煤尘致肺泡巨噬细胞氧化损伤的细胞化学研究
作者：高俊玲 田艳霞 张宇新 崔建忠 孙树勋
单位：高俊玲 田艳霞 张宇新 孙树勋(华北煤炭医学院组织学胚胎学教研室，)；崔建忠(唐山工人医院神经外科，唐山 063000)
关键词：肺泡巨噬细胞；煤尘；自由基；损伤；细胞化学
解剖学报000216 【摘要】 目的 探讨煤尘致肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)，损伤过程中是否存在着氧化损伤机制。 方法 应用细胞化学法显示煤尘作用于AM产生的
和H2O2、并做定量测定及相关分析，以Mg2+-ATPase组织化学染色作为检测膜变化的指标。 结果 煤尘致AM产生的氧自由基较矽尘的少，同时细胞的形态结构和膜酶的损伤程度也较低。 结论 (1)应用抗氧化剂可减弱煤尘对AM所致的损伤，进而预防肺成纤维细胞增殖；(2)与矽尘相比，煤尘致AM氧化损伤的程度较弱；(3)形态学方法定位显示自由基较之自由基总体测定技术更能直观、具体地阐明细胞损伤的实际状况。探讨煤尘致肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)，损伤过程中是否存在着氧化损伤机制。
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【中图分类号】 Q24；R135.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-160
IN VITRO CYTOCHEMICAL STUDIES OF FREE RADICAL INJURY
ON RAT ALVEOLAR MACROPHAGES BY COAL DUSTS
GAO Jun-ling, TIAN Yan-xia, ZHANG Yu-xin,SUN Shu-xun
(Department of Histology and Embryology,North China Coal Medical College,)
CUI Jian-zhong
, 百拇医药
(Department of Nerosurgery,Tangshan Gongren Hospital,Tangshan 063000,China)
【Abstract】 Objective To analyze the relationship between the oxygen free radicals and morphological damage of alveolar macrophages(AMs)caused by coal dusts. Methods Using morphological technique to demonstrate the oxygen radicals.Moreover
,the cytochemical reaction slides ofand Mg2+-ATPase were analyzed quantitatively by image analyzer,and the linear correlation tendency between the quantitative results of the and Mg2+-ATPase reaction was made. Results Like SiO2,a toxic mineral particle,exposure of AMs to coal dusts also resulted in production of and H2O2.They were localized on the plasma membrane,the membrane of the phogosome and/or pinosome,and the lysosomal membrane.There is a close relationship between AMs morphological and enzymatic damage and the production of oxygen free radicals. Conclusions (1)We can give antioxidant to the patients to terminal oxygenic damage in their bodies,further guard against proliferation of fibroblasts.(2)The degree of oxygen damage induced by coal dusts is lower than that by silica.(3)In situ evaluation of and H2O2 oxygen free radicals is superior to the other techniques in a sense.It is more convenient to directly observe the real situation of the oxidative damage on cells so as to clarify the relationship between the production of free radical and the damage degree on cells.
