模拟失重大鼠脑血管周围肽能神经支配的可塑性变化
作者：毛秦雯 张立藩 马进 张远强 黄威权
单位：毛秦雯 张立藩 马进(第四军医大学航空航天生理学教研室)；张远强 黄威权(组织学胚胎学教研室，西安 710032)
关键词：模拟失重；脑动脉；血管周围神经；神经肽Y；降钙素基因相关肽；P物质；大鼠
解剖学报000207 【摘要】 目的 探讨模拟失重是否可引起动脉血管周围神经支配发生可塑性变化。 方法 以尾部悬吊大鼠模型模拟失重时的血液动力学影响。以免疫组织化学(ABC-GDN)方法，观察对照(CON)、尾部悬吊4周(SUS-4)和恢复1周(REC-1)大鼠脑血管周围肽能神经的变化。 结果 与CON组比较，脑动脉上述神经在SUS-4组变得更清晰、染色更深，而在REC-1组纤维变得模糊且不连续。定量观察表明，上述几种神经纤维的密度在SUS-4组显著升高，以大脑前动脉为例，含NPY、含CGRP及含SP神经纤维的密度较CON组分别升高70%、78%及111%(P<0.01)；而REC-1组各段血管，则有降低的趋势，但多未达到显著程度。 结论 脑动脉周围肽能神经对模拟失重引起的血液动力学改变颇为敏感，可发生支配增强的适应性变化；解除后，则先经历支配减弱阶段，再恢复至正常水平。探讨模拟失重是否可引起动脉血管周围神经支配发生可塑性变化。 方法 以尾部悬吊大鼠模型模拟失重时的血液动力学影响。以免疫组织化学(ABC-GDN)方法，观察对照(CON)、尾部悬吊4周(SUS-4)和恢复1周(REC-1)大鼠脑血管周围肽能神经的变化。 结果 与CON组比较，脑动脉上述神经在SUS-4组变得更清晰、染色更深，而在REC-1组纤维变得模糊且不连续。定量观察表明，上述几种神经纤维的密度在SUS-4组显著升高，以大脑前动脉为例，含NPY、含CGRP及含SP神经纤维的密度较CON组分别升高70%、78%及111%(P<0.01)；而REC-1组各段血管，则有降低的趋势，但多未达到显著程度。 结论 脑动脉周围肽能神经对模拟失重引起的血液动力学改变颇为敏感，可发生支配增强的适应性变化；解除后，则先经历支配减弱阶段，再恢复至正常水平。
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【中图分类号】 R852.22 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-124
PLASTIC CHANGE IN DENSITY OF PERIVASCULAR PEPTIDERGIC NERVE FIBERS AROUND THE CEREBRAL ARTERIES OF RATS DURING SIMULATED WEIGHTLESSNESS AND ITS REVERSAL
MAO Qin-wen,ZHANG Li-fan,MA Jin,(Departments of Aerospace Physiology,and Histology and Embryology,)
MAO Qin-wen，ZHANG Yuan-qiang,HUANG Wei-quan
, 百拇医药
(The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
【Abstract】 Objective The aim of the present study was to observe the plastic change of the innervation state of peptidergic nerve fibers around the cerebral arteries of rats during both simulated weightlessness and its reversal. Methods The tail-suspension rat model was used to simulate the hemodynamic effect of weightlessness. The innervation state of peptidergic nerve fibers supplying the cerebral arteries of control(CON),4-wk suspended(SUS-4), and 1-wk recovered(RE-1) rats were examined by the free-floating ABC-GDN immunostaining technique in whole mount preparations. Results All these nerve fibers around the cerebral arteries were clear and dark in staining in rats from SUS-4 group, and became dim and discontinuous in appearance in REC-1 rats as compared with that in CON rats.Quant
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itatively, in SUS-4 group, the density of the three kinds of nerve fibers around the main cerebral arteries were greater than that in CON group(P<0.01)， for example, the density of NPY-, CGRP-,and SP-containing fibers in the cerebral arteries in SUS-4 were 70%, 78% and 111% higher than that of CON group (P<0.01)， respectively. In REC-1, the fiber densities showed a general tendency of decrease in these cerebral arteries as compared with that in CON group, but the differences were not significant(P>0.05).Conclusion These data have provided the evidence that the perivascular peptidergic innervation of the cerebral arteries is quite sensitive to local hemodynamic changes induced by simulated weightlessness and the adaptive change can occur rapidly.
