α-二氢麦角隐亭在大鼠缺血性脊髓损伤中作用的探讨
作者：杨松 周长满 鄂玲玲 王雪岷
单位：杨松 周长满 鄂玲玲 王雪岷(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)
关键词：缺血性脊髓损伤；α-二氢麦角隐亭(DHEC)；睫状神经营养因子(CNTF)；免疫组织化学；大鼠
解剖学报000205 【摘要】 目的 探讨α-二氢麦角隐亭DHEC对脊髓损伤后由血管痉挛造成2次神经损伤的保护作用。 方法 对72只Wistar大鼠行阻断腹主动脉25min后再灌流，制备成缺血性脊髓损伤模型。大鼠分成：α-二氢麦角隐亭、海得静、尼莫地平和盐水对照组，分别于药物治疗的3d、7d、14d处死动物，进行CNTF抗体的ABC免疫组织化学染色反应。 结果 脊髓横切片的CNTF免疫反应结果经图像分析和SAS软件处理后表明，在综合对比中，3种药物与对照组相比都具有显著性差异(P=0.0001)；α-二氢麦角隐亭组与海得静组和尼莫地平组的比较也都具有显著性差异(P=0.0001)；而海得静组与尼莫地平组间的比较的差异无显著性(P=0.2631)。 结论 α-二氢麦角隐亭、海得静、尼莫地平都有增强脊髓损伤后脊髓运动神经元的CNTF免疫反应性，而α-二氢麦角隐亭的作用又强于海得静和尼莫地平。探讨α-二氢麦角隐亭DHEC对脊髓损伤后由血管痉挛造成2次神经损伤的保护作用。 方法 对72只Wistar大鼠行阻断腹主动脉25min后再灌流，制备成缺血性脊髓损伤模型。大鼠分成：α-二氢麦角隐亭、海得静、尼莫地平和盐水对照组，分别于药物治疗的3d、7d、14d处死动物，进行CNTF抗体的ABC免疫组织化学染色反应。 结果 脊髓横切片的CNTF免疫反应结果经图像分析和SAS软件处理后表明，在综合对比中，3种药物与对照组相比都具有显著性差异(P=0.0001)；α-二氢麦角隐亭组与海得静组和尼莫地平组的比较也都具有显著性差异(P=0.0001)；而海得静组与尼莫地平组间的比较的差异无显著性(P=0.2631)。 结论 α-二氢麦角隐亭、海得静、尼莫地平都有增强脊髓损伤后脊髓运动神经元的CNTF免疫反应性，而α-二氢麦角隐亭的作用又强于海得静和尼莫地平。
, 百拇医药
【中图分类号】 R322.81 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-116
EFFECTS OF DIHYDROERGOCRYPTINE ON THE NEURONS OF SPINAL CORD AFTER ACUTE ISCHEMIC TRAUMA IN RAT
YANG Song,ZHOU Chang-main,E Ling-ling,WANG Xue-min
(Department of Anatomy,Beijing Medical College of PLA,Beijing 100071,China)
【Abstract】 Objective To observe the effects of dihydrergocryptine(DHEC) on the acute ischemic trauma of spinal cord,for the pharmacological and clinical studies showed that the dihydroergocryptine is effective against the manifestations of cerebral metabolic and circulatory insufficiency. Methods The animal model of spinal cord ischemic trauma was made by following 25min occlusion and re-perfusion of peritoneal aorta above renal artery in 72 Wistar rats.Rats were divided into 4 drug groups:the dihydroergocryptine,hydergine,nimodipine and salt contral groups.After 3、7、14days of administration,the rats were killed and the CNTF antibody's immunohistochemistry was performed. Results It is shown that number and relative data of CNTF immuno-like reactive cells of spinal cord in 3 drug administration group rats were statistical different to control group(P=0.0001)；while the data of DHEC group was also statistically different to the groups of hydergine and nimodipine(P=0.0001);However,there was no statistical different between hydergine and nimodipine groups(P=0.2631). Conclusion Dihydroergocryptine,hydergine,nimodipine effect on the expression of CNTF after the ischemis trauma of spinal cord in the rats,and dihydroergocryptine was more effective than that of hydergine,nimodipine.