, 百拇医药
【Key words】 Alveolar macrophage; Coal dusts; Free radical; Damage; Cytochemistry
煤尘致AM损伤是煤工尘肺发病机制的重要环节。煤尘致AM受损机制众说纷纭。据报道，煤尘在劈裂时产生大量自由基[1～3]，大块肺纤维化的煤工尘肺患者体内抗氧化物质降低[4]。然而，煤尘能否致AM发生氧化损伤的报道尚少，尤未见原位显示氧自由基的研究报道。本研究用原位显示自由基的方法探讨煤尘致AM损伤过程中是否存在氧化损伤机制。
材料和方法
1. 肺泡巨噬细胞的获取与纯化
成年雄性Wistar大鼠40只，体重200～230g，以25%乌拉坦1ml/100g体重腹腔注射，深度麻醉，股动脉放血致死。行支气管肺泡灌洗术[5]，灌洗液经500g离心20min，弃上清，得沉淀细胞。以贴壁法进行富集[6]。台盼蓝排斥实验，AM存活率达99.5%以上。以RPMI-1640培养液调整AM浓度为1×105AM/ml备用。
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2. 粉尘制备
取开滦煤矿原煤(由中国煤炭研究院唐山分院提供)，经玛瑙研钵研磨，分液漏斗分离，收集悬浮部分，自然晾干，95%以上颗粒直径≤5μm。矽尘采用商品SiO2(由本院中心实验室馈赠)，含游离SiO299%，粒径2μm以下占92.3%。
3. 实验分组和标本制备
实验分3组：(1)实验组：AM+煤尘；(2)正常对照组：AM+生理盐水；(3)阳性对照组：AM+矽尘。煤尘和矽尘的终浓度均为200mg/L。各组均在37℃ CO2培养箱培养30min、1、3、5h。运用光镜和电镜细胞化学技术分别显示超氧阴离子()和过氧化氢(H2O2)，参考Hirai等[7，8]的细胞化学方法并加以改进(另文待发表)。AM吞噬粉尘颗粒引起呼吸爆发，同时激活位于细胞膜上的NADPH氧化酶，该酶氧化NADPH，使氧分子经单电子还原为。可以继续歧化(自动或经超氧化物歧化酶催化)形成H2O2。在上述反应体系中加入硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium,NBT)，作为的捕捉剂，于产生的原位生成紫蓝色的双甲FDA4沉淀。在细胞水平观察的生成情况并进行图像分析定量。如果在上述反应体系中以铈离子来捕捉H2O2，则于原位形成过氢氧化铈，一种不透电子的沉淀。在亚细胞水平观察H2O2的产生、分布，并且可以同时观察细胞的超微结构变化。铅法显示细胞膜三磷酸腺苷酶(Mg2+-ATPase)[8]，作为膜功能酶的反映。
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4. 图像分析定量
以IBAS-200(Opton,西德)全自动图像分析仪定量测定和Mg2+-ATPase细胞化学标本。各组每一时间段测定6张标本，每张标本内随机选取阳性AM50个，正常对照组20个。在Mg2+-ATPase标本，每张标本随机测定50个AM。单位是光密度值。
5. 统计学处理
对各组及各时间段和Mg2+-ATPase产物定量测定结果做方差分析；对(取30min数值)和Mg2+-ATPase(取5h数值)做相关分析。
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结果
1.的细胞化学观察和图像分析测定的阳性反应呈紫蓝色沉淀，均分布在AM的质膜、吞噬物与AM交界处的细胞膜。正常AM 反应强度很弱，大多数AM呈阴性；矽尘组AM 反应强度在作用早期很强，随着作用时间的延长，逐渐减弱。煤尘组与矽尘组比较，AM 反应强度为弱，但后期的减弱程度较小。详见表1。
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表1 各组肺泡巨噬细胞细胞化学反应定量测定比较(
±
)(光密度值)
Table 1 The cytochemical quantiative date of in AMs among each group(±)(optical density,A) 分组
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groups
N
N
30分钟
30min
1小时
1h
3小时
3h
5小时
5h
对照组
control
, 百拇医药
120
0.1451±0.0015
0.1475±0.0012
0.1427±0.0012
0.1403±0.0014
煤尘组 coal dusts
300
0.2426±0.0078*
0.2218±0.0065*
0.2048±0.0094*
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0.1701±0.0069*
矽尘组
SiO2 group
300
0.2644±0.0085**
0.2369±0.0062**
0.1675±0.0058**
0.1475±0.0088**
注：1.*、**分别与对照组比较，P<0.05；2.**与*比较P<0.05；3.煤尘组，5h与30min组比较，P<0.05；4.矽尘组，3h、5h组分别与30min、1h组比较，P<0.05
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Notes:1.*、** compared with control group,respectively,P<0.05;2.**compare with * P<0.05;3.coal dusts group,5h compared with 30min,P<0.05;4.SiO2 group,3h and 5h compared with 30 min and 1h ,respectively,P<0.05
2. H2O2的电镜细胞化学定位和AM的超微结构变化
