.0091
Ⅴ
10
5
50
0.1003±0.0051*
Ⅵ
16
5
, http://www.100md.com
50
0.1368±0.0083
Ⅶ
24
5
50
0.1447±0.0116*
Ⅷ
40
5
50
0.1815±0.0064*
, http://www.100md.com
*P<0.01，*周龄组间相比
*P<0.01，as comparison between * groups of ages in weeks
讨 论
有报道，人胎盘有DHEA的代谢酶，如DHEA硫酸转移酶[6]和羟基类固醇脱氢酶[7]等，也有作者用放射免疫方法，检测到人胎盘含有DHEA[1]。我们先前的研究发现，人早期(6～8周龄)胎盘绒毛的合体滋养层、细胞滋养层细胞和基质细胞均呈DHEA免疫反应性[5]，本实验进一步观察到从6周龄到终末胎盘的绒毛均呈DHEA免疫反应性，免疫反应性物质定位于绒毛的细胞、合体滋养层及基质细胞的胞质内，说明在整个妊娠期间，人胎盘绒毛以上3种细胞是胎盘DHEA代谢及转化的主要场所。
胎盘是产生雌激素和孕酮的主要器官，雌激素和孕酮又是维持妊娠的主要生殖激素。有报道，妊娠3个月后，人胎盘开始具有合成上述两种激素的功能，尔后，随妊娠周龄的增加，其合成该两种激素的量也逐渐增加，所以在妊娠期间，母血中这两种激素的水平随妊娠周龄的增加而增加，分娩时达到高峰[8]。DHEA是一类重要的甾体类激素，它是性激素合成的前体物质。本实验发现，人胎盘绒毛滋养层细胞DHEA的相对含量随妊娠周龄的增加而增加，这与以上报道一致，也说明胎盘绒毛滋养层细胞对DHEA代谢转化为雌激素和孕酮的能力随妊娠周龄的增加而逐渐增强。肽类激素和甾类激素间存在相互调节的关系，如胰岛素样生长因子(IGF)和ACTH均有促进胚胎皮质分泌DHEA的功能[9]，DHEA[5]和IGF[10]均存在于胎盘内，它们在胎盘内是否也存在相互调节关系，有待探讨。
, 百拇医药
有报道，DHEA具有促进胎儿大脑皮层神经元发育的功能[4]，DHEA是否也能进入胎血循环参与胎儿大脑皮层神经元发育的调节，这是个问题，值得探讨。
作者简介：蒲若蕾(1970—)，女(汉族)，陕西省西安市人，硕士，讲师
参考文献
[1]Barker EV, Hume R, Hallase A, et al. Dehydroepiandrosteron sulfurtransferase in the developing human fetus:quantitative biochemical and immunological characterization of the hepatic, renal and adrenal enzymes[J]. Endocrinology, 1994,134(2):982989.
, 百拇医药
[2]Barbara A，张志安.脱氢表雄酮逆转免疫衰老——荷尔蒙治疗增强重组乙肝疫苗的免疫效能[J].国外医学免疫分册，1994，17(5)：275～276.
[3]Forbes KJ, Hagen M, Glatt H, et al. Human fetal adrenal hydroxysteroid sulfurtransferase:cDNA cloning, stable expression in V79 cells and functional characterization of the expressed enzyme[J]. Mol Cell endocrinol, 1995， 112(1):5360.
[4]Compagnone NA, Mellon SH. Dehydroepiandrosterone:a potential signalling molecule for neocortical organization during development[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998，95(8):46784683.
, 百拇医药
[5]孙岚，黄威权，张崇理.兔脱氢表雄酮抗体的鉴定及DHEA在人胎盘定位的研究.解剖学杂志，1999，22(6)：518～520.
[6]Haning RV, Hackett RJ, Canick JA. Steroid sulfurtransferase in human ovary and placenta: enzyme kinesics and phosphate inhibition[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 1992,11(2):161165.
[7]Geldof AA, Dijkjstra I, Nevling Dw, et al. Inhibition of 3 batahydroxy steroiddehydrogenase:an approach for prostate cancer treatment[J]. Anticancer Res, 1995,15(4):13491354.