, 百拇医药
【Key words】 Ischemic trauma of spinal cord;α-dihydroergocrypine(DHEC);CNTF;immunohistochemistry;Rat
Anthes最新的研究再次证明，脊髓损伤后的血管痉挛是造成神经损伤的主要因素。因为在脊髓损伤后，内源性去甲肾上腺素的增加引起血管的痉挛和随后的脊髓中央缺血性坏死[1]。Zach曾在临床将二氢麦角毒碱(海得静，hydergine)作为治疗脊髓损伤的早期用药[2]。近年来的药理学和临床研究证明：二氢麦角毒碱的提取物——α-二氢麦角隐亭(DHEC)可有效地与脑血管的α肾上腺素受体结合，从而改善微循环，提高脑细胞代谢功能，增加脑内的超氧化物崎化酶(SOD)水平，达到治疗脑缺血症状的目的[3～7]。本研究将α-二氢麦角隐亭用于大鼠急性缺血性脊髓损伤，并以海得静和尼莫地平做药物对照，观察二氢麦角隐亭对脊髓损伤后神经元表达CNTF功能的影响，试图探索临床应用DHEC治疗脊髓损伤的可能性。
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材料和方法
1. 动物模型的制备和动物分组
Wistar大鼠72只，雌雄不枸，体重200g左右，无菌条件下行1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，背部左侧肋缘下正中线旁0.5cm纵切口，腹膜后暴露腹主动脉，于肾动脉上阻断腹主动脉25min后再灌流，制备再灌流缺血模型[8]。动物分DHEC组(20μl/次，bid)、海得静组(20μg,bid)、尼莫地平组(20μg,bid)和生理盐水组，各组动物均以灌胃方式给药，按动物给药后存活3、7、14d分为3个时间亚组，各亚组有动物6只。各时间点动物经心主动脉插管，PBS冲洗，4%多聚甲醛灌注固定，取腰膨大脊髓后固定，常规石蜡包埋、切片(厚4μm)。
2. 组织学和免疫组织化学步骤
石蜡切片分为2组，分别进行常规的Nissl染色和CNTF的免疫组织化学步骤。Nissl染色用于观察存活细胞及坏死细胞的尼氏体变化。免疫组织化学用于观察CNTF的细胞表达和分布。进行免疫组织化学染色的切片经脱蜡复水后入PBS(pH7.4)，经3%双氧水10min，除去内源性过氧化物酶，然后按免疫组织化学ABC法，进行免疫组织化学反应。每只动物的脊髓切片分2组，分别加入CNTF以及对照用的正常血清。CNTF1∶1 000(军事医学科学院基础所)[9]。生物素化的羊抗兔IgG的稀释度为1∶200，ABC复合物的稀释度为1∶100(VECTOR)，在室温下分别孵育1h和30min，然后在0.05%DAB和0.01%双氧水混合液中呈色5～10min。各步骤间均用PBS液漂洗3次，每次10min。
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对照实验：用正常兔血清代替第一抗体，结果为阴性。
3. 计算机图像分析和数据处理
计算机图像分析采用北京航空航天大学图像分析中心和空军总医院生物医学工程研究所研制的CMIAS真彩色病理图像分析系统进行。系统经尺寸定标和密度定标后，采集CNTF反应的各组动物脊髓横断面的整个腹角区域，设定运动神经元免疫组织化学阳性的密度定标，记录每个腹角运动神经元的细胞记数、细胞面积、胞核与胞浆的面积比等参数。各组数据经SAS软件处理，分别做各组之间、每组不同天数之间的显著性检验。
结 果
1. 盐水对照组
Nissl染色在缺血30min再灌注24h显示，部分运动神经元出现轻微的细胞肿胀，尼氏体深染，胞核偏移等。在缺血再灌注3～14d，运动神经元的胞质浓缩，胞浆内出现空洞，尼氏体分解(图1，2)。CNTF反应阳性产物主要出现在腹角的运动神经元和白质内的胶质细胞(图3)。有关CNTF细胞数及相关数据见(表1)。
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表1 脊髓缺血性损伤后盐水对照组大鼠脊髓
腹角CNTF阳性细胞数及相关数据
Table 1 Number and relative data of CNTF
immunoreactive cells of spinal moterneurons
in salt contal croup rats after ischemia trauma 存活、给药
天数
days after
trauma and
administration
, 百拇医药
观察切片数
number of
sliders
平均细胞
数/片
average cell
number
per slider
平均面积
/细胞
average area
of one cell
, 百拇医药
(μ2)
平均核浆比
average of
nucleolus
/plasm
3d
10
7.31+2.75
22.77+2.15
0.10+0.04
7d
10
, 百拇医药
6.18+1.91
22.73+2.29
0.10+0.06
14d
11
4.92+2.07
22.82+2.30
0.07+0.03
总计total
31
6.73+1.58
22.33+0.89
, 百拇医药
0.09+0.02
图1，2 脊髓缺血25min再灌流3d后，盐水对照组脊髓横切片的尼氏染色。运动神经元的胞体和胞核肿胀，细胞质浓缩，核偏移，尼氏体分解。图1 ×20，图2 ×40
Fig.1,2 The Nissl stained spinal cord moterneurons of rats after 3days of reciculation post 30mints of ischemic trauma in salt solution control group.The cell and nucleus were swell,nucleus moves to an eccentric position,the Nissl substance break apart.Fig.1 ×20,Fig.2 ×40
