大鼠睾丸前促甲状腺激素释放激素及其受体cDNA的克隆和序列测定
作者：李臻 刘新平 张远强
单位：李臻 张远强(第四军医大学组织学胚胎学教研室)；刘新平(生物化学与分子生物学教研室，西安 710032)
关键词：前促甲状腺激素释放激素(ppTRH)；促甲状腺激素释放激素受体(TRH-R)；反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；睾丸；大鼠
解剖学报000224 【摘要】 目的 研究促甲状腺激素释放激素(thyrotrophin-releasing hormone, TRH)及其受体(TRH receptor,TRH-R)在大鼠睾丸组织中的表达规律和在生殖发育调节中的作用。 方法 以大鼠睾丸组织总RNA为模板，依据大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA设计引物，进行反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)，对特异性片段进行序列测定。 结果 从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA片段，其核苷酸序列与大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA序列完全一致。 结论 首次用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA克隆。研究促甲状腺激素释放激素(thyrotrophin-releasing hormone, TRH)及其受体(TRH receptor,TRH-R)在大鼠睾丸组织中的表达规律和在生殖发育调节中的作用。 方法 以大鼠睾丸组织总RNA为模板，依据大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA设计引物，进行反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)，对特异性片段进行序列测定。 结果 从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA片段，其核苷酸序列与大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA序列完全一致。 结论 首次用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA克隆。
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【中图分类号】 R329 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-186
CLONING AND SEQUENCING OF PREPROTHYROTROPIN-RELEASING HORMONE AND ITS RECEPTOR IN THE RAT TESTIS
LI Zhen,ZHANG Yuan-qiang
(Department of Histology and Embryology; )
LIU Xin-ping,(Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective In order to investigate the expression regulation of thyro
trophin-releasing hormone(TRH) and TRH receptor (TRH-R) in rat testis, and their func
tion in production and development. Methods Total RNA of rat testis was used as temp
late. The oligonucleotide primers were designed from the sequence of rat hypothalamus prepro(pp)TRH and pituitary TRH-R cDNA for Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Specific fragments of ppTRH and TRH-R cDNA were cloned and sequenced. Results DNA sequence analysis indicated that cDNA sequences of ppTRH and TRH-R from rat testis were consistent with those of hypothalamus ppTRH and pituitary TRH-R cDNA. Conclusions It is the first time to acquire the cDNA cloning of ppTRH and TRH-R from rat testis by RT-PCR.
, 百拇医药
【Key words】 Thyrotrophin-releasing hormone(TRH); Thyrotrophin-releasing hormone receptor(TRH-R); Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR); Testis; Rat
促甲状腺激素释放激素(thyrotrophin-releasing hormone,TRH)最初是从羊和猪的下丘脑中提取并分离纯化的3肽。TRH与垂体前叶促甲状腺激素细胞表面特异性受体结合，刺激促甲状腺激素(TSH)的合成和分泌。应用放射免疫分析，发现具有免疫活性的TRH不仅存在于下丘脑以外的中枢神经系统中，而且广泛分布于外周组织，包括胃肠道、胰腺、肾上腺、胎盘和男性生殖系统[1]。而且也发现下丘脑的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、生长激素释放激素(GHRH)、前阿片促黑激素皮质素(POMC)等神经肽也存在于睾丸组织中，并对精子的分化发育起到重要调控作用。以后证实在中枢神经系统，TRH作为神经递质或神经调质与神经细胞表面受体结合，这种受体的cDNA序列与垂体前叶TRH-R的cDNA类似。免疫组织化学证明TRH定位于大鼠睾丸间质细胞，近期我们应用原位杂交观察到小鼠睾丸间质细胞可特异性表达TRH-R mRNA[2，3]，说明睾丸间质细胞可合成TRH和TRH-R，鉴于免疫组织化学和原位杂交技术的局限性，我们通过分子生物学技术进一步证实这一发现。为系统地研究TRH和TRH-R在哺乳动物睾丸中的存在意义。我们应用RT-PCR技术从大鼠睾丸组织中成功地获得了前TRH和TRH-R的cDNA克隆，得到了分别与下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R序列相同的基因产物，为后续研究奠定了基础。现报道如下：