, 百拇医药
[8]陈宜张，臧益民，王复周，等.医学生理学[M].上海：科学技术出版社，1992：352～353.
[9]Mesiano S, Katz SL, Lee JY, et al. Insulinlike growth factors augment steroid production and expression of steroidogenic enzymes in human fetal adrenal cortical cells:implications for adrenal androgen regulation[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1997,82(5):13901396.
[10]Fant M, Munro H, Moses AC. An autocrine/paracrine role for insulinlike growth factors in the regulation of human placental growth[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1986,63(2):499505.
【收稿日期】1999-02-02
【修稿日期】1999-05-14, 百拇医药
单位：蒲若蕾 孙岚 黄威权 吕葆真(第四军医大学基础部组织学胚胎学教研室，西安 710032)
关键词：脱氢表雄酮；定量；免疫组织化学；人胎盘绒毛
解剖学报000219 【摘要】 目的 观察脱氢表雄酮(DHEA)在人胎盘的定位及其含量的周龄变化。 方法 用免疫组织化学及定量方法。 结果 人胎盘两层滋养层细胞和基质细胞均呈DHEA免疫反应性，反应物质分布于胞质，胞核无免疫反应。在人胎盘绒毛的不同发育阶段中，DHEA的相对含量随周龄的增加而增加。 结论 DHEA对胚胎及胎盘的发育可能具有重要的调节功能。
【中图分类号】 R321.4 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-171
, http://www.100md.com
IMMUNOHISTOCHEMICAL LOCALIZATION OF DEHYDRO EPIANDROSTERONE IN DEVELOPING HUMAN PLACENTA
PU Ruolei, SUN Lan, HUANG Weiquan, LU Baozhen
(Department of Histology and Embryology, the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)
【Abstract】 Objective To study the localization and the weekaged change of dehyd
roepiandrosterone(DHEA) in human placenta. Methods Immunohistochemistry and quantit
, 百拇医药
ation were used in the experiment. Results The syncytiotrophoblast,cytotrophoblast and stromal cells were all appeared DHEA immunoreactivity. The immunoreactivematerial was distributed in cytoplasm with immunonegative nucleus. The relative amounts of DHEA rose with increasing week ages of gestation. Conclusions DHEA might implicate in the development of the placenta and fetus.
【Key words】 Dehydroepiandrosterone; Quantitation; Immunohistochemistry; Human placenta
, 百拇医药
脱氢表雄酮(DHEA)是由肾上腺皮质分泌的一类重要的甾体类激素前体，在人体含量最高，分布最广泛[1]，具有重要的生物学效应[2]，胎儿体内的DHEA是胎儿生成性激素的前体物质[3]，同时它自身也具有参与调节胚胎大脑皮质神经元生长的生物学效应[4]。但是，至今未见有关它在妊娠期胎盘中含量变化规律的研究报道。本实验应用免疫组织化学ABC法，观察了DHEA在人胎盘绒毛的定位，同时结合图像分析技术，检测了不同发育阶段人胎盘绒毛上皮DHEA相对含量的变化，为DHEA对胎盘的功能意义研究提供形态学依据。
材料和方法
1. 试剂和组织材料
兔抗DHEA抗体为本室自制[5]，ABC药盒为武汉博士德公司产品。
第6、7、8、9、10、16、24、40周人胎盘绒毛各5例，由我校唐都医院妇产科提供。分别取小块新鲜的胎盘绒毛，用4℃生理盐水洗去血液，入4%多聚甲醛固定液固定24h，按常规石蜡包埋法，以熔点50～52℃的石蜡将各组标本分别包埋在同一蜡块内，制成4μm厚的连续切片，并裱贴在同一载玻片上，于37℃恒温箱烤干备用。