, 百拇医药
图3 脊髓缺血性损伤后3d，盐水对照组动物脊髓横切片的CNTF免疫组织化学反应性细胞 ×4
Fig.3 CNTF positive neurons in spinal cord of control group rats after 3 days of recirculation. ×4
表1的结果显示，在盐水对照组，随着缺血性脊髓损伤后天数的增加脊髓运动神经元的数量是减少，核浆比是降低的，而细胞面积的变化不大。
2. 药物实验组
α-二氢麦角隐亭组，海德静组和尼莫地平组的组织学观察见表2～4。
表2 脊髓缺血性损伤后DHEC组大鼠脊髓
腹角CNTF阳性细胞数及相关数据
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Table 2 Number and relative data of CNTF
immunoreactive cells of spinal moterneurons
in DHEC croup rats after ischemia trauma 存活、给药
天数
days after
trauma and
administration
观察切片数
number of
, http://www.100md.com sliders
平均细胞
数/片
average cell
number
per slider
平均面积
/细胞
average area
of one cell
(μm2)
平均核浆比
, 百拇医药
average of
nucleolus
/plasm
3d
19
13.26+4.33
21.19+0.10
0.10+0.04
7d
2
12.50+0.70
22.78+1.89
, 百拇医药
0.09+0.01
14d
5
7.61+1.14
20.81+3.15
0.09+0.02
总计total
26
11.12+3.07
21.59+1.05
0.09+0.01
表3 脊髓缺血性损伤后海得静组大鼠脊髓
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腹角CNTF阳性细胞数及相关数据
Table 3 Number and relative data of CNTF
immunoreactive cells of spinal moterneurons
in hydergine croup rats after ischemia trauma
存活、给药
天数
days after
trauma and
administration
, 百拇医药
观察切片数
number of
sliders
平均细胞
数/片
average cell
number
per slider
平均面积
/细胞
average area
of one cell
, 百拇医药
(μm2)
平均核浆比
average of
nucleolus
/plams
3d
16
10.31+1.96
23.27+1.78
0.06+0.05
7d
8
, http://www.100md.com
8.63+1.69
20.96+1.45
0.07+0.03
14d
9
6.82+1.78
20.51+1.72
0.09+0.04
总计(total)
33
8.58+1.56
21.59+1.46
, http://www.100md.com
0.07+0.01
表4 脊髓缺血性损伤后尼莫地平组大鼠脊髓
腹角CNTF阳性细胞数及相关数据
Table 4 Number and relative data of CNTF
immunoreactive cells of spinal moterneurons
in nimodipine croup rats after ischemia trauma 存活、给药
天数
days after
trauma and
, 百拇医药
administration
观察切片数
number of
sliders
平均细胞
数/片
average cell
number
per slider
平均面积
/细胞
average area
, http://www.100md.com
of one cell
(μm2)
平均核浆比
average of
nucleolus
/plams
3d
15
11.72+3.39
21.03+0.79
0.06+0.03
7d
, 百拇医药
10
10.64+2.59
22.15+1.74
0.06+0.03
14d
7
9.71+1.60
23.73+2.22
0.06+0.02
总计total
32
10.69+1.32
, 百拇医药
22.30+1.41
0.06+0.01
在3个药物组的各时间点CNTF反应阳性的运动神经元数量均多于对照组(P值均小于0.001)，尤以α-二氢麦角隐亭组的阳性细胞数最多，其细胞形态学接近正常(图4～8)。在每药物组内，从第3d至第14d的细胞数量亦呈逐渐减少之势；而平均细胞面积和细胞的核浆比无明显变化。
图4，5 脊髓缺血性损伤后14d，DHEC组动物脊髓横切片的CNTF免疫组织化学反应性细胞。图4 ×4，图5 ×20
Fig.4.5 CNTF positive neurons in spinal cord of DHEC group rats after 14 days of recirculation.Fig.4 ×4,Fig.5 ×20
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图6，7 脊髓缺血性损伤后14d,hydergine组动物脊髓横切片的CNTF免疫组织化学反应性细胞。图6 ×4，图7 ×20
Fig.6,7 CNTF positive neurons in spinal cord of hydergine group rats after 14 days of recirculation.Fig.6 ×4, Fig.7 ×20