, 百拇医药
【Key words】 Simulated weightlessness; Cerebral artery; Perivascular nerve fiber; Neuropeptide Y; Calcitonin gene-related peptide; Substance P; Rat
我们在前一工作已观察到长期头低位可引起大鼠后身动脉血管收缩反应性降低，管壁出现萎缩性变化及肾上腺素能神经支配减弱现象，并提出这可能是导致航天员飞行后立位耐力不良的重要机制之一[1,2]。上述一系列变化显然是动脉血管系统对局部血液动力学条件变化的适应性表现。失重时，由于血液头向转移，航天员还有面部水肿、头痛、鼻充血等症状，可能与头部血流量增大、血管跨壁压力升高有关。我们的工作已证明，这种局部血液动力学变化可引起脑部动脉血管肥厚性变化，收缩反应性增强及肾上腺素能神经支配增强[1～5]。至于是否可引起脑血管肽能神经的支配状态[6]也发生相应改变，尚不清楚。本文报道我们在这方面的观察。
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材料和方法
1. 动物模型
雄性SD大鼠(体重250～300g)18只。动物被随机分为3组(每组n=6)，即悬吊4周(SUS-4)，悬吊4周后、恢复1周(REC-1)及同步对照组(CON)。尾部悬吊模拟失重大鼠模型参照陈杰等[7]的方法进行。CON组有3只动物的取材与SUS-4组同步，其余3只对照大鼠与REC-1组取材同时进行。
2.标本制备
腹腔内注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)将动物麻醉后，经主动脉插管灌注固定。在3.4 kPa下用Krebs平衡液(含硝普钠10 mg/L，37℃)以1 ml/(min.100g)(体重)的流量灌流15min。然后在相同压力下以4%多聚甲醛250ml灌注固定。开颅，小心取出整脑，浸入相同固定液中进行后固定，过夜。在立体显微镜下，分离包括大脑前动脉(ACA)、大脑中动脉(MCA)、劲内动脉(ICA)、大脑后动脉(PCA)、小脑上动脉(SCA)与基底动脉(BA)在内的完整脑底动脉环；并在镜下仔细剔除血管周围的蛛网膜。再将上述分离的血管组织浸入磷酸缓冲液(PBS，0.01 mol/L,pH 7.4)漂洗备用。
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3. 染色程序
采用ABC免疫组织化学技术结合硫酸镍胺增强显色法[8,9]。血管标本均先经3%甲醇双氧水及1%正常猪血清封闭各1h，然后分别入兔抗CGRP、兔抗SP血清(INC公司产品，均为1∶5 000)或兔抗NPY血清(本实验室自制，1∶2 000)中孵育48h，再依次进入生物素标记的猪抗兔IgG血清(DAKO公司产品，1∶500)中孵育12h，卵白素-生物素复合物(avidin biotin complex,ABC;DAKO公司产品，1∶200)中孵育1h。以上孵育均在室温下进行。再入葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺(glucose oxidase-diaminobenzidine-nickel sulfate,GDN)中呈色20 min。以上各步骤之间均用0.01 mol/L PBS (pH7.4)漂洗(10 min×3)。最后在解剖镜下将血管展开，自然干燥，透明，封片。3组标本的免疫组织化学染色过程均系在同一时间、相同条件下进行。
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对照试验：用正常猪血清取代第一抗体进行孵育；用第一抗体经过量相应抗原(0.1 mg/L)吸收后进行孵育。
4.血管周围神经纤维密度测量
用交点计数法[10]测量3组大鼠脑动脉血管ACA、MCA、ICA、PCA、SCA和BA血管上的神经纤维密度。在×40物镜与×10目镜(内装测微网格)下，分别计数与血管纵轴/横轴相平行的0.1mm目镜网格线上环行/纵行神经纤维的交点数。在每段血管上均任选3个视野，取平均值，作为本段血管纵行或环行神经纤维的密度。纵行与环行纤维密度之和为血管周围神经纤维的总密度。记录3组大鼠的神经纤维密度。组间数据用t检验进行统计学处理。
结 果
大鼠脑动脉经ABC-GDN法染色后，神经纤维呈深蓝色，纤维和膨体清晰完整，背景浅淡，阴性对照未见特异性着色。大鼠脑动脉含NPY神经纤维在各主要脑动脉上分布密集，多呈螺旋状走行。含CGRP与含SP神经纤维较纤细，在脑底动脉环吻侧呈网状分布，在尾侧较稀少且多沿血管纵向走行。图1～9分别表示模拟失重及恢复期含NPY、CGRP及SP神经纤维密度的变化。由图可见：与CON组相比，脑动脉上述几种神经纤维在SUS-4组变得更加清晰、染色更深；而在REC-1组，纤维变得模糊且不连续。
, 百拇医药
图1～9 照片表明4周模拟失重可引起大脑前动脉周围含NPY、含CGRP及含SP神经纤维深染及密度增高；而解除模拟1周后，已基本恢复。
图1～3 对照(图1)、尾部悬吊4周(图2)及恢复1周(图3)大鼠的大脑前动脉含NPY神经纤维，×100 标尺示100μm
图4～6 对照(图4)、尾部悬吊4周(图5)及恢复1周(图6)大鼠的大脑前动脉含CGRP神经纤维，×250 标尺示40μm
图7～9 对照(图7)、尾部悬吊4周(图8)及恢复1周(图9)大鼠的大脑前动脉含SP神经纤维，×100 标尺示100μm
Fig.1-9 Photomicrographs showing the effect of simulated weightlessness on the innervation state of NPY-,CGRP-,and SP-containing perivascular nerves suppling the anterior cerebral arteries, respectively; note that the nerve fibers are deeply stained and with increased density in 4-wk tail-suspeded rats as compared with that of the control or 1-wk recovered rats.
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Fig.1-3 Photomicrographs showing NPY-containing nerve fibers supplying the anterior cerebral artery of control(1),4-wk tail-suspended(2),and 1-wk recovered(3) rats, respectively.×100 Bar=100μm.
Fig.4-6 Photomicrographs showing CGRP-containing nerve fibers supplying the anterior cerebral artery of control(4), 4-wk tail-suspended(5) and 1-wk recovered(6) rats, respectively.×250 Bar=40μm.
Fig.7-9:Photomicrographs showing SP-containing nerve fibers supplying the anterior cerebral artery of control(7), 4-wk tail-suspended(80),and 1-wk recovered(9)rats, respectively.×100 Bar=100μm.
, 百拇医药
各组大鼠这3种神经纤维在脑底动脉上的密度已整理于表1～3。这3种神经纤维在脑底动脉环吻侧的密度均高于尾侧。其密度排序依次为：含NPY神经>含CGRP神经>含SP神经。下面进一步叙述各种神经在模拟失重及恢复期的变化。
表1 大鼠脑动脉含NPY神经纤维的密度
(交点数/0.1mm)
Table 1 Density (intercepts/0.1mm) of NPY-containing
nerve fibers supplying the cerebral arteries of rats 动脉
artery
神经纤维
, 百拇医药
fibers
对照组
CON
模拟失重
4周组
SUS-4
恢复1周组
REC-1
大脑前动脉
anterior
cerebral a.
环行(spiral)
, 百拇医药 6.1±0.2
8.2±0.2**
5.0±0.3
纵行(longitudinal)
1.9±0.2
4.2±0.2**
1.5±0.2
总计(total)
7.0±0.2
12.4±0.2**
6.5±0.4
大脑中动脉
, 百拇医药
middle
cerebral a.
环行(spiral)
3.0±0.2
5.3±0.2*
2.8±0.2
纵行(longitudinal)
1.4±0.1
4.6±0.2**
1.2±0.2
总计(total)
4.4±0.2
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10.0±0.2**
4.0±0.1
颈内动脉
internal
carotid a.
环行(spiral)
6.0±0.2
8.0±0.1**
5.0±0.2
纵行(longitudinal)
1.0±0.0
2.0±0.1**
, 百拇医药
1.0±0.1
总计(total)
7.0±0.2
17.0±0.1**
6.0±0.2
大脑后动脉
posterior
cerebral a.