H2O2的阳性反应呈高电子密度线状沉淀，分布于细胞质膜、吞噬体/吞噬泡膜及部分溶酶体膜。正常AM细胞表面有不规则微绒毛，细胞核呈肾形，细胞质、尤其溶酶体丰富。矽尘组，作用30min时，细胞已吞噬矽尘颗粒，细胞器丰富，部分溶酶体膜模糊不清，提示可能已有溶酶体酶外漏。H2O2呈强阳性反应(图1，2)。作用5h,H2O2阳性反应已很弱，细胞基质空化、线粒体水肿。核膜断裂，核质碎裂。整个AM呈破碎状，形态结构损伤严重(图3)；实验组，与矽尘组比较，30min时H2O2反应强度弱并见吞噬体与溶酶体膜融合现象(图4)。作用5h，AM的形态结构损伤程度也相应为低，H2O2尚有一定的阳性反应(图5，6)。从H2O2的亚细胞定位观察来看，其反应状况与的细胞水平图像分析定量结果是一致的。
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图1 矽尘组，作用30min。S示矽尘颗粒，↑示H2O2阳性反应产物 ×3 300
图2 矽尘组，作用30min。图1的局部放大 ×10 000
图3 矽尘组，作用5h。H2O2阳性反应很弱，细胞损伤严重。S示矽尘颗粒 ×5 000
图4 煤尘组，作用30min。C示煤尘颗粒，↑示H2O2阳性反应产物，较矽尘组反应弱。“↑F”示溶酶体与吞噬体膜融合现象 ×5 000
图5 煤尘组，作用5h。C示煤尘颗粒，↑示H2O2阳性反应产物，细胞损伤较矽尘组轻 ×5 000
图6 煤尘组，作用5h。C示煤尘颗粒，↑示H2O2阳性反应产物，细胞损伤较矽尘组轻 ×8 300
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Fig.1 SiO2 group.Exposure AMs to SiO2 for 30min.S,silica dust;↑,the reactive products of H2O2. ×3 300
Fig.2 A local enlargement from Fig.1.S,silica dust;↑,the reactive products of H2O2. ×10 000
Fig.3 SiO2 group.Exposure AMs to SiO2 for 5h.H2O2 reaction is very weak.AMs damage is relative much serious.S,silica dust.×5 000
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Fig.4 Coal dusts group.Exposure AMs to coal dusts for 30min.The reactive degree of H2O2 on AMs in coal dusts group is weaker than that of in SiO2 group.C,coal dust;↑,the reactive products of H2O2;↑F,a fusion phenomenon between lyisosomal and phagosomal membrane.×5 000
Fig.5 Coal dusts group.Exposure AMs to coal dusts for 5h.The damage degree of AMs in coal dusts group is much weaker than that of in SiO2 group.C,coal dust;↑,the reactive products of H2O2.×5 000
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Fig.6 Coal dusts group.Exposure AMs to coal dusts for 5h.The damage degree of AMs in coal dusts group is much weaker than that of in SiO2 group.C,coal dust; ↑,the reactive products of H2O2.×8 300
3. Mg2+-ATPase的细胞化学观察和图像分析测定
Mg2+-ATPase定位于细胞质膜，呈棕黄色沉淀。煤尘组酶活性较对照组减弱，并随作用时间延长Mg2+-ATPase活性渐弱。矽尘组较煤尘组活性更弱，随作用时间延长，Mg2+-ATPase活性递减更明显(表2)。
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表2 各组肺泡巨噬细胞Mg2+-ATPase细胞化学反应定量测定比较(±)(光密度值)
Table 2 The cytochemical quantitative date of ATPase in AMs among each group(±)(optical density,A) 分组
groups
N
, 百拇医药 N
30分钟
30min
1小时
1h
3小时
3h
5小时
5h
对照组
control
300
0.3936±0.0021
, 百拇医药
0.3979±0.0029
0.3565±0.0019
0.3726±0.0030
煤尘组 coal dusts
300
0.3768±0.0045
0.2976±0.0065*
0.2457±0.0052*
0.2277±0.0061*
矽尘组
, 百拇医药
SiO2
300
0.3851±0.0055
0.2306±0.0075**
0.1500±0.0083**
0.1379±0.0091**
注：*与对照组比较P<0.05；**与*比较P<0.05
Notes:*compared with control group,P<0.05；**compared with *,P<0.05
4.和Mg2+-ATPase的图像分析测定值相关分析反应强度与AM膜Mg2+-ATPase活性呈负相关，P<0.05。说明尘颗粒在早期致AM产生的氧自由基越多，引发强烈的自由基连锁反应，AM膜酶活性下降越明显，AM形态结构和功能损伤则越严重(图7)。 
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图7 各组AM和Mg2+-ATPase定量细胞化学(光密度值)的相关趋势
Fig.7 The linear correlative tendency of the quantitative data of and Mg2+-ATPase(optical density)among each group.