图8 脊髓缺血性损伤后14d,nimodipine组动物脊髓横切片的CNTF免疫组织化学反应性细胞 ×20
Fig.8 CNTF positive neurons in spinal cord of nimodipine group rats after 14 days of recirculation. ×20
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3. 各组间CNTF阳性细胞的多因素综合对比
α-二氢麦角隐亭组、海得静组、尼莫地平组和盐水对照组的在3d、7d和14d，对CNTF阳性细胞的计数、细胞面积及核浆比用SAS软件进行综合比较的结果见表5。
表5的综合对比显示，3种药物与对照组相比都具有显著性差异，α-二氢麦角隐亭组与海得静组和尼莫地平组的比较也都具有显著性差异，而海得静组与尼莫地平组间的比较则无差异。
表5 α-二氢麦角隐亭组、海得静组和尼莫地平组在
服药后3h-14d内对CNTF阳性细胞的计数、细胞面积及核浆比的综合比较
Table 5 Comprehensive comparison of CNTF
immunoreactive cells from 3-14d in DHEC、hydergine and nimodipine goups 组间对比
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compare between groups
威尔克斯
兰姆达检验
Wilks'Λ
F值
F value
P值
P value
salt contral/DHEC
0.625
28.43
0.0 001
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salt contral/hydergine
0.859
7.78
0.0 001
salt contal/nimodipine
0.768
14.35
0.0 001
DHEC/hydergine
0.772
14.07
0.0 001
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DHEC/nimodipine
0.845
8.67
0.0 001
hydergine/nimodipine
0.972
1.34
0.2 631
averagr
0.554
10.60
0.0 001
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讨 论
动物实验发现，脊髓损伤后所引发的血管收缩可导致脊髓的血供降低80%，引起脊髓的中心缺血性坏死。因此，脊髓损伤后的血管收缩被认为是脊髓二次损伤的主要原因[1]。对脊髓损伤应用扩血管的药物从理论和实验中都得到认可。实验研究曾用抑制去甲肾上腺素的合成药物，如α-甲基酪氨酸和利血平等，以及阻断去甲肾上腺素受体的药物，如苯氧卞胺等都有一定的效果[10～12]，这也从反面证明，去甲肾上腺素引起的血管反应是脊髓二次损伤的主要原因之一[13，14]。本研究观察了α-二氢麦角隐亭及其前体海得静(α-二氢麦角毒碱)和钙通道拮抗剂-尼莫地平对缺血性脊髓损伤的影响。从它们的药理作用分析，麦角毒碱类药物主要是与外周血管平滑肌的α受体特异地结合，从而阻断肾上腺能神经的缩血管支配，达到扩展血管的作用[3]，Zach就曾在临床将二氢麦角毒碱(海得静，hydergine)作为治疗脊髓损伤的早期用药[2]。最新药理学的研究表明，α-二氢麦角隐亭与肾上腺α受体的结合明显高于α-二氢麦角毒碱和其他的3个亚单体：二氢麦角柯宁碱、二氢麦角可碱和β-二氢麦角隐亭。α-二氢麦角隐亭由于它的高亲和力，可有效地与脑血管的α-肾上腺素受体结合，从而改善微循环，提高脑细胞代谢功能，增加脑内的SOD水平，达到治疗脑缺血症状的目的[4～6]，但对脊髓损伤中的应用还未见报道。从药理学推测，α-二氢麦角隐亭可有效地减轻肾上腺素作用的缩血管反应，减少脊髓中央缺血性坏死，提高脊髓内的SOD水平，促进自由基的消除，从而减轻脂质过氧化对脊髓组织和毛细血管内皮的损害，维护细胞膜Na+K+-ATP酶的活性和细胞膜的功能，达到对神经的保护作用。
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CNTF在神经系统有广泛的分布，能促进包括运动神经元在内的多种神经元的存活，而运动神经元对CNTF表达的情况则可反应出神经元的功能状态。从本实验的结果来看，α-二氢麦角隐亭组与海得静组和尼莫地平组在脊髓缺血性损伤后的3～14d，CNTF免疫组织化学反应性的脊髓腹角运动神经元的数量明显地多于对照组(P值均小于0.001)，说明在缺血性脊髓损伤中对神经细胞的保护作用上，α-二氢麦角隐亭、海得静和尼莫地平都有提高脊髓运动神经元表达CNTF的作用，这可能是不同的舒血管药物抑制了脊髓损伤后的血管痉挛，减轻了因血管收缩引起的脊髓二次损伤，有利于CNTF发挥保护神经元和促进脊髓修复的作用。而α-二氢麦角隐亭组的CNTF阳性细胞又明显地多于海得静组和尼莫地平组(P值小于0.0001)，从其药理作用上分析，可能是由于α-二氢麦角隐亭能更有效地阻滞了α-肾上腺素受体，更好地改善了脊髓的微循环，还有可能是提高了脊髓内的SOD水平，促进自由基的消除，提供了更好的脊髓再生的微环境。
【基金项目】全军医学重点实验室科研基金资助项目(1997-71-21)
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作者简介：杨松(1963—)，男(汉族)，辽宁省盖县人，硕士，讲师
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【收稿日期】1999-03-09
【修稿日期】1999-06-08, 百拇医药