, 百拇医药
材料和方法
1.大鼠睾丸组织总RNA的制备
成年雄性SD大鼠，体重200～240g，由本校动物实验中心提供。断头法处死大鼠后，迅速取出睾丸组织，去被膜，称重，剪碎，异硫氰酸胍一步法提取睾丸组织总RNA(TriPure Isolation Reagent,Promega)。用紫外分光光度计测定RNA的纯度及含量。
2.PCR引物的设计
前TRH和TRH-R的引物序列根据已发表的大鼠下丘脑前TRH、GH3垂体肿瘤细胞TRH-R cDNA的序列[4，5]设计而成，引物序列如附表所示。P1和P5的5′端均加有EcoRI酶切位点，P2和P6的5′端均加有BamHI酶切位点。
附表 引物序列及RT-PCR产物大小
, 百拇医药
Table Primer sequence and sizes of RT-PCR produts 引物(primer)
序列(sequence)
位置(position)
前TRH(ppTRH)
P1：5′CGGAATTCCACTCTTCAGCTCAGCATCTTG 3′
Bp 44-65
P2：5′CGGGATCCTTACTCCTCCAGAGGTTCCTTGT 3′
Bp 848-870(827bp)
TRH-R
, 百拇医药
P3：5′ACCACCTCTAGATCTTTCAACAGC 3′
Bp 834-857
外(outer)
P4：5′AGGTATTCTAGAGGAAGTTCATAT 3′
Bp 1323-1346(513bp)
内(inner)
P5：5′CGGAATTCAGGAAGCAGGTCACCAAG 3′
Bp 870-887
P6：5′CGGGATCCCTCAGAGGCCAAGCAGGT 3′
, 百拇医药
Bp 1248-1265(396bp)
3.RT-PCR
取10μg睾丸组织总RNA，4μl 25mmol/L MgCl2，2μl 10×逆转录缓冲液，2μl 10mmol/L dNTP,0.5μl RNA酶抑制剂，15U AMV逆转录酶，0.5μg oligo(dT)15引物，加DEPC处理的H2O至总反应体积20μl，42℃温浴20min，合成cDNA第1链。99℃ 5min终止反应，0～5℃ 5min复性。用上述3对引物分别对TRH和TRH-R进行PCR。前TRH：P1和P2，94℃ 30s，53℃ 90s，72℃ 90s 30个循环。TRH-R：用2对寡核苷酸引物进行“巢式”PCR。先用外引物P3和P4对反转录后的cDNA进行扩增，94℃ 1min，52℃ 2min，72℃ 2min 30个循环。经1.5%琼脂糖凝胶电泳获得500bp的片段，胶中片段回收后再用内引物P5和P6扩增，94℃ 30s，48℃ 1min，72℃ 1min 30个循环。用不含cDNA模板的PCR反应体系作为阴性对照，以排除反应操作中DNA污染。取PCR产物各10μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色。从而获得大鼠前TRH和TRH-R的特异性cDNA片段。
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4.特异性片段的克隆及序列测定
将前TRH和TRH-R PCR产物从凝胶中回收，用EcoRI和BamHI双酶切，定向插入PUC19载体中。连接反应后，转化大肠杆菌JM109感受态细胞；经转化后的大肠杆菌铺于含氨苄青霉素的LB琼脂板上，在37℃中过夜培养。从中随机挑选4个克隆，用碱裂解法提取质粒DNA，用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行酶切和电泳分析，获得有插入片段的重组质粒，用全自动双脱氧终止法进行正、反两向序列测定(perkin elmer)。结果和讨论
对所设计的特定引物进行RT-PCR扩增后，产物均显示为1条特异性的扩增带(图1)，分别获得编码大鼠睾丸组织前TRH 827bp片段和编码大鼠睾丸组织TRH-R 396bp片段，与设计方案一致。重组质粒用EcoRI和BamHI双酶切分析鉴定，显示有827bp和396bp的目的基因片段，说明PCR产物克隆成功(图2)。测序结果表明，从大鼠睾丸组织中获得的前TRH和TRH-R cDNA序列分别与大鼠下丘脑中的前TRH cDNA序列和GH3垂体肿瘤细胞中的TRH-R cDNA序列完全一致(图3)。
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图1 电泳鉴定PCR产物：1.PCR Maker;2.前TRH PCR产物：827bp；3.TRH-R PCR产物：396bp；4.不含模板的PCR反应混合物
Fig.1 The electrophoretic analysis for PCR product:1.PCR Marker; 2.ppTRH PCR production:827bp;
3.TRH-R PCR production:396bp; 4.PCR mixture without template cDNA
图2 酶切图谱鉴定重组体：1.PCR Maker;2.PUC-pp TRH/EcoRI,BamHI双酶切，产生2.686kb和827bp片段；
, http://www.100md.com 3.PUC-TRH-R/EcoR I，BamH I双酶切，产生2.686kb和396bp片段；4.未经酶切的重组质粒
Fig.2 The electrophoretic analysis for reconstruction:1.PCR Marker;PUC-ppTRH/EcoRI,BamHI 2.686kb and 827bp fragments;
3.PUC-TRH-R/EcoRI,BamHI 2.686kb and 396bp fragments;4.Recombinant plasmid without enzyme digestion.