环行(spiral)
2.0±0.2
2.5±0.2**
1.8±0.2
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纵行(longitudinal)
0.7±0.2
2.9±0.2**
0.6±0.2
总计(total)
2.8±0.2
5.4±0.2**
2.4±0.2
小脑上动脉
superior
cerebellar a.
环行(spiral)
, http://www.100md.com
0.6±0.2
1.5±0.2**
0.5±0.2
纵行(longitudinal)
1.0±0.2
2.4±0.2**
1.1±0.2
总计(total)
1.7±0.2
3.9±0.2**
1.6±0.2
基底动脉
, 百拇医药
basilar a.
环行(spiral)
3.1±0.2
3.8±0.3*
2.9±0.1
纵行(longitudinal)
1.9±0.2
2.9±0.2**
1.9±0.2
总计(total)
5.0±0.2
6.7±0.4**
, 百拇医药
4.8±0.2
表中数据为
±
。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01
Values are±.*P<0.05，**P<0.01 vs.CON group
表2 大鼠脑动脉含CGRP神经纤维的密度(交点数/0.1mm)
Table 2 Density (intercepts/0.1mm) of CGRP-containing
, 百拇医药
nerve fibers supplying the cerebral arteries of rats 动脉
artery
神经纤维
fibers
对照组
CON
模拟失重
4周组
SUS-4
恢复1周组
REC-1
大脑前动脉
, http://www.100md.com
anterior
cerebral a.
环行(spiral)
1.5±0.4
2.3±0.2
2.0±0.0
纵行(longitudinal)
2.3±0.2
4.5±0.4**
3.0±0.5
总计(total)
3.8±0.4
, 百拇医药
6.8±0.5**
5.0±0.3
大脑中动脉
middle
cerebral a.
环行(spiral)
0.7±0.2
1.2±0.2
0.6±0.2
纵行(longitudinal)
1.2±0.3
2.8±0.2**
, 百拇医药
1.3±0.3
总计(total)
1.9±0.2
4.0±0.3**
1.9±0.2
颈内动脉
internal
carotid a.
环行(spiral)
0.4±0.1
0.4±0.1
0.3±0.1
, 百拇医药
纵行(longitudinal)
0.8±0.2
2.4±0.3**
0.7±0.1
总计(total)
1.2±0.1
2.8±0.3**
1.0±0.2
大脑后动脉
posterior
cerebral a.
环行(spiral)
, http://www.100md.com
0.8±0.1
1.2±0.2
0.6±0.1
纵行(longitudinal)
2.0±0.3
3.8±0.3**
2.1±0.1
总计(total)
2.8±0.3
5.0±0.1**
2.7±0.2
小脑上动脉
, 百拇医药
superior
cerebellar a.
环行(spiral)
0.2±0.0
0.3±0.1
0.2±0.0
纵行(longitudinal)
1.0±0.2
2.2±0.3**
0.8±0.1
总计(total)
1.2±0.2
, 百拇医药
2.5±0.3**
1.0±0.1
基底动脉
basilar a.
环行(spiral)
0.4±0.0
0.6±0.1
0.5±0.2
纵行(longitudinal)
1.8±0.2
3.7±0.3**
1.7±0.2
, 百拇医药
总计(total)
2.2±0.1
4.2±0.2**
2.2±0.3
表中数据为±。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01
Values are±.*P<0.05，**P<0.01 vs.CON group
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表3 大鼠脑动脉含SP神经纤维的密度(交点数/0.1mm)
Table 3 Density (intercepts/0.1mm) of SP-containing
nerve fibers supplying the cerebral arteries of rats 动脉
artery
神经纤维
fibers
对照组
CON
模拟失重
4周组
, 百拇医药
SUS-4
恢复1周组
REC-1
大脑前动脉
anterior
cerebral a.
环行(spiral)
0.4±0.1
0.7±0.1
0.4±0.1
纵行(longitudinal)
1.3±0.2
, 百拇医药
2.8±0.2**
1.5±0.2
总计(total)
1.7±0.2
3.6±0.1**
1.8±0.3
大脑中动脉
middle
cerebral a.
环行(spiral)
0.3±0.1
0.4±0.1
, 百拇医药
0.2±0.1
纵行(longitudinal)
0.4±0.1
2.0±0.2**
0.4±0.1
总计(total)
0.7±0.1
2.5±0.3**
0.6±0.1
颈内动脉
internal
carotid a.
, http://www.100md.com
环行(spiral)
0.2±0.1
0.4±0.1
0.1±0.1
纵行(longitudinal)
0.4±0.0
2.2±0.0**
0.4±0.1
总计(total)
0.7±0.1
2.6±0.1**
0.5±0.1
, 百拇医药
大脑后动脉
posterior
cerebral a.
环行(spiral)
0.0±0.0
0.5±0.1**
0.0±0.0
纵行(longitudinal)
0.4±0.1
1.9±0.1**
0.3±0.1
总计(total)
, http://www.100md.com
0.4±0.1
2.4±0.1**
0.3±0.1
小脑上动脉
superior
cerebellar a.
环行(spiral)
0.0±0.0
0.3±0.1**
0.0±0.0
纵行(longitudinal)
0.4±0.1
, 百拇医药
1.2±0.1**
0.4±0.1
总计(total)
0.4±0.1
1.4±0.1**
0.4±0.1
基底动脉
basilar a.