单位：杨松 周长满 鄂玲玲 王雪岷(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)
关键词：缺血性脊髓损伤；α-二氢麦角隐亭(DHEC)；睫状神经营养因子(CNTF)；免疫组织化学；大鼠
解剖学报000205 【摘要】 目的 探讨α-二氢麦角隐亭DHEC对脊髓损伤后由血管痉挛造成2次神经损伤的保护作用。 方法 对72只Wistar大鼠行阻断腹主动脉25min后再灌流，制备成缺血性脊髓损伤模型。大鼠分成：α-二氢麦角隐亭、海得静、尼莫地平和盐水对照组，分别于药物治疗的3d、7d、14d处死动物，进行CNTF抗体的ABC免疫组织化学染色反应。 结果 脊髓横切片的CNTF免疫反应结果经图像分析和SAS软件处理后表明，在综合对比中，3种药物与对照组相比都具有显著性差异(P=0.0001)；α-二氢麦角隐亭组与海得静组和尼莫地平组的比较也都具有显著性差异(P=0.0001)；而海得静组与尼莫地平组间的比较的差异无显著性(P=0.2631)。 结论 α-二氢麦角隐亭、海得静、尼莫地平都有增强脊髓损伤后脊髓运动神经元的CNTF免疫反应性，而α-二氢麦角隐亭的作用又强于海得静和尼莫地平。探讨α-二氢麦角隐亭DHEC对脊髓损伤后由血管痉挛造成2次神经损伤的保护作用。 方法 对72只Wistar大鼠行阻断腹主动脉25min后再灌流，制备成缺血性脊髓损伤模型。大鼠分成：α-二氢麦角隐亭、海得静、尼莫地平和盐水对照组，分别于药物治疗的3d、7d、14d处死动物，进行CNTF抗体的ABC免疫组织化学染色反应。 结果 脊髓横切片的CNTF免疫反应结果经图像分析和SAS软件处理后表明，在综合对比中，3种药物与对照组相比都具有显著性差异(P=0.0001)；α-二氢麦角隐亭组与海得静组和尼莫地平组的比较也都具有显著性差异(P=0.0001)；而海得静组与尼莫地平组间的比较的差异无显著性(P=0.2631)。 结论 α-二氢麦角隐亭、海得静、尼莫地平都有增强脊髓损伤后脊髓运动神经元的CNTF免疫反应性，而α-二氢麦角隐亭的作用又强于海得静和尼莫地平。
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【中图分类号】 R322.81 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-116
EFFECTS OF DIHYDROERGOCRYPTINE ON THE NEURONS OF SPINAL CORD AFTER ACUTE ISCHEMIC TRAUMA IN RAT
YANG Song,ZHOU Chang-main,E Ling-ling,WANG Xue-min
(Department of Anatomy,Beijing Medical College of PLA,Beijing 100071,China)
【Abstract】 Objective To observe the effects of dihydrergocryptine(DHEC) on the acute ischemic trauma of spinal cord,for the pharmacological and clinical studies showed that the dihydroergocryptine is effective against the manifestations of cerebral metabolic and circulatory insufficiency. Methods The animal model of spinal cord ischemic trauma was made by following 25min occlusion and re-perfusion of peritoneal aorta above renal artery in 72 Wistar rats.Rats were divided into 4 drug groups:the dihydroergocryptine,hydergine,nimodipine and salt contral groups.After 3、7、14days of administration,the rats were killed and the CNTF antibody's immunohistochemistry was performed. Results It is shown that number and relative data of CNTF immuno-like reactive cells of spinal cord in 3 drug administration group rats were statistical different to control group(P=0.0001)；while the data of DHEC group was also statistically different to the groups of hydergine and nimodipine(P=0.0001);However,there was no statistical different between hydergine and nimodipine groups(P=0.2631). Conclusion Dihydroergocryptine,hydergine,nimodipine effect on the expression of CNTF after the ischemis trauma of spinal cord in the rats,and dihydroergocryptine was more effective than that of hydergine,nimodipine.