图3 测序结果：1.大鼠睾丸中的前TRH cDNA序列及其与下丘脑中的前TRH序列的比较；
, 百拇医药
2.大鼠睾丸中的TRH-R序列及其与GH3垂体肿瘤细胞中的TRH-R序列的比较
Fig.3 Sequencing results: 1.Comparision of the cDNA sequence of rat testis ppTRH with that of the hypothalamus ppTRH;
2.Comparision of the cDNA sequence of rat testis TRH-R with that of the pituitary TRH-R.
哺乳类动物生殖细胞的发育及其调控一直是发育生殖学的前沿课题，近年的研究表明，雄性生殖细胞发育除受到下丘脑-垂体-性腺轴的神经内分泌调控外，还受到睾丸局部组织细胞之间的相互调节[9]。近年来，人们发现睾丸含有多种神经肽，包括促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、生长激素释放激素(GHRH)、前阿片促黑激素皮质素(POMC)、生长抑素(SS)、促胃泌素释放肽、心房利钠尿多肽和胆囊收缩素等，但这些神经肽在睾丸中的生理作用至今仍不清楚。
, 百拇医药
本实验应用RT-PCR技术首次从大鼠睾丸组织中分别获得了前TRH和TRH-R的cDNA片段，并经克隆和序列分析证明与下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R具有相同的序列，进一步在分子生物学水平上验证了免疫组织化学及原位杂交的发现，并为前TRH和TRH-R mRNA在大鼠睾丸组织中的表达提供了新证据，说明睾丸组织中的TRH来源于与下丘脑中的前TRH类似的前导物。这一结果结合我们前期的研究工作充分证实大鼠睾丸组织具有合成TRH和TRH-R的功能，其合成细胞为间质细胞，但仍不排除支持细胞和各级生精细胞表达TRH和TRH-R的可能性。后续的研究工作将通过对纯化的间质细胞、支持细胞和各级生精细胞的RT-PCR的检测进一步证实。本实验的发现说明睾丸生殖细胞的发育存在相当复杂的局部调节机制。这种局部调节，可能通过细胞间的直接作用，或通过自分泌或旁分泌激素和细胞因子的方式来实现。大鼠睾丸间质细胞表达TRH和TRH-R的意义现仍不清楚，猜测睾丸中的TRH可能通过自分泌或旁分泌途径与细胞膜表面特异性受体蛋白发挥作用，其作用与睾酮的产生和分泌调节有关。由于本实验获得的前TRH cDNA片段含有TRH的整个编码区(从起始码ATG至终止码TAA)，因此为今后观察TRH在体外培养的睾丸间质细胞中的表达，以及研究TRH与睾酮分泌的相互关系，奠定了基础。睾丸组织中的TRH与TRH-R结合后对生殖细胞的分化及生理功能有什么作用将在后续的研究中作出结论。
, 百拇医药
【基金项目】国家自然科学基金(39870109)和全军医药卫生科研基金资助项目(98M106)
作者简介：李臻(1974—)，女，湖北省武汉市人，硕士
参考文献
[1]Fuse Y, Polk DH, Lam RW, et al. Distribution of thyrotropin-releasing hormone(TRH) and precursor peptide(TRH-Gly) in adult rat tissues[J]. Endocrinology, 1990,127(5):2501-2505.
[2]Zhang SH, Zhang YQ, Vacca-Galloway L. Identification of thyrotropin-releasing hormone receptor mRNA in the leyding cells of mouse testis by in situ hybridization[J]. Neuropeptides, 1995,29(1):309-313.
, http://www.100md.com
[3]张远强，张舒华，刘新平.促甲状腺激素释放激素受体基因在小鼠睾丸中的表达[J].科学通报，1996，41(6)：540～543.
[4]Mandel G, Goodman RH. Using the brain to screen cloned genes[J]. Trends Neurosci, 1987,10(1):101-104.
[5]Zhao D, Yang J, Jones K E. Molecular cloning of a complementary deoxyribonucluic acid encoding the thyrotropin-releasing hormone receptor and regulation of its messengr ribonucleic acid in rat GH cells[J]. Endocrinology, 1992, 130(7):3529-3536.