讨论
有关煤尘与自由基的关系报道较少。用电子自旋共振技术(electronic spin resonance,ESR)检测煤尘在劈裂过程中产生的自由基浓度和半衰期[1，2]，结合煤矿工人尘肺流行病调查资料分析，认为煤分子层结构是由碳氢化物的变形网格构成，机械破碎时，C=C断裂，形成活泼的断片。煤尘在劈裂过程中，自由基浓度越高，半衰期越短者，其毒性就越大，患者病程进展也就越迅速，说明煤工尘肺的发病与煤破碎过程中产生的粉尘自由基活性有一定内在联系。然而煤尘作用于AM时是否存在着氧化损伤机制，尚不清楚。我们选用毒性较低的开滦煤，同时以毒性较大的矽尘为对照，以形态观察并结合定量测定和相关趋势进行综合分析。发现当煤尘与AM作用时产生一定量的和H2O2，其产量虽不及矽尘所致AM的多，但也在一定程度上造成了AM形态结构和膜酶的损伤。说明煤尘致AM形态结构和酶学损伤过程中，存在着自由基氧化损伤机制。这与流行病学报道的煤工尘肺患者血中抗氧化物质如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱苷肽氧化酶(reduced glutathione peroxidase,GSH-Px)等降低相一致[9，10]。这一结果提示，应用抗氧化剂来减弱煤尘所致的损伤，进而预防肺成纤维细胞增殖，为临床治疗提供了实验依据。
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矽尘是矿物粉尘中毒性最大的一种。本实验以矽尘为阳性对照，发现矽尘作用于AM的早期，引发活性极强的氧自由基，然而随着作用时间的延长，引发的氧自由基减弱，同时AM的形态结构和膜酶损伤严重。反应后期AM和H2O2的细胞化学反应强度减弱，可能与质膜NADPH氧化酶本身已受损有关。由于自由基反应的最大特点是连锁性，一旦生成了大量的氧自由基，即可进行连续反应。从氧自由基导致脂质自由基的连锁反应过程[11]即可见一斑。
由此可见，虽然在NADPH氧化酶受损后，和H2O2等氧自由基产生减少，但由于已启动了上述自由基连锁反应，对细胞的损伤持续存在，导致AM形态结构和功能受损。从早期引发自由基产量和晚期AM形态结构、膜酶损伤程度来看，煤尘的毒性低于矽尘，这与我室前期工作以胞质酶和溶酶体酶为指标的实验结果相符[12]。同样也证明了自由基与AM损伤有关。
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【基金项目】煤炭部青年科学基金资助项目(95130)
作者简介：高俊玲(1960—)，女(汉族)，河北饶阳人，硕士，副教授
参考文献
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[3]郭维新，郭鼎，李国华.粉尘表面活性与自由基研究进展[J].国外医学卫生学分册，1996，23(4)：208～211.
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[5]高俊玲，遇铭.大鼠两型肺泡巨噬细胞吞噬煤粒的图像分析和扫描电镜研究[J].解剖学报，1992，23(4)：407～410.
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[7]贲长恩，李叔庚主编.实用酶组织化学[M].长沙：湖南科学技术出版社，1996，195～198.