, 百拇医药
【Key words】 Ischemic trauma of spinal cord;α-dihydroergocrypine(DHEC);CNTF;immunohistochemistry;Rat
Anthes最新的研究再次证明，脊髓损伤后的血管痉挛是造成神经损伤的主要因素。因为在脊髓损伤后，内源性去甲肾上腺素的增加引起血管的痉挛和随后的脊髓中央缺血性坏死[1]。Zach曾在临床将二氢麦角毒碱(海得静，hydergine)作为治疗脊髓损伤的早期用药[2]。近年来的药理学和临床研究证明：二氢麦角毒碱的提取物——α-二氢麦角隐亭(DHEC)可有效地与脑血管的α肾上腺素受体结合，从而改善微循环，提高脑细胞代谢功能，增加脑内的超氧化物崎化酶(SOD)水平，达到治疗脑缺血症状的目的[3～7]。本研究将α-二氢麦角隐亭用于大鼠急性缺血性脊髓损伤，并以海得静和尼莫地平做药物对照，观察二氢麦角隐亭对脊髓损伤后神经元表达CNTF功能的影响，试图探索临床应用DHEC治疗脊髓损伤的可能性。
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材料和方法
1. 动物模型的制备和动物分组
Wistar大鼠72只，雌雄不枸，体重200g左右，无菌条件下行1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，背部左侧肋缘下正中线旁0.5cm纵切口，腹膜后暴露腹主动脉，于肾动脉上阻断腹主动脉25min后再灌流，制备再灌流缺血模型[8]。动物分DHEC组(20μl/次，bid)、海得静组(20μg,bid)、尼莫地平组(20μg,bid)和生理盐水组，各组动物均以灌胃方式给药，按动物给药后存活3、7、14d分为3个时间亚组，各亚组有动物6只。各时间点动物经心主动脉插管，PBS冲洗，4%多聚甲醛灌注固定，取腰膨大脊髓后固定，常规石蜡包埋、切片(厚4μm)。
2. 组织学和免疫组织化学步骤
石蜡切片分为2组，分别进行常规的Nissl染色和CNTF的免疫组织化学步骤。Nissl染色用于观察存活细胞及坏死细胞的尼氏体变化。免疫组织化学用于观察CNTF的细胞表达和分布。进行免疫组织化学染色的切片经脱蜡复水后入PBS(pH7.4)，经3%双氧水10min，除去内源性过氧化物酶，然后按免疫组织化学ABC法，进行免疫组织化学反应。每只动物的脊髓切片分2组，分别加入CNTF以及对照用的正常血清。CNTF1∶1 000(军事医学科学院基础所)[9]。生物素化的羊抗兔IgG的稀释度为1∶200，ABC复合物的稀释度为1∶100(VECTOR)，在室温下分别孵育1h和30min，然后在0.05%DAB和0.01%双氧水混合液中呈色5～10min。各步骤间均用PBS液漂洗3次，每次10min。
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对照实验：用正常兔血清代替第一抗体，结果为阴性。
3. 计算机图像分析和数据处理
计算机图像分析采用北京航空航天大学图像分析中心和空军总医院生物医学工程研究所研制的CMIAS真彩色病理图像分析系统进行。系统经尺寸定标和密度定标后，采集CNTF反应的各组动物脊髓横断面的整个腹角区域，设定运动神经元免疫组织化学阳性的密度定标，记录每个腹角运动神经元的细胞记数、细胞面积、胞核与胞浆的面积比等参数。各组数据经SAS软件处理，分别做各组之间、每组不同天数之间的显著性检验。
结 果
1. 盐水对照组
Nissl染色在缺血30min再灌注24h显示，部分运动神经元出现轻微的细胞肿胀，尼氏体深染，胞核偏移等。在缺血再灌注3～14d，运动神经元的胞质浓缩，胞浆内出现空洞，尼氏体分解(图1，2)。CNTF反应阳性产物主要出现在腹角的运动神经元和白质内的胶质细胞(图3)。有关CNTF细胞数及相关数据见(表1)。
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表1 脊髓缺血性损伤后盐水对照组大鼠脊髓
腹角CNTF阳性细胞数及相关数据
Table 1 Number and relative data of CNTF
immunoreactive cells of spinal moterneurons
in salt contal croup rats after ischemia trauma 存活、给药
天数
days after
trauma and
administration
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观察切片数
number of
sliders
平均细胞
数/片
average cell
number
per slider
平均面积
/细胞
average area
of one cell
, 百拇医药
(μ2)
平均核浆比
average of
nucleolus
/plasm
3d
10
7.31+2.75
22.77+2.15
0.10+0.04
7d
10
, 百拇医药
6.18+1.91
22.73+2.29
0.10+0.06
14d
11
4.92+2.07
22.82+2.30
0.07+0.03
总计total
31
6.73+1.58
22.33+0.89
, 百拇医药
0.09+0.02
图1，2 脊髓缺血25min再灌流3d后，盐水对照组脊髓横切片的尼氏染色。运动神经元的胞体和胞核肿胀，细胞质浓缩，核偏移，尼氏体分解。图1 ×20，图2 ×40
Fig.1,2 The Nissl stained spinal cord moterneurons of rats after 3days of reciculation post 30mints of ischemic trauma in salt solution control group.The cell and nucleus were swell,nucleus moves to an eccentric position,the Nissl substance break apart.Fig.1 ×20,Fig.2 ×40