【收稿日期】1999-06-02
【修稿日期】1999-09-24, 百拇医药
单位：李臻 张远强(第四军医大学组织学胚胎学教研室)；刘新平(生物化学与分子生物学教研室，西安 710032)
关键词：前促甲状腺激素释放激素(ppTRH)；促甲状腺激素释放激素受体(TRH-R)；反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；睾丸；大鼠
解剖学报000224 【摘要】 目的 研究促甲状腺激素释放激素(thyrotrophin-releasing hormone, TRH)及其受体(TRH receptor,TRH-R)在大鼠睾丸组织中的表达规律和在生殖发育调节中的作用。 方法 以大鼠睾丸组织总RNA为模板，依据大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA设计引物，进行反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)，对特异性片段进行序列测定。 结果 从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA片段，其核苷酸序列与大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA序列完全一致。 结论 首次用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA克隆。研究促甲状腺激素释放激素(thyrotrophin-releasing hormone, TRH)及其受体(TRH receptor,TRH-R)在大鼠睾丸组织中的表达规律和在生殖发育调节中的作用。 方法 以大鼠睾丸组织总RNA为模板，依据大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA设计引物，进行反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)，对特异性片段进行序列测定。 结果 从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA片段，其核苷酸序列与大鼠下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R cDNA序列完全一致。 结论 首次用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中获得了前TRH和TRH-R的cDNA克隆。
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【中图分类号】 R329 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-186
CLONING AND SEQUENCING OF PREPROTHYROTROPIN-RELEASING HORMONE AND ITS RECEPTOR IN THE RAT TESTIS
LI Zhen,ZHANG Yuan-qiang
(Department of Histology and Embryology; )
LIU Xin-ping,(Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)
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【Abstract】 Objective In order to investigate the expression regulation of thyro
trophin-releasing hormone(TRH) and TRH receptor (TRH-R) in rat testis, and their func
tion in production and development. Methods Total RNA of rat testis was used as temp
late. The oligonucleotide primers were designed from the sequence of rat hypothalamus prepro(pp)TRH and pituitary TRH-R cDNA for Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Specific fragments of ppTRH and TRH-R cDNA were cloned and sequenced. Results DNA sequence analysis indicated that cDNA sequences of ppTRH and TRH-R from rat testis were consistent with those of hypothalamus ppTRH and pituitary TRH-R cDNA. Conclusions It is the first time to acquire the cDNA cloning of ppTRH and TRH-R from rat testis by RT-PCR.
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【Key words】 Thyrotrophin-releasing hormone(TRH); Thyrotrophin-releasing hormone receptor(TRH-R); Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR); Testis; Rat
促甲状腺激素释放激素(thyrotrophin-releasing hormone,TRH)最初是从羊和猪的下丘脑中提取并分离纯化的3肽。TRH与垂体前叶促甲状腺激素细胞表面特异性受体结合，刺激促甲状腺激素(TSH)的合成和分泌。应用放射免疫分析，发现具有免疫活性的TRH不仅存在于下丘脑以外的中枢神经系统中，而且广泛分布于外周组织，包括胃肠道、胰腺、肾上腺、胎盘和男性生殖系统[1]。而且也发现下丘脑的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、生长激素释放激素(GHRH)、前阿片促黑激素皮质素(POMC)等神经肽也存在于睾丸组织中，并对精子的分化发育起到重要调控作用。以后证实在中枢神经系统，TRH作为神经递质或神经调质与神经细胞表面受体结合，这种受体的cDNA序列与垂体前叶TRH-R的cDNA类似。免疫组织化学证明TRH定位于大鼠睾丸间质细胞，近期我们应用原位杂交观察到小鼠睾丸间质细胞可特异性表达TRH-R mRNA[2，3]，说明睾丸间质细胞可合成TRH和TRH-R，鉴于免疫组织化学和原位杂交技术的局限性，我们通过分子生物学技术进一步证实这一发现。为系统地研究TRH和TRH-R在哺乳动物睾丸中的存在意义。我们应用RT-PCR技术从大鼠睾丸组织中成功地获得了前TRH和TRH-R的cDNA克隆，得到了分别与下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R序列相同的基因产物，为后续研究奠定了基础。现报道如下：