, 百拇医药
2. 免疫组织化学
石蜡切片经脱蜡水化后入PBS(pH7.4)，经甲醇H2O2室温孵育20min，除去内源性过氧化物酶活性，然后按免疫组织化学ABC法进行反应。兔抗DHEA抗体稀释度为1∶1 000，在4℃冰箱内孵育时间为24h，生物素标记的羊抗兔IgG抗体的稀释度为1∶200，ABC复合物的稀释度为1∶100，分别在室温下孵育1h和30min。对照实验设以下两组：(1)用正常兔血清替代DHEA抗血清孵育；(2)DHEA抗血清(1∶1 000)经过量DHEABSA(1g/L)复合物预先吸收后，作为第一抗体孵育。
3. DHEA免疫反应产物的定量分析
用Q500图像分析系统(美国Leica公司)对不同发育阶段人胎盘绒毛的DHEA免疫反应产物的相对含量进行测定，在光镜下(×100)每例随机取样测5个绒毛断面，10个单位面积，每组共测50个单位面积，计算出每个单位面积的DHEA免疫反应产物的相对含量，用组间t检验方法作统计学处理。
, 百拇医药
结 果
胎盘绒毛DHEA免疫反应性细胞为深棕色，背底着色淡或不着色，对比鲜明，阳性细胞较易辨认。两组对照实验均为阴性反应(图1)。绒毛的合体滋养层、细胞滋养层和基质细胞均呈DHEA免疫反应性，免疫染色物质分布于胞质内，胞核无免疫反应。在妊娠早期(孕6周)，两层滋养层细胞已出现免疫反应，强度较弱，基质细胞反应比滋养层细胞稍强(图2)。此后DHEA免疫染色逐渐增强，免疫反应物质充满胞质(图3，4)。
图1 正常兔血清替代DHEA抗血清孵育后无免疫反应 ×100
, 百拇医药
图2 妊娠第6周人胎盘绒毛上皮两层滋养层细胞及基质细胞呈DHEA免疫反应性 ×100
图3 妊娠第16周人胎盘绒毛上皮两层滋养层细胞及基质细胞呈DHEA免疫反应性，反应较第6周强 ×100
图4 妊娠第40周人胎盘绒毛上皮两层滋养层细胞呈DHEA免疫反应性，反应较第16周强 ×100
Fig.1 The negative control shows the negative reaction. ×100
Fig.2 The cytotrophoblasts,syncytiotrophoblasts and stromal cells in 6week placenta, showing DHEA immunoreactivity. ×100
, 百拇医药 Fig.3 The cytotrophoblasts,syncytiotrophoblasts and stromal cells in 16week placenta, showing DHEA stronger immunoreactivity than that in 6week placenta. ×100
Fig.4 The cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts in 6week placenta, showing DHEA stronger immunoreactivity than that in 16week placenta. ×100
不同发育阶段人胎盘绒毛上皮中DHEA免疫染色图像分析结果见附表。从表中可见，DHEA的相对含量随妊娠周龄的增加而增加。在第7、8、10、24、40周龄组间(附表)，DHEA的相对含量存在非常显著性差异(P<0.01)。图像分析结果与观察结果基本一致。
, 百拇医药
附表 不同周龄人胎盘绒毛DHEA含量的变化
Table 1 Changes of the content of DHEA immunoreactive
product in developing chorionic villi of human placenta 组别
group
妊娠周龄
gestational
age(weeks)
检测例数
number of
cases
, http://www.100md.com
检测单位
面积数
number of
unit area
DHEA相对含量/
单位面积
relative amount of
DHEA/unit area
±Ⅰ
6
, 百拇医药
5
50
0.0270±0.0065
Ⅱ
7
5
50
0.0461±0.0083*
Ⅲ
8
5
50
0.0862±0.0076*
, 百拇医药
Ⅳ
9
5
50
0.1080±0.0091
Ⅴ
10
5
50
0.1003±0.0051*
Ⅵ
16
5
, http://www.100md.com
50
0.1368±0.0083
Ⅶ
24
5
50
0.1447±0.0116*
Ⅷ
40
5
50
0.1815±0.0064*
, http://www.100md.com
*P<0.01，*周龄组间相比
*P<0.01，as comparison between * groups of ages in weeks
讨 论
有报道，人胎盘有DHEA的代谢酶，如DHEA硫酸转移酶[6]和羟基类固醇脱氢酶[7]等，也有作者用放射免疫方法，检测到人胎盘含有DHEA[1]。我们先前的研究发现，人早期(6～8周龄)胎盘绒毛的合体滋养层、细胞滋养层细胞和基质细胞均呈DHEA免疫反应性[5]，本实验进一步观察到从6周龄到终末胎盘的绒毛均呈DHEA免疫反应性，免疫反应性物质定位于绒毛的细胞、合体滋养层及基质细胞的胞质内，说明在整个妊娠期间，人胎盘绒毛以上3种细胞是胎盘DHEA代谢及转化的主要场所。