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图3 脊髓缺血性损伤后3d，盐水对照组动物脊髓横切片的CNTF免疫组织化学反应性细胞 ×4
Fig.3 CNTF positive neurons in spinal cord of control group rats after 3 days of recirculation. ×4
表1的结果显示，在盐水对照组，随着缺血性脊髓损伤后天数的增加脊髓运动神经元的数量是减少，核浆比是降低的，而细胞面积的变化不大。
2. 药物实验组
α-二氢麦角隐亭组，海德静组和尼莫地平组的组织学观察见表2～4。
表2 脊髓缺血性损伤后DHEC组大鼠脊髓
腹角CNTF阳性细胞数及相关数据
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Table 2 Number and relative data of CNTF
immunoreactive cells of spinal moterneurons
in DHEC croup rats after ischemia trauma 存活、给药
天数
days after
trauma and
administration
观察切片数
number of
, http://www.100md.com sliders
平均细胞
数/片
average cell
number
per slider
平均面积
/细胞
average area
of one cell
(μm2)
平均核浆比
, 百拇医药
average of
nucleolus
/plasm
3d
19
13.26+4.33
21.19+0.10
0.10+0.04
7d
2
12.50+0.70
22.78+1.89
, 百拇医药
0.09+0.01
14d
5
7.61+1.14
20.81+3.15
0.09+0.02
总计total
26
11.12+3.07
21.59+1.05
0.09+0.01
表3 脊髓缺血性损伤后海得静组大鼠脊髓
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腹角CNTF阳性细胞数及相关数据
Table 3 Number and relative data of CNTF
immunoreactive cells of spinal moterneurons
in hydergine croup rats after ischemia trauma
存活、给药
天数
days after
trauma and
administration
, 百拇医药
观察切片数
number of
sliders
平均细胞
数/片
average cell
number
per slider
平均面积
/细胞
average area
of one cell
, 百拇医药
(μm2)
平均核浆比
average of
nucleolus
/plams
3d
16
10.31+1.96
23.27+1.78
0.06+0.05
7d
8
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8.63+1.69
20.96+1.45
0.07+0.03
14d
9
6.82+1.78
20.51+1.72
0.09+0.04
总计(total)
33
8.58+1.56
21.59+1.46
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0.07+0.01
表4 脊髓缺血性损伤后尼莫地平组大鼠脊髓
腹角CNTF阳性细胞数及相关数据
Table 4 Number and relative data of CNTF
immunoreactive cells of spinal moterneurons
in nimodipine croup rats after ischemia trauma 存活、给药
天数
days after
trauma and
, 百拇医药
administration
观察切片数
number of
sliders
平均细胞
数/片
average cell
number
per slider
平均面积
/细胞
average area
, http://www.100md.com
of one cell
(μm2)
平均核浆比
average of
nucleolus
/plams
3d
15
11.72+3.39
21.03+0.79
0.06+0.03
7d
, 百拇医药
10
10.64+2.59
22.15+1.74
0.06+0.03
14d
7
9.71+1.60
23.73+2.22
0.06+0.02
总计total
32
10.69+1.32
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22.30+1.41
0.06+0.01
在3个药物组的各时间点CNTF反应阳性的运动神经元数量均多于对照组(P值均小于0.001)，尤以α-二氢麦角隐亭组的阳性细胞数最多，其细胞形态学接近正常(图4～8)。在每药物组内，从第3d至第14d的细胞数量亦呈逐渐减少之势；而平均细胞面积和细胞的核浆比无明显变化。
图4，5 脊髓缺血性损伤后14d，DHEC组动物脊髓横切片的CNTF免疫组织化学反应性细胞。图4 ×4，图5 ×20
Fig.4.5 CNTF positive neurons in spinal cord of DHEC group rats after 14 days of recirculation.Fig.4 ×4,Fig.5 ×20
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图6，7 脊髓缺血性损伤后14d,hydergine组动物脊髓横切片的CNTF免疫组织化学反应性细胞。图6 ×4，图7 ×20