, 百拇医药
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[9]李涛，吕庆吉.矽肺患者血超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性测定[J].工业卫生与职业病，1990，16(2)：69～73.
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[11]潘世成，罗正曜.病理生理学进展(三)[M].北京：人民卫生出版社，1987：23～28.
[12]万恩新，涂伯林.卡介苗活化家兔肺泡巨噬细胞和腹腔巨噬细胞定量细胞化学比较研究[J].解剖学报，1989，20(suppl):76～79.
【收稿日期】1999-07-01
【修稿日期】1999-10-29, 百拇医药
单位：高俊玲 田艳霞 张宇新 孙树勋(华北煤炭医学院组织学胚胎学教研室，)；崔建忠(唐山工人医院神经外科，唐山 063000)
关键词：肺泡巨噬细胞；煤尘；自由基；损伤；细胞化学
解剖学报000216 【摘要】 目的 探讨煤尘致肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)，损伤过程中是否存在着氧化损伤机制。 方法 应用细胞化学法显示煤尘作用于AM产生的
和H2O2、并做定量测定及相关分析，以Mg2+-ATPase组织化学染色作为检测膜变化的指标。 结果 煤尘致AM产生的氧自由基较矽尘的少，同时细胞的形态结构和膜酶的损伤程度也较低。 结论 (1)应用抗氧化剂可减弱煤尘对AM所致的损伤，进而预防肺成纤维细胞增殖；(2)与矽尘相比，煤尘致AM氧化损伤的程度较弱；(3)形态学方法定位显示自由基较之自由基总体测定技术更能直观、具体地阐明细胞损伤的实际状况。探讨煤尘致肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)，损伤过程中是否存在着氧化损伤机制。, http://www.100md.com
【中图分类号】 Q24；R135.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-160
IN VITRO CYTOCHEMICAL STUDIES OF FREE RADICAL INJURY
ON RAT ALVEOLAR MACROPHAGES BY COAL DUSTS
GAO Jun-ling, TIAN Yan-xia, ZHANG Yu-xin,SUN Shu-xun
(Department of Histology and Embryology,North China Coal Medical College,)
CUI Jian-zhong
, 百拇医药
(Department of Nerosurgery,Tangshan Gongren Hospital,Tangshan 063000,China)
【Abstract】 Objective To analyze the relationship between the oxygen free radicals and morphological damage of alveolar macrophages(AMs)caused by coal dusts. Methods Using morphological technique to demonstrate the oxygen radicals.Moreover
,the cytochemical reaction slides of
and Mg2+-ATPase were analyzed quantitatively by image analyzer,and the linear correlation tendency between the quantitative results of the and Mg2+-ATPase reaction was made. Results Like SiO2,a toxic mineral particle,exposure of AMs to coal dusts also resulted in production of and H2O2.They were localized on the plasma membrane,the membrane of the phogosome and/or pinosome,and the lysosomal membrane.There is a close relationship between AMs morphological and enzymatic damage and the production of oxygen free radicals. Conclusions (1)We can give antioxidant to the patients to terminal oxygenic damage in their bodies,further guard against proliferation of fibroblasts.(2)The degree of oxygen damage induced by coal dusts is lower than that by silica.(3)In situ evaluation of and H2O2 oxygen free radicals is superior to the other techniques in a sense.It is more convenient to directly observe the real situation of the oxidative damage on cells so as to clarify the relationship between the production of free radical and the damage degree on cells., 百拇医药