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材料和方法
1.大鼠睾丸组织总RNA的制备
成年雄性SD大鼠，体重200～240g，由本校动物实验中心提供。断头法处死大鼠后，迅速取出睾丸组织，去被膜，称重，剪碎，异硫氰酸胍一步法提取睾丸组织总RNA(TriPure Isolation Reagent,Promega)。用紫外分光光度计测定RNA的纯度及含量。
2.PCR引物的设计
前TRH和TRH-R的引物序列根据已发表的大鼠下丘脑前TRH、GH3垂体肿瘤细胞TRH-R cDNA的序列[4，5]设计而成，引物序列如附表所示。P1和P5的5′端均加有EcoRI酶切位点，P2和P6的5′端均加有BamHI酶切位点。
附表 引物序列及RT-PCR产物大小
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Table Primer sequence and sizes of RT-PCR produts 引物(primer)
序列(sequence)
位置(position)
前TRH(ppTRH)
P1：5′CGGAATTCCACTCTTCAGCTCAGCATCTTG 3′
Bp 44-65
P2：5′CGGGATCCTTACTCCTCCAGAGGTTCCTTGT 3′
Bp 848-870(827bp)
TRH-R
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P3：5′ACCACCTCTAGATCTTTCAACAGC 3′
Bp 834-857
外(outer)
P4：5′AGGTATTCTAGAGGAAGTTCATAT 3′
Bp 1323-1346(513bp)
内(inner)
P5：5′CGGAATTCAGGAAGCAGGTCACCAAG 3′
Bp 870-887
P6：5′CGGGATCCCTCAGAGGCCAAGCAGGT 3′
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Bp 1248-1265(396bp)
3.RT-PCR
取10μg睾丸组织总RNA，4μl 25mmol/L MgCl2，2μl 10×逆转录缓冲液，2μl 10mmol/L dNTP,0.5μl RNA酶抑制剂，15U AMV逆转录酶，0.5μg oligo(dT)15引物，加DEPC处理的H2O至总反应体积20μl，42℃温浴20min，合成cDNA第1链。99℃ 5min终止反应，0～5℃ 5min复性。用上述3对引物分别对TRH和TRH-R进行PCR。前TRH：P1和P2，94℃ 30s，53℃ 90s，72℃ 90s 30个循环。TRH-R：用2对寡核苷酸引物进行“巢式”PCR。先用外引物P3和P4对反转录后的cDNA进行扩增，94℃ 1min，52℃ 2min，72℃ 2min 30个循环。经1.5%琼脂糖凝胶电泳获得500bp的片段，胶中片段回收后再用内引物P5和P6扩增，94℃ 30s，48℃ 1min，72℃ 1min 30个循环。用不含cDNA模板的PCR反应体系作为阴性对照，以排除反应操作中DNA污染。取PCR产物各10μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色。从而获得大鼠前TRH和TRH-R的特异性cDNA片段。
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4.特异性片段的克隆及序列测定
将前TRH和TRH-R PCR产物从凝胶中回收，用EcoRI和BamHI双酶切，定向插入PUC19载体中。连接反应后，转化大肠杆菌JM109感受态细胞；经转化后的大肠杆菌铺于含氨苄青霉素的LB琼脂板上，在37℃中过夜培养。从中随机挑选4个克隆，用碱裂解法提取质粒DNA，用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行酶切和电泳分析，获得有插入片段的重组质粒，用全自动双脱氧终止法进行正、反两向序列测定(perkin elmer)。结果和讨论
对所设计的特定引物进行RT-PCR扩增后，产物均显示为1条特异性的扩增带(图1)，分别获得编码大鼠睾丸组织前TRH 827bp片段和编码大鼠睾丸组织TRH-R 396bp片段，与设计方案一致。重组质粒用EcoRI和BamHI双酶切分析鉴定，显示有827bp和396bp的目的基因片段，说明PCR产物克隆成功(图2)。测序结果表明，从大鼠睾丸组织中获得的前TRH和TRH-R cDNA序列分别与大鼠下丘脑中的前TRH cDNA序列和GH3垂体肿瘤细胞中的TRH-R cDNA序列完全一致(图3)。
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图1 电泳鉴定PCR产物：1.PCR Maker;2.前TRH PCR产物：827bp；3.TRH-R PCR产物：396bp；4.不含模板的PCR反应混合物
Fig.1 The electrophoretic analysis for PCR product:1.PCR Marker; 2.ppTRH PCR production:827bp;
3.TRH-R PCR production:396bp; 4.PCR mixture without template cDNA
图2 酶切图谱鉴定重组体：1.PCR Maker;2.PUC-pp TRH/EcoRI,BamHI双酶切，产生2.686kb和827bp片段；
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Fig.2 The electrophoretic analysis for reconstruction:1.PCR Marker;PUC-ppTRH/EcoRI,BamHI 2.686kb and 827bp fragments;
3.PUC-TRH-R/EcoRI,BamHI 2.686kb and 396bp fragments;4.Recombinant plasmid without enzyme digestion.