环行(spiral)
0.0±0.0
0.4±0.1**
0.0±0.0
, http://www.100md.com
纵行(longitudinal)
0.4±0.1
1.2±0.1**
0.4±0.1
总计(total)
0.4±0.1
1.5±0.2**
0.4±0.1
表中数据为±。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01
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Values are±.*P<0.05，**P<0.01 vs.CON group
含NPY神经纤维 由表1可见：与CON组相比，SUS-4组各脑动脉上含NPY的纵行、环行神经纤维的密度及总密度均显著高于CON组；REC-1组各段血管含NPY神经纤维的密度与CON间无显著差别。
含CGRP与含SP神经纤维 其密度变化趋势相似。由表2、3可见，与CON组相比，SUS-4各脑动脉上这两种神经纤维的密度亦增高，尤以纵行纤维的密度和总密度为明显。REC-1组各段血管含CGRP、SP神经的密度与CON组间无显著差别。
讨 论
, http://www.100md.com 本工作发现，4周模拟失重可使大鼠脑血管周围3种肽能神经纤维密度显著增高，处于神经支配增强状态；恢复1周后，上述神经支配又转为处于减弱状态或已恢复至对照水平。这些资料首次阐明，脑血管肽能神经支配对模拟失重引起的局部血液动力学改变颇为敏感，并能很快发生不同性质的可塑性变化。
早期工作认为，脑血管只有化学调节。1967年，Nielsen与Owman报道脑血管周围有密集的肾上腺素能神经后，脑血管神经调节的概念才得以建立。应用免疫细胞化学技术，在支配脑血管的神经纤维中已经发现的递质或侯补递质至少有12种，其中包括经典递质如肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺，以及多肽类物质如VIP、NPY、SP、CGRP等。关于脑血管肽能神经的分布、来源、共存、功能等已有较多研究[6,10，11]。脑血管周围神经纤维起源于交感、副交感及感觉-运动神经(sensorimotor n.)。后者主要起源于三叉神经的眼支与上颌支，虽系感觉纤维，但通过“轴突反射”机制对靶组织也具有传出(运动)功能，故被称为“感觉-运动神经”[6]。NPY在脑交感神经纤维中与去甲肾上腺素(NA)共存，在非肾上腺素能神经纤维轴索中，NPY与VIP共存。NPY可引起离体脑动脉环发生浓度依赖性收缩反应。CGRP与SP在感觉-运动神经中共存，可能参与局部“轴突反射”过程。CGRP与SP均对脑血管有扩张作用[6]。
, 百拇医药
总之，脑血管周围交感、副交感和感觉-运动神经纤维及其所含经典递质NA、Ach与多种神经肽类物质共同形成一个复杂的血管紧张度外周调节系统。此外，血管周围神经及其肽类递质对血管平滑肌与内皮的生长和发育过程尚具有慢性的营养作用；可引起脑血管结构发生改变[6,11]。虽已有上述重要发现，但目前对其间的复杂网络关系及精细调节过程还知之甚少。在高血压、糖尿病及衰老研究中均曾考察脑血管肽能神经的改变。对自发性高血压大鼠的研究发现，含NA、含NPY、含CGRP等递质的多种神经纤维均有变化；并提出在高血压发病机理中，交感神经系统对血管的营养性作用增强可能较血压升高因素具有更加重要的意义[6，10]。
由于在航天真实失重环境进行生物医学研究的机会非常难得，且代价高昂，并要受到诸多条件限制难以深入，故失重生物医学研究历来都以大量深入的地面模拟研究与极少量精心设计的航天研究相结合之模式进行。人体地面模拟失重研究主要采用“卧床实验”模拟失重时的体液头向转移及身体低负荷状态。动物地面模拟失重研究现多用大鼠进行，具有经济、易行、可多次重复、能进行多层次整合研究的优点。美国航空航天局(NASA)的Morey-Holton等提出的尾部悬吊大鼠模型较为理想。本实验室又曾改进此模型，将模拟时间延长到120d[7]；并证明模拟失重大鼠可表现类似航天员飞行后心血管失调的现象[12]。
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模拟失重下，大鼠脑血管含NPY、含CGRP及含SP神经所一致表现的支配增强状态正是血管周围神经对局部高跨壁压、高血流量的一种适应性可塑变化。失重/模拟失重下的脑血管神经支配增强可能有三个方面的重要意义：首先，对高跨壁压下维持脑血流稳定可能有一定意义。其次，对防止脑充血及脑水肿可能有保护作用。这可能还与血管周围神经的营养性作用有关。对高血压大鼠的研究发现：含NA神经、含NPY神经的支配增强变化均发生于血管中膜增厚及血压水平升高之前[10]；交感切除虽可使高血压大鼠脑血管中膜增厚程度减轻，但卒中的发病率却升高，血脑屏障通透性增大[10，11]。人在失重时，头面部出现充血、水肿并伴有头痛等不适症状。在悬吊大鼠也观察到眼结膜有充血、水肿。推测还可能与脑血管含SP和CGRP神经的支配增强变化有关。第三，这种神经支配增强状态还可能使中膜增厚的脑血管收缩反应性进一步增强[2，4]，在返回1G环境时易发生脑血管过度收缩。近年对航天员及卧床被试者的观察均提示，脑血管性晕厥始动机制(cerebrovascular syncope-initiating mechanism)在飞行后立位耐力不良发生中的意义不容忽视[1，2]。本实验还发现，解除模拟失重恢复1周后，脑血管神经支配已基本恢复或处于减弱状态。此种变化发生在血管结构完全恢复之前，表明血管神经的营养性作用对中膜增厚血管的逆转也可能有重要意义。
, 百拇医药
总之，为期4周(中期)的模拟失重已可引起脑动脉血管周围含NPY、含CGRP及含SP神经支配处于增强状态；但恢复初期上述神经支配又反而处于减弱状态。说明脑动脉周围含NPY、含CGRP及含SP神经支配状态对模拟失重引起的局部血液动力学改变具有高度的可塑性。本工作提示：失重时，脑血管周围神经支配的可塑性变化可能参与脑血管壁重塑的调节过程，对防止脑充血及脑水肿可能具有保护作用；航天失重后，则可能是造成飞行后立位耐力不良的发生机制之一。
感谢刘春同志在论文写作方面给予的大力协作
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39380021)
作者简介：毛秦雯(1968—)，女(汉族)，陕西省人，医学博士，讲师
参考文献
[1]Zhang Li-Fan, Mao Qin-Wen, Ma Jin,et al. Effects of simulated weightlessness on arterial vasculature——an experimental study on vascular deconditioning[J]. J Gravit Physiol,1996,3(1)：5-8.
, 百拇医药
[2]Zhang Li-Fan, Ma Jin, Mao Qin-Wen, et al. Plasticity of arterial vasculature during simulated weightlessness and its possible role in the genesis of postflight orthostatic intolerance[J]. J Gravit Physiol.,1997,4(2):97-100.