【Key words】 Alveolar macrophage; Coal dusts; Free radical; Damage; Cytochemistry
煤尘致AM损伤是煤工尘肺发病机制的重要环节。煤尘致AM受损机制众说纷纭。据报道，煤尘在劈裂时产生大量自由基[1～3]，大块肺纤维化的煤工尘肺患者体内抗氧化物质降低[4]。然而，煤尘能否致AM发生氧化损伤的报道尚少，尤未见原位显示氧自由基的研究报道。本研究用原位显示自由基的方法探讨煤尘致AM损伤过程中是否存在氧化损伤机制。
材料和方法
1. 肺泡巨噬细胞的获取与纯化
成年雄性Wistar大鼠40只，体重200～230g，以25%乌拉坦1ml/100g体重腹腔注射，深度麻醉，股动脉放血致死。行支气管肺泡灌洗术[5]，灌洗液经500g离心20min，弃上清，得沉淀细胞。以贴壁法进行富集[6]。台盼蓝排斥实验，AM存活率达99.5%以上。以RPMI-1640培养液调整AM浓度为1×105AM/ml备用。
, 百拇医药
2. 粉尘制备
取开滦煤矿原煤(由中国煤炭研究院唐山分院提供)，经玛瑙研钵研磨，分液漏斗分离，收集悬浮部分，自然晾干，95%以上颗粒直径≤5μm。矽尘采用商品SiO2(由本院中心实验室馈赠)，含游离SiO299%，粒径2μm以下占92.3%。
3. 实验分组和标本制备
实验分3组：(1)实验组：AM+煤尘；(2)正常对照组：AM+生理盐水；(3)阳性对照组：AM+矽尘。煤尘和矽尘的终浓度均为200mg/L。各组均在37℃ CO2培养箱培养30min、1、3、5h。运用光镜和电镜细胞化学技术分别显示超氧阴离子(
)和过氧化氢(H2O2)，参考Hirai等[7，8]的细胞化学方法并加以改进(另文待发表)。AM吞噬粉尘颗粒引起呼吸爆发，同时激活位于细胞膜上的NADPH氧化酶，该酶氧化NADPH，使氧分子经单电子还原为。可以继续歧化(自动或经超氧化物歧化酶催化)形成H2O2。在上述反应体系中加入硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium,NBT)，作为的捕捉剂，于产生的原位生成紫蓝色的双甲FDA4沉淀。在细胞水平观察的生成情况并进行图像分析定量。如果在上述反应体系中以铈离子来捕捉H2O2，则于原位形成过氢氧化铈，一种不透电子的沉淀。在亚细胞水平观察H2O2的产生、分布，并且可以同时观察细胞的超微结构变化。铅法显示细胞膜三磷酸腺苷酶(Mg2+-ATPase)[8]，作为膜功能酶的反映。, 百拇医药
4. 图像分析定量
以IBAS-200(Opton,西德)全自动图像分析仪定量测定
和Mg2+-ATPase细胞化学标本。各组每一时间段测定6张标本，每张标本内随机选取阳性AM50个，正常对照组20个。在Mg2+-ATPase标本，每张标本随机测定50个AM。单位是光密度值。5. 统计学处理
对各组及各时间段
和Mg2+-ATPase产物定量测定结果做方差分析；对(取30min数值)和Mg2+-ATPase(取5h数值)做相关分析。, 百拇医药
结果
1.
的细胞化学观察和图像分析测定的阳性反应呈紫蓝色沉淀，均分布在AM的质膜、吞噬物与AM交界处的细胞膜。正常AM 反应强度很弱，大多数AM呈阴性；矽尘组AM 反应强度在作用早期很强，随着作用时间的延长，逐渐减弱。煤尘组与矽尘组比较，AM 反应强度为弱，但后期的减弱程度较小。详见表1。, http://www.100md.com
表1 各组肺泡巨噬细胞
细胞化学反应定量测定比较(±)(光密度值)Table 1 The cytochemical quantiative date of
in AMs among each group(±)(optical density,A) 分组, http://www.100md.com
groups
N
N
30分钟
30min
1小时
1h
3小时
3h
5小时
5h
对照组
control
, 百拇医药
120
0.1451±0.0015
0.1475±0.0012
0.1427±0.0012
0.1403±0.0014
煤尘组 coal dusts
300
0.2426±0.0078*
0.2218±0.0065*
0.2048±0.0094*
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0.1701±0.0069*
矽尘组
SiO2 group
300
0.2644±0.0085**
0.2369±0.0062**
0.1675±0.0058**
0.1475±0.0088**
注：1.*、**分别与对照组比较，P<0.05；2.**与*比较P<0.05；3.煤尘组，5h与30min组比较，P<0.05；4.矽尘组，3h、5h组分别与30min、1h组比较，P<0.05
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Notes:1.*、** compared with control group,respectively,P<0.05;2.**compare with * P<0.05;3.coal dusts group,5h compared with 30min,P<0.05;4.SiO2 group,3h and 5h compared with 30 min and 1h ,respectively,P<0.05
2. H2O2的电镜细胞化学定位和AM的超微结构变化