Fig.6,7 CNTF positive neurons in spinal cord of hydergine group rats after 14 days of recirculation.Fig.6 ×4, Fig.7 ×20
图8 脊髓缺血性损伤后14d,nimodipine组动物脊髓横切片的CNTF免疫组织化学反应性细胞 ×20
Fig.8 CNTF positive neurons in spinal cord of nimodipine group rats after 14 days of recirculation. ×20
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3. 各组间CNTF阳性细胞的多因素综合对比
α-二氢麦角隐亭组、海得静组、尼莫地平组和盐水对照组的在3d、7d和14d，对CNTF阳性细胞的计数、细胞面积及核浆比用SAS软件进行综合比较的结果见表5。
表5的综合对比显示，3种药物与对照组相比都具有显著性差异，α-二氢麦角隐亭组与海得静组和尼莫地平组的比较也都具有显著性差异，而海得静组与尼莫地平组间的比较则无差异。
表5 α-二氢麦角隐亭组、海得静组和尼莫地平组在
服药后3h-14d内对CNTF阳性细胞的计数、细胞面积及核浆比的综合比较
Table 5 Comprehensive comparison of CNTF
immunoreactive cells from 3-14d in DHEC、hydergine and nimodipine goups 组间对比
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compare between groups
威尔克斯
兰姆达检验
Wilks'Λ
F值
F value
P值
P value
salt contral/DHEC
0.625
28.43
0.0 001
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salt contral/hydergine
0.859
7.78
0.0 001
salt contal/nimodipine
0.768
14.35
0.0 001
DHEC/hydergine
0.772
14.07
0.0 001
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DHEC/nimodipine
0.845
8.67
0.0 001
hydergine/nimodipine
0.972
1.34
0.2 631
averagr
0.554
10.60
0.0 001
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讨 论
动物实验发现，脊髓损伤后所引发的血管收缩可导致脊髓的血供降低80%，引起脊髓的中心缺血性坏死。因此，脊髓损伤后的血管收缩被认为是脊髓二次损伤的主要原因[1]。对脊髓损伤应用扩血管的药物从理论和实验中都得到认可。实验研究曾用抑制去甲肾上腺素的合成药物，如α-甲基酪氨酸和利血平等，以及阻断去甲肾上腺素受体的药物，如苯氧卞胺等都有一定的效果[10～12]，这也从反面证明，去甲肾上腺素引起的血管反应是脊髓二次损伤的主要原因之一[13，14]。本研究观察了α-二氢麦角隐亭及其前体海得静(α-二氢麦角毒碱)和钙通道拮抗剂-尼莫地平对缺血性脊髓损伤的影响。从它们的药理作用分析，麦角毒碱类药物主要是与外周血管平滑肌的α受体特异地结合，从而阻断肾上腺能神经的缩血管支配，达到扩展血管的作用[3]，Zach就曾在临床将二氢麦角毒碱(海得静，hydergine)作为治疗脊髓损伤的早期用药[2]。最新药理学的研究表明，α-二氢麦角隐亭与肾上腺α受体的结合明显高于α-二氢麦角毒碱和其他的3个亚单体：二氢麦角柯宁碱、二氢麦角可碱和β-二氢麦角隐亭。α-二氢麦角隐亭由于它的高亲和力，可有效地与脑血管的α-肾上腺素受体结合，从而改善微循环，提高脑细胞代谢功能，增加脑内的SOD水平，达到治疗脑缺血症状的目的[4～6]，但对脊髓损伤中的应用还未见报道。从药理学推测，α-二氢麦角隐亭可有效地减轻肾上腺素作用的缩血管反应，减少脊髓中央缺血性坏死，提高脊髓内的SOD水平，促进自由基的消除，从而减轻脂质过氧化对脊髓组织和毛细血管内皮的损害，维护细胞膜Na+K+-ATP酶的活性和细胞膜的功能，达到对神经的保护作用。
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CNTF在神经系统有广泛的分布，能促进包括运动神经元在内的多种神经元的存活，而运动神经元对CNTF表达的情况则可反应出神经元的功能状态。从本实验的结果来看，α-二氢麦角隐亭组与海得静组和尼莫地平组在脊髓缺血性损伤后的3～14d，CNTF免疫组织化学反应性的脊髓腹角运动神经元的数量明显地多于对照组(P值均小于0.001)，说明在缺血性脊髓损伤中对神经细胞的保护作用上，α-二氢麦角隐亭、海得静和尼莫地平都有提高脊髓运动神经元表达CNTF的作用，这可能是不同的舒血管药物抑制了脊髓损伤后的血管痉挛，减轻了因血管收缩引起的脊髓二次损伤，有利于CNTF发挥保护神经元和促进脊髓修复的作用。而α-二氢麦角隐亭组的CNTF阳性细胞又明显地多于海得静组和尼莫地平组(P值小于0.0001)，从其药理作用上分析，可能是由于α-二氢麦角隐亭能更有效地阻滞了α-肾上腺素受体，更好地改善了脊髓的微循环，还有可能是提高了脊髓内的SOD水平，促进自由基的消除，提供了更好的脊髓再生的微环境。
【基金项目】全军医学重点实验室科研基金资助项目(1997-71-21)
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作者简介：杨松(1963—)，男(汉族)，辽宁省盖县人，硕士，讲师
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【收稿日期】1999-03-09
【修稿日期】1999-06-08, 百拇医药