[3]毛秦雯，张立藩，马进.尾部悬吊大鼠不同部位动脉血管的分化性结构重塑变化及其可逆性[J].航天医学与医学工程，1999，12(2):92～96.
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[5]毛秦雯，张立藩，张远强，等.长期头低位可引起大鼠脑底动脉肾上腺素能神经支配增强[J].细胞与分子免疫学杂志，1997，13(suppl.1)：39～41.
, 百拇医药
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【收稿日期】1999-04-20
【修稿日期】1999-10-20, http://www.100md.com
单位：毛秦雯 张立藩 马进(第四军医大学航空航天生理学教研室)；张远强 黄威权(组织学胚胎学教研室，西安 710032)
关键词：模拟失重；脑动脉；血管周围神经；神经肽Y；降钙素基因相关肽；P物质；大鼠
解剖学报000207 【摘要】 目的 探讨模拟失重是否可引起动脉血管周围神经支配发生可塑性变化。 方法 以尾部悬吊大鼠模型模拟失重时的血液动力学影响。以免疫组织化学(ABC-GDN)方法，观察对照(CON)、尾部悬吊4周(SUS-4)和恢复1周(REC-1)大鼠脑血管周围肽能神经的变化。 结果 与CON组比较，脑动脉上述神经在SUS-4组变得更清晰、染色更深，而在REC-1组纤维变得模糊且不连续。定量观察表明，上述几种神经纤维的密度在SUS-4组显著升高，以大脑前动脉为例，含NPY、含CGRP及含SP神经纤维的密度较CON组分别升高70%、78%及111%(P<0.01)；而REC-1组各段血管，则有降低的趋势，但多未达到显著程度。 结论 脑动脉周围肽能神经对模拟失重引起的血液动力学改变颇为敏感，可发生支配增强的适应性变化；解除后，则先经历支配减弱阶段，再恢复至正常水平。探讨模拟失重是否可引起动脉血管周围神经支配发生可塑性变化。 方法 以尾部悬吊大鼠模型模拟失重时的血液动力学影响。以免疫组织化学(ABC-GDN)方法，观察对照(CON)、尾部悬吊4周(SUS-4)和恢复1周(REC-1)大鼠脑血管周围肽能神经的变化。 结果 与CON组比较，脑动脉上述神经在SUS-4组变得更清晰、染色更深，而在REC-1组纤维变得模糊且不连续。定量观察表明，上述几种神经纤维的密度在SUS-4组显著升高，以大脑前动脉为例，含NPY、含CGRP及含SP神经纤维的密度较CON组分别升高70%、78%及111%(P<0.01)；而REC-1组各段血管，则有降低的趋势，但多未达到显著程度。 结论 脑动脉周围肽能神经对模拟失重引起的血液动力学改变颇为敏感，可发生支配增强的适应性变化；解除后，则先经历支配减弱阶段，再恢复至正常水平。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R852.22 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-124
PLASTIC CHANGE IN DENSITY OF PERIVASCULAR PEPTIDERGIC NERVE FIBERS AROUND THE CEREBRAL ARTERIES OF RATS DURING SIMULATED WEIGHTLESSNESS AND ITS REVERSAL
MAO Qin-wen,ZHANG Li-fan,MA Jin,(Departments of Aerospace Physiology,and Histology and Embryology,)
MAO Qin-wen，ZHANG Yuan-qiang,HUANG Wei-quan
, 百拇医药
(The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
【Abstract】 Objective The aim of the present study was to observe the plastic change of the innervation state of peptidergic nerve fibers around the cerebral arteries of rats during both simulated weightlessness and its reversal. Methods The tail-suspension rat model was used to simulate the hemodynamic effect of weightlessness. The innervation state of peptidergic nerve fibers supplying the cerebral arteries of control(CON),4-wk suspended(SUS-4), and 1-wk recovered(RE-1) rats were examined by the free-floating ABC-GDN immunostaining technique in whole mount preparations. Results All these nerve fibers around the cerebral arteries were clear and dark in staining in rats from SUS-4 group, and became dim and discontinuous in appearance in REC-1 rats as compared with that in CON rats.Quant
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itatively, in SUS-4 group, the density of the three kinds of nerve fibers around the main cerebral arteries were greater than that in CON group(P<0.01)， for example, the density of NPY-, CGRP-,and SP-containing fibers in the cerebral arteries in SUS-4 were 70%, 78% and 111% higher than that of CON group (P<0.01)， respectively. In REC-1, the fiber densities showed a general tendency of decrease in these cerebral arteries as compared with that in CON group, but the differences were not significant(P>0.05).Conclusion These data have provided the evidence that the perivascular peptidergic innervation of the cerebral arteries is quite sensitive to local hemodynamic changes induced by simulated weightlessness and the adaptive change can occur rapidly.