胎盘是产生雌激素和孕酮的主要器官，雌激素和孕酮又是维持妊娠的主要生殖激素。有报道，妊娠3个月后，人胎盘开始具有合成上述两种激素的功能，尔后，随妊娠周龄的增加，其合成该两种激素的量也逐渐增加，所以在妊娠期间，母血中这两种激素的水平随妊娠周龄的增加而增加，分娩时达到高峰[8]。DHEA是一类重要的甾体类激素，它是性激素合成的前体物质。本实验发现，人胎盘绒毛滋养层细胞DHEA的相对含量随妊娠周龄的增加而增加，这与以上报道一致，也说明胎盘绒毛滋养层细胞对DHEA代谢转化为雌激素和孕酮的能力随妊娠周龄的增加而逐渐增强。肽类激素和甾类激素间存在相互调节的关系，如胰岛素样生长因子(IGF)和ACTH均有促进胚胎皮质分泌DHEA的功能[9]，DHEA[5]和IGF[10]均存在于胎盘内，它们在胎盘内是否也存在相互调节关系，有待探讨。
, 百拇医药
有报道，DHEA具有促进胎儿大脑皮层神经元发育的功能[4]，DHEA是否也能进入胎血循环参与胎儿大脑皮层神经元发育的调节，这是个问题，值得探讨。
作者简介：蒲若蕾(1970—)，女(汉族)，陕西省西安市人，硕士，讲师
参考文献
[1]Barker EV, Hume R, Hallase A, et al. Dehydroepiandrosteron sulfurtransferase in the developing human fetus:quantitative biochemical and immunological characterization of the hepatic, renal and adrenal enzymes[J]. Endocrinology, 1994,134(2):982989.
, 百拇医药
[2]Barbara A，张志安.脱氢表雄酮逆转免疫衰老——荷尔蒙治疗增强重组乙肝疫苗的免疫效能[J].国外医学免疫分册，1994，17(5)：275～276.
[3]Forbes KJ, Hagen M, Glatt H, et al. Human fetal adrenal hydroxysteroid sulfurtransferase:cDNA cloning, stable expression in V79 cells and functional characterization of the expressed enzyme[J]. Mol Cell endocrinol, 1995， 112(1):5360.
[4]Compagnone NA, Mellon SH. Dehydroepiandrosterone:a potential signalling molecule for neocortical organization during development[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998，95(8):46784683.
, 百拇医药
[5]孙岚，黄威权，张崇理.兔脱氢表雄酮抗体的鉴定及DHEA在人胎盘定位的研究.解剖学杂志，1999，22(6)：518～520.
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[7]Geldof AA, Dijkjstra I, Nevling Dw, et al. Inhibition of 3 batahydroxy steroiddehydrogenase:an approach for prostate cancer treatment[J]. Anticancer Res, 1995,15(4):13491354.
, 百拇医药
[8]陈宜张，臧益民，王复周，等.医学生理学[M].上海：科学技术出版社，1992：352～353.
[9]Mesiano S, Katz SL, Lee JY, et al. Insulinlike growth factors augment steroid production and expression of steroidogenic enzymes in human fetal adrenal cortical cells:implications for adrenal androgen regulation[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1997,82(5):13901396.
[10]Fant M, Munro H, Moses AC. An autocrine/paracrine role for insulinlike growth factors in the regulation of human placental growth[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1986,63(2):499505.
【收稿日期】1999-02-02
【修稿日期】1999-05-14, 百拇医药