图3 测序结果：1.大鼠睾丸中的前TRH cDNA序列及其与下丘脑中的前TRH序列的比较；
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2.大鼠睾丸中的TRH-R序列及其与GH3垂体肿瘤细胞中的TRH-R序列的比较
Fig.3 Sequencing results: 1.Comparision of the cDNA sequence of rat testis ppTRH with that of the hypothalamus ppTRH;
2.Comparision of the cDNA sequence of rat testis TRH-R with that of the pituitary TRH-R.
哺乳类动物生殖细胞的发育及其调控一直是发育生殖学的前沿课题，近年的研究表明，雄性生殖细胞发育除受到下丘脑-垂体-性腺轴的神经内分泌调控外，还受到睾丸局部组织细胞之间的相互调节[9]。近年来，人们发现睾丸含有多种神经肽，包括促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、生长激素释放激素(GHRH)、前阿片促黑激素皮质素(POMC)、生长抑素(SS)、促胃泌素释放肽、心房利钠尿多肽和胆囊收缩素等，但这些神经肽在睾丸中的生理作用至今仍不清楚。
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本实验应用RT-PCR技术首次从大鼠睾丸组织中分别获得了前TRH和TRH-R的cDNA片段，并经克隆和序列分析证明与下丘脑中的前TRH和垂体中的TRH-R具有相同的序列，进一步在分子生物学水平上验证了免疫组织化学及原位杂交的发现，并为前TRH和TRH-R mRNA在大鼠睾丸组织中的表达提供了新证据，说明睾丸组织中的TRH来源于与下丘脑中的前TRH类似的前导物。这一结果结合我们前期的研究工作充分证实大鼠睾丸组织具有合成TRH和TRH-R的功能，其合成细胞为间质细胞，但仍不排除支持细胞和各级生精细胞表达TRH和TRH-R的可能性。后续的研究工作将通过对纯化的间质细胞、支持细胞和各级生精细胞的RT-PCR的检测进一步证实。本实验的发现说明睾丸生殖细胞的发育存在相当复杂的局部调节机制。这种局部调节，可能通过细胞间的直接作用，或通过自分泌或旁分泌激素和细胞因子的方式来实现。大鼠睾丸间质细胞表达TRH和TRH-R的意义现仍不清楚，猜测睾丸中的TRH可能通过自分泌或旁分泌途径与细胞膜表面特异性受体蛋白发挥作用，其作用与睾酮的产生和分泌调节有关。由于本实验获得的前TRH cDNA片段含有TRH的整个编码区(从起始码ATG至终止码TAA)，因此为今后观察TRH在体外培养的睾丸间质细胞中的表达，以及研究TRH与睾酮分泌的相互关系，奠定了基础。睾丸组织中的TRH与TRH-R结合后对生殖细胞的分化及生理功能有什么作用将在后续的研究中作出结论。
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【基金项目】国家自然科学基金(39870109)和全军医药卫生科研基金资助项目(98M106)
作者简介：李臻(1974—)，女，湖北省武汉市人，硕士
参考文献
[1]Fuse Y, Polk DH, Lam RW, et al. Distribution of thyrotropin-releasing hormone(TRH) and precursor peptide(TRH-Gly) in adult rat tissues[J]. Endocrinology, 1990,127(5):2501-2505.
[2]Zhang SH, Zhang YQ, Vacca-Galloway L. Identification of thyrotropin-releasing hormone receptor mRNA in the leyding cells of mouse testis by in situ hybridization[J]. Neuropeptides, 1995,29(1):309-313.
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[3]张远强，张舒华，刘新平.促甲状腺激素释放激素受体基因在小鼠睾丸中的表达[J].科学通报，1996，41(6)：540～543.
[4]Mandel G, Goodman RH. Using the brain to screen cloned genes[J]. Trends Neurosci, 1987,10(1):101-104.
[5]Zhao D, Yang J, Jones K E. Molecular cloning of a complementary deoxyribonucluic acid encoding the thyrotropin-releasing hormone receptor and regulation of its messengr ribonucleic acid in rat GH cells[J]. Endocrinology, 1992, 130(7):3529-3536.
【收稿日期】1999-06-02
【修稿日期】1999-09-24, 百拇医药