H2O2的阳性反应呈高电子密度线状沉淀，分布于细胞质膜、吞噬体/吞噬泡膜及部分溶酶体膜。正常AM细胞表面有不规则微绒毛，细胞核呈肾形，细胞质、尤其溶酶体丰富。矽尘组，作用30min时，细胞已吞噬矽尘颗粒，细胞器丰富，部分溶酶体膜模糊不清，提示可能已有溶酶体酶外漏。H2O2呈强阳性反应(图1，2)。作用5h,H2O2阳性反应已很弱，细胞基质空化、线粒体水肿。核膜断裂，核质碎裂。整个AM呈破碎状，形态结构损伤严重(图3)；实验组，与矽尘组比较，30min时H2O2反应强度弱并见吞噬体与溶酶体膜融合现象(图4)。作用5h，AM的形态结构损伤程度也相应为低，H2O2尚有一定的阳性反应(图5，6)。从H2O2的亚细胞定位观察来看，其反应状况与
的细胞水平图像分析定量结果是一致的。, 百拇医药
图1 矽尘组，作用30min。S示矽尘颗粒，↑示H2O2阳性反应产物 ×3 300
图2 矽尘组，作用30min。图1的局部放大 ×10 000
图3 矽尘组，作用5h。H2O2阳性反应很弱，细胞损伤严重。S示矽尘颗粒 ×5 000
图4 煤尘组，作用30min。C示煤尘颗粒，↑示H2O2阳性反应产物，较矽尘组反应弱。“↑F”示溶酶体与吞噬体膜融合现象 ×5 000
图5 煤尘组，作用5h。C示煤尘颗粒，↑示H2O2阳性反应产物，细胞损伤较矽尘组轻 ×5 000
图6 煤尘组，作用5h。C示煤尘颗粒，↑示H2O2阳性反应产物，细胞损伤较矽尘组轻 ×8 300
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Fig.1 SiO2 group.Exposure AMs to SiO2 for 30min.S,silica dust;↑,the reactive products of H2O2. ×3 300
Fig.2 A local enlargement from Fig.1.S,silica dust;↑,the reactive products of H2O2. ×10 000
Fig.3 SiO2 group.Exposure AMs to SiO2 for 5h.H2O2 reaction is very weak.AMs damage is relative much serious.S,silica dust.×5 000
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Fig.4 Coal dusts group.Exposure AMs to coal dusts for 30min.The reactive degree of H2O2 on AMs in coal dusts group is weaker than that of in SiO2 group.C,coal dust;↑,the reactive products of H2O2;↑F,a fusion phenomenon between lyisosomal and phagosomal membrane.×5 000
Fig.5 Coal dusts group.Exposure AMs to coal dusts for 5h.The damage degree of AMs in coal dusts group is much weaker than that of in SiO2 group.C,coal dust;↑,the reactive products of H2O2.×5 000
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Fig.6 Coal dusts group.Exposure AMs to coal dusts for 5h.The damage degree of AMs in coal dusts group is much weaker than that of in SiO2 group.C,coal dust; ↑,the reactive products of H2O2.×8 300
3. Mg2+-ATPase的细胞化学观察和图像分析测定
Mg2+-ATPase定位于细胞质膜，呈棕黄色沉淀。煤尘组酶活性较对照组减弱，并随作用时间延长Mg2+-ATPase活性渐弱。矽尘组较煤尘组活性更弱，随作用时间延长，Mg2+-ATPase活性递减更明显(表2)。
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表2 各组肺泡巨噬细胞Mg2+-ATPase细胞化学反应定量测定比较(
±)(光密度值)Table 2 The cytochemical quantitative date of ATPase in AMs among each group(
±)(optical density,A) 分组groups
N
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30分钟
30min
1小时
1h
3小时
3h
5小时
5h
对照组
control
300
0.3936±0.0021
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0.3979±0.0029
0.3565±0.0019
0.3726±0.0030
煤尘组 coal dusts
300
0.3768±0.0045
0.2976±0.0065*
0.2457±0.0052*
0.2277±0.0061*
矽尘组
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SiO2
300
0.3851±0.0055
0.2306±0.0075**
0.1500±0.0083**
0.1379±0.0091**
注：*与对照组比较P<0.05；**与*比较P<0.05
Notes:*compared with control group,P<0.05；**compared with *,P<0.05
4.