, 百拇医药
【Key words】 Simulated weightlessness; Cerebral artery; Perivascular nerve fiber; Neuropeptide Y; Calcitonin gene-related peptide; Substance P; Rat
我们在前一工作已观察到长期头低位可引起大鼠后身动脉血管收缩反应性降低，管壁出现萎缩性变化及肾上腺素能神经支配减弱现象，并提出这可能是导致航天员飞行后立位耐力不良的重要机制之一[1,2]。上述一系列变化显然是动脉血管系统对局部血液动力学条件变化的适应性表现。失重时，由于血液头向转移，航天员还有面部水肿、头痛、鼻充血等症状，可能与头部血流量增大、血管跨壁压力升高有关。我们的工作已证明，这种局部血液动力学变化可引起脑部动脉血管肥厚性变化，收缩反应性增强及肾上腺素能神经支配增强[1～5]。至于是否可引起脑血管肽能神经的支配状态[6]也发生相应改变，尚不清楚。本文报道我们在这方面的观察。
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材料和方法
1. 动物模型
雄性SD大鼠(体重250～300g)18只。动物被随机分为3组(每组n=6)，即悬吊4周(SUS-4)，悬吊4周后、恢复1周(REC-1)及同步对照组(CON)。尾部悬吊模拟失重大鼠模型参照陈杰等[7]的方法进行。CON组有3只动物的取材与SUS-4组同步，其余3只对照大鼠与REC-1组取材同时进行。
2.标本制备
腹腔内注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)将动物麻醉后，经主动脉插管灌注固定。在3.4 kPa下用Krebs平衡液(含硝普钠10 mg/L，37℃)以1 ml/(min.100g)(体重)的流量灌流15min。然后在相同压力下以4%多聚甲醛250ml灌注固定。开颅，小心取出整脑，浸入相同固定液中进行后固定，过夜。在立体显微镜下，分离包括大脑前动脉(ACA)、大脑中动脉(MCA)、劲内动脉(ICA)、大脑后动脉(PCA)、小脑上动脉(SCA)与基底动脉(BA)在内的完整脑底动脉环；并在镜下仔细剔除血管周围的蛛网膜。再将上述分离的血管组织浸入磷酸缓冲液(PBS，0.01 mol/L,pH 7.4)漂洗备用。
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3. 染色程序
采用ABC免疫组织化学技术结合硫酸镍胺增强显色法[8,9]。血管标本均先经3%甲醇双氧水及1%正常猪血清封闭各1h，然后分别入兔抗CGRP、兔抗SP血清(INC公司产品，均为1∶5 000)或兔抗NPY血清(本实验室自制，1∶2 000)中孵育48h，再依次进入生物素标记的猪抗兔IgG血清(DAKO公司产品，1∶500)中孵育12h，卵白素-生物素复合物(avidin biotin complex,ABC;DAKO公司产品，1∶200)中孵育1h。以上孵育均在室温下进行。再入葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺(glucose oxidase-diaminobenzidine-nickel sulfate,GDN)中呈色20 min。以上各步骤之间均用0.01 mol/L PBS (pH7.4)漂洗(10 min×3)。最后在解剖镜下将血管展开，自然干燥，透明，封片。3组标本的免疫组织化学染色过程均系在同一时间、相同条件下进行。
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对照试验：用正常猪血清取代第一抗体进行孵育；用第一抗体经过量相应抗原(0.1 mg/L)吸收后进行孵育。
4.血管周围神经纤维密度测量
用交点计数法[10]测量3组大鼠脑动脉血管ACA、MCA、ICA、PCA、SCA和BA血管上的神经纤维密度。在×40物镜与×10目镜(内装测微网格)下，分别计数与血管纵轴/横轴相平行的0.1mm目镜网格线上环行/纵行神经纤维的交点数。在每段血管上均任选3个视野，取平均值，作为本段血管纵行或环行神经纤维的密度。纵行与环行纤维密度之和为血管周围神经纤维的总密度。记录3组大鼠的神经纤维密度。组间数据用t检验进行统计学处理。
结 果
大鼠脑动脉经ABC-GDN法染色后，神经纤维呈深蓝色，纤维和膨体清晰完整，背景浅淡，阴性对照未见特异性着色。大鼠脑动脉含NPY神经纤维在各主要脑动脉上分布密集，多呈螺旋状走行。含CGRP与含SP神经纤维较纤细，在脑底动脉环吻侧呈网状分布，在尾侧较稀少且多沿血管纵向走行。图1～9分别表示模拟失重及恢复期含NPY、CGRP及SP神经纤维密度的变化。由图可见：与CON组相比，脑动脉上述几种神经纤维在SUS-4组变得更加清晰、染色更深；而在REC-1组，纤维变得模糊且不连续。
, 百拇医药
图1～9 照片表明4周模拟失重可引起大脑前动脉周围含NPY、含CGRP及含SP神经纤维深染及密度增高；而解除模拟1周后，已基本恢复。
图1～3 对照(图1)、尾部悬吊4周(图2)及恢复1周(图3)大鼠的大脑前动脉含NPY神经纤维，×100 标尺示100μm
图4～6 对照(图4)、尾部悬吊4周(图5)及恢复1周(图6)大鼠的大脑前动脉含CGRP神经纤维，×250 标尺示40μm
图7～9 对照(图7)、尾部悬吊4周(图8)及恢复1周(图9)大鼠的大脑前动脉含SP神经纤维，×100 标尺示100μm
Fig.1-9 Photomicrographs showing the effect of simulated weightlessness on the innervation state of NPY-,CGRP-,and SP-containing perivascular nerves suppling the anterior cerebral arteries, respectively; note that the nerve fibers are deeply stained and with increased density in 4-wk tail-suspeded rats as compared with that of the control or 1-wk recovered rats.
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Fig.1-3 Photomicrographs showing NPY-containing nerve fibers supplying the anterior cerebral artery of control(1),4-wk tail-suspended(2),and 1-wk recovered(3) rats, respectively.×100 Bar=100μm.
Fig.4-6 Photomicrographs showing CGRP-containing nerve fibers supplying the anterior cerebral artery of control(4), 4-wk tail-suspended(5) and 1-wk recovered(6) rats, respectively.×250 Bar=40μm.
Fig.7-9:Photomicrographs showing SP-containing nerve fibers supplying the anterior cerebral artery of control(7), 4-wk tail-suspended(80),and 1-wk recovered(9)rats, respectively.×100 Bar=100μm.
, 百拇医药
各组大鼠这3种神经纤维在脑底动脉上的密度已整理于表1～3。这3种神经纤维在脑底动脉环吻侧的密度均高于尾侧。其密度排序依次为：含NPY神经>含CGRP神经>含SP神经。下面进一步叙述各种神经在模拟失重及恢复期的变化。
表1 大鼠脑动脉含NPY神经纤维的密度
(交点数/0.1mm)
Table 1 Density (intercepts/0.1mm) of NPY-containing
nerve fibers supplying the cerebral arteries of rats 动脉
artery
神经纤维
, 百拇医药
fibers
对照组
CON
模拟失重
4周组
SUS-4
恢复1周组
REC-1
大脑前动脉
anterior
cerebral a.
环行(spiral)
, 百拇医药 6.1±0.2
8.2±0.2**
5.0±0.3
纵行(longitudinal)
1.9±0.2
4.2±0.2**
1.5±0.2
总计(total)
7.0±0.2
12.4±0.2**
6.5±0.4
大脑中动脉
, 百拇医药
middle
cerebral a.