和Mg2+-ATPase的图像分析测定值相关分析反应强度与AM膜Mg2+-ATPase活性呈负相关，P<0.05。说明尘颗粒在早期致AM产生的氧自由基越多，引发强烈的自由基连锁反应，AM膜酶活性下降越明显，AM形态结构和功能损伤则越严重(图7)。 , http://www.100md.com
图7 各组AM
和Mg2+-ATPase定量细胞化学(光密度值)的相关趋势Fig.7 The linear correlative tendency of the quantitative data of
and Mg2+-ATPase(optical density)among each group.讨论
有关煤尘与自由基的关系报道较少。用电子自旋共振技术(electronic spin resonance,ESR)检测煤尘在劈裂过程中产生的自由基浓度和半衰期[1，2]，结合煤矿工人尘肺流行病调查资料分析，认为煤分子层结构是由碳氢化物的变形网格构成，机械破碎时，C=C断裂，形成活泼的断片。煤尘在劈裂过程中，自由基浓度越高，半衰期越短者，其毒性就越大，患者病程进展也就越迅速，说明煤工尘肺的发病与煤破碎过程中产生的粉尘自由基活性有一定内在联系。然而煤尘作用于AM时是否存在着氧化损伤机制，尚不清楚。我们选用毒性较低的开滦煤，同时以毒性较大的矽尘为对照，以形态观察并结合定量测定和相关趋势进行综合分析。发现当煤尘与AM作用时产生一定量的
和H2O2，其产量虽不及矽尘所致AM的多，但也在一定程度上造成了AM形态结构和膜酶的损伤。说明煤尘致AM形态结构和酶学损伤过程中，存在着自由基氧化损伤机制。这与流行病学报道的煤工尘肺患者血中抗氧化物质如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱苷肽氧化酶(reduced glutathione peroxidase,GSH-Px)等降低相一致[9，10]。这一结果提示，应用抗氧化剂来减弱煤尘所致的损伤，进而预防肺成纤维细胞增殖，为临床治疗提供了实验依据。, 百拇医药
矽尘是矿物粉尘中毒性最大的一种。本实验以矽尘为阳性对照，发现矽尘作用于AM的早期，引发活性极强的氧自由基，然而随着作用时间的延长，引发的氧自由基减弱，同时AM的形态结构和膜酶损伤严重。反应后期AM
和H2O2的细胞化学反应强度减弱，可能与质膜NADPH氧化酶本身已受损有关。由于自由基反应的最大特点是连锁性，一旦生成了大量的氧自由基，即可进行连续反应。从氧自由基导致脂质自由基的连锁反应过程[11]即可见一斑。由此可见，虽然在NADPH氧化酶受损后，
和H2O2等氧自由基产生减少，但由于已启动了上述自由基连锁反应，对细胞的损伤持续存在，导致AM形态结构和功能受损。从早期引发自由基产量和晚期AM形态结构、膜酶损伤程度来看，煤尘的毒性低于矽尘，这与我室前期工作以胞质酶和溶酶体酶为指标的实验结果相符[12]。同样也证明了自由基与AM损伤有关。, 百拇医药
【基金项目】煤炭部青年科学基金资助项目(95130)
作者简介：高俊玲(1960—)，女(汉族)，河北饶阳人，硕士，副教授
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【收稿日期】1999-07-01
【修稿日期】1999-10-29, 百拇医药