环行(spiral)
3.0±0.2
5.3±0.2*
2.8±0.2
纵行(longitudinal)
1.4±0.1
4.6±0.2**
1.2±0.2
总计(total)
4.4±0.2
, http://www.100md.com
10.0±0.2**
4.0±0.1
颈内动脉
internal
carotid a.
环行(spiral)
6.0±0.2
8.0±0.1**
5.0±0.2
纵行(longitudinal)
1.0±0.0
2.0±0.1**
, 百拇医药
1.0±0.1
总计(total)
7.0±0.2
17.0±0.1**
6.0±0.2
大脑后动脉
posterior
cerebral a.
环行(spiral)
2.0±0.2
2.5±0.2**
1.8±0.2
, http://www.100md.com
纵行(longitudinal)
0.7±0.2
2.9±0.2**
0.6±0.2
总计(total)
2.8±0.2
5.4±0.2**
2.4±0.2
小脑上动脉
superior
cerebellar a.
环行(spiral)
, http://www.100md.com
0.6±0.2
1.5±0.2**
0.5±0.2
纵行(longitudinal)
1.0±0.2
2.4±0.2**
1.1±0.2
总计(total)
1.7±0.2
3.9±0.2**
1.6±0.2
基底动脉
, 百拇医药
basilar a.
环行(spiral)
3.1±0.2
3.8±0.3*
2.9±0.1
纵行(longitudinal)
1.9±0.2
2.9±0.2**
1.9±0.2
总计(total)
5.0±0.2
6.7±0.4**
, 百拇医药
4.8±0.2
表中数据为
±。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01Values are
±.*P<0.05，**P<0.01 vs.CON group表2 大鼠脑动脉含CGRP神经纤维的密度(交点数/0.1mm)
Table 2 Density (intercepts/0.1mm) of CGRP-containing
, 百拇医药
nerve fibers supplying the cerebral arteries of rats 动脉
artery
神经纤维
fibers
对照组
CON
模拟失重
4周组
SUS-4
恢复1周组
REC-1
大脑前动脉
, http://www.100md.com
anterior
cerebral a.
环行(spiral)
1.5±0.4
2.3±0.2
2.0±0.0
纵行(longitudinal)
2.3±0.2
4.5±0.4**
3.0±0.5
总计(total)
3.8±0.4
, 百拇医药
6.8±0.5**
5.0±0.3
大脑中动脉
middle
cerebral a.
环行(spiral)
0.7±0.2
1.2±0.2
0.6±0.2
纵行(longitudinal)
1.2±0.3
2.8±0.2**
, 百拇医药
1.3±0.3
总计(total)
1.9±0.2
4.0±0.3**
1.9±0.2
颈内动脉
internal
carotid a.
环行(spiral)
0.4±0.1
0.4±0.1
0.3±0.1
, 百拇医药
纵行(longitudinal)
0.8±0.2
2.4±0.3**
0.7±0.1
总计(total)
1.2±0.1
2.8±0.3**
1.0±0.2
大脑后动脉
posterior
cerebral a.
环行(spiral)
, http://www.100md.com
0.8±0.1
1.2±0.2
0.6±0.1
纵行(longitudinal)
2.0±0.3
3.8±0.3**
2.1±0.1
总计(total)
2.8±0.3
5.0±0.1**
2.7±0.2
小脑上动脉
, 百拇医药
superior
cerebellar a.
环行(spiral)
0.2±0.0
0.3±0.1
0.2±0.0
纵行(longitudinal)
1.0±0.2
2.2±0.3**
0.8±0.1
总计(total)
1.2±0.2
, 百拇医药
2.5±0.3**
1.0±0.1
基底动脉
basilar a.
环行(spiral)
0.4±0.0
0.6±0.1
0.5±0.2
纵行(longitudinal)
1.8±0.2
3.7±0.3**
1.7±0.2
, 百拇医药
总计(total)
2.2±0.1
4.2±0.2**
2.2±0.3
表中数据为
±。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01Values are
±.*P<0.05，**P<0.01 vs.CON group, http://www.100md.com
表3 大鼠脑动脉含SP神经纤维的密度(交点数/0.1mm)
Table 3 Density (intercepts/0.1mm) of SP-containing
nerve fibers supplying the cerebral arteries of rats 动脉
artery
神经纤维
fibers
对照组
CON
模拟失重
4周组
, 百拇医药
SUS-4
恢复1周组
REC-1
大脑前动脉
anterior
cerebral a.
环行(spiral)
0.4±0.1
0.7±0.1
0.4±0.1
纵行(longitudinal)
1.3±0.2
, 百拇医药
2.8±0.2**
1.5±0.2
总计(total)
1.7±0.2
3.6±0.1**
1.8±0.3
大脑中动脉
middle
cerebral a.
环行(spiral)
0.3±0.1
0.4±0.1
, 百拇医药
0.2±0.1
纵行(longitudinal)
0.4±0.1
2.0±0.2**
0.4±0.1
总计(total)
0.7±0.1
2.5±0.3**
0.6±0.1
颈内动脉
internal
carotid a.
, http://www.100md.com
环行(spiral)
0.2±0.1
0.4±0.1
0.1±0.1
纵行(longitudinal)
0.4±0.0
2.2±0.0**
0.4±0.1
总计(total)
0.7±0.1
2.6±0.1**
0.5±0.1
, 百拇医药
大脑后动脉
posterior
cerebral a.
环行(spiral)
0.0±0.0
0.5±0.1**
0.0±0.0
纵行(longitudinal)
0.4±0.1
1.9±0.1**
0.3±0.1
总计(total)
, http://www.100md.com
0.4±0.1
2.4±0.1**
0.3±0.1
小脑上动脉
superior
cerebellar a.
环行(spiral)
0.0±0.0
0.3±0.1**
0.0±0.0
纵行(longitudinal)
0.4±0.1
, 百拇医药
1.2±0.1**
0.4±0.1
总计(total)
0.4±0.1
1.4±0.1**
0.4±0.1
基底动脉
basilar a.
环行(spiral)
0.0±0.0
0.4±0.1**
0.0±0.0
, http://www.100md.com
纵行(longitudinal)
0.4±0.1
1.2±0.1**
0.4±0.1
总计(total)
0.4±0.1
1.5±0.2**
0.4±0.1
表中数据为
±。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01, http://www.100md.com
Values are
±.*P<0.05，**P<0.01 vs.CON group含NPY神经纤维 由表1可见：与CON组相比，SUS-4组各脑动脉上含NPY的纵行、环行神经纤维的密度及总密度均显著高于CON组；REC-1组各段血管含NPY神经纤维的密度与CON间无显著差别。
含CGRP与含SP神经纤维 其密度变化趋势相似。由表2、3可见，与CON组相比，SUS-4各脑动脉上这两种神经纤维的密度亦增高，尤以纵行纤维的密度和总密度为明显。REC-1组各段血管含CGRP、SP神经的密度与CON组间无显著差别。
讨 论
, http://www.100md.com 本工作发现，4周模拟失重可使大鼠脑血管周围3种肽能神经纤维密度显著增高，处于神经支配增强状态；恢复1周后，上述神经支配又转为处于减弱状态或已恢复至对照水平。这些资料首次阐明，脑血管肽能神经支配对模拟失重引起的局部血液动力学改变颇为敏感，并能很快发生不同性质的可塑性变化。
早期工作认为，脑血管只有化学调节。1967年，Nielsen与Owman报道脑血管周围有密集的肾上腺素能神经后，脑血管神经调节的概念才得以建立。应用免疫细胞化学技术，在支配脑血管的神经纤维中已经发现的递质或侯补递质至少有12种，其中包括经典递质如肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺，以及多肽类物质如VIP、NPY、SP、CGRP等。关于脑血管肽能神经的分布、来源、共存、功能等已有较多研究[6,10，11]。脑血管周围神经纤维起源于交感、副交感及感觉-运动神经(sensorimotor n.)。后者主要起源于三叉神经的眼支与上颌支，虽系感觉纤维，但通过“轴突反射”机制对靶组织也具有传出(运动)功能，故被称为“感觉-运动神经”[6]。NPY在脑交感神经纤维中与去甲肾上腺素(NA)共存，在非肾上腺素能神经纤维轴索中，NPY与VIP共存。NPY可引起离体脑动脉环发生浓度依赖性收缩反应。CGRP与SP在感觉-运动神经中共存，可能参与局部“轴突反射”过程。CGRP与SP均对脑血管有扩张作用[6]。
, 百拇医药
总之，脑血管周围交感、副交感和感觉-运动神经纤维及其所含经典递质NA、Ach与多种神经肽类物质共同形成一个复杂的血管紧张度外周调节系统。此外，血管周围神经及其肽类递质对血管平滑肌与内皮的生长和发育过程尚具有慢性的营养作用；可引起脑血管结构发生改变[6,11]。虽已有上述重要发现，但目前对其间的复杂网络关系及精细调节过程还知之甚少。在高血压、糖尿病及衰老研究中均曾考察脑血管肽能神经的改变。对自发性高血压大鼠的研究发现，含NA、含NPY、含CGRP等递质的多种神经纤维均有变化；并提出在高血压发病机理中，交感神经系统对血管的营养性作用增强可能较血压升高因素具有更加重要的意义[6，10]。
由于在航天真实失重环境进行生物医学研究的机会非常难得，且代价高昂，并要受到诸多条件限制难以深入，故失重生物医学研究历来都以大量深入的地面模拟研究与极少量精心设计的航天研究相结合之模式进行。人体地面模拟失重研究主要采用“卧床实验”模拟失重时的体液头向转移及身体低负荷状态。动物地面模拟失重研究现多用大鼠进行，具有经济、易行、可多次重复、能进行多层次整合研究的优点。美国航空航天局(NASA)的Morey-Holton等提出的尾部悬吊大鼠模型较为理想。本实验室又曾改进此模型，将模拟时间延长到120d[7]；并证明模拟失重大鼠可表现类似航天员飞行后心血管失调的现象[12]。
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模拟失重下，大鼠脑血管含NPY、含CGRP及含SP神经所一致表现的支配增强状态正是血管周围神经对局部高跨壁压、高血流量的一种适应性可塑变化。失重/模拟失重下的脑血管神经支配增强可能有三个方面的重要意义：首先，对高跨壁压下维持脑血流稳定可能有一定意义。其次，对防止脑充血及脑水肿可能有保护作用。这可能还与血管周围神经的营养性作用有关。对高血压大鼠的研究发现：含NA神经、含NPY神经的支配增强变化均发生于血管中膜增厚及血压水平升高之前[10]；交感切除虽可使高血压大鼠脑血管中膜增厚程度减轻，但卒中的发病率却升高，血脑屏障通透性增大[10，11]。人在失重时，头面部出现充血、水肿并伴有头痛等不适症状。在悬吊大鼠也观察到眼结膜有充血、水肿。推测还可能与脑血管含SP和CGRP神经的支配增强变化有关。第三，这种神经支配增强状态还可能使中膜增厚的脑血管收缩反应性进一步增强[2，4]，在返回1G环境时易发生脑血管过度收缩。近年对航天员及卧床被试者的观察均提示，脑血管性晕厥始动机制(cerebrovascular syncope-initiating mechanism)在飞行后立位耐力不良发生中的意义不容忽视[1，2]。本实验还发现，解除模拟失重恢复1周后，脑血管神经支配已基本恢复或处于减弱状态。此种变化发生在血管结构完全恢复之前，表明血管神经的营养性作用对中膜增厚血管的逆转也可能有重要意义。
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总之，为期4周(中期)的模拟失重已可引起脑动脉血管周围含NPY、含CGRP及含SP神经支配处于增强状态；但恢复初期上述神经支配又反而处于减弱状态。说明脑动脉周围含NPY、含CGRP及含SP神经支配状态对模拟失重引起的局部血液动力学改变具有高度的可塑性。本工作提示：失重时，脑血管周围神经支配的可塑性变化可能参与脑血管壁重塑的调节过程，对防止脑充血及脑水肿可能具有保护作用；航天失重后，则可能是造成飞行后立位耐力不良的发生机制之一。
感谢刘春同志在论文写作方面给予的大力协作
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39380021)
作者简介：毛秦雯(1968—)，女(汉族)，陕西省人，医学博士，讲师
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【收稿日期】1999-04-20
【修稿日期】1999-10-20, http://www.100md.com