猪卵巢卵母细胞体外成熟及体外受精过程中皮质颗粒变化的研究
作者：杨信志 宋学雄 岳奎忠 谭景和 杨庆章
单位：杨信志(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)；宋学雄(日本冈山大学农学部繁殖研究室)；岳奎忠(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)；谭景和(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)；杨庆章(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)
关键词：体外成熟；体外受精；皮质颗粒；荧光标记；卵母细胞；猪
解剖学报000416 【摘要】 目的 研究猪皮质颗粒在体外成熟及体外受精过程中的变化，以及皮质颗粒与多精受精的关系。 方法 用异硫氰荧光素联接的花生四烯酸(FITC-PNA)标记体外成熟不同时间及体外受精不同时间皮质颗粒。 结果 皮质颗粒在猪卵母细胞体外成熟过程中逐渐由皮质部向卵质膜下迁移，并在质膜下排布成单层。体外成熟过程中所排出的第1极体也被FITC-PNA所标记，说明第1极体中含有皮质颗粒。在对不同体外成熟时间的卵母细胞进行授精时发现，皮质颗粒的释放速度与体外成熟时间呈正比例关系。为进一步证实皮质颗粒的排放速度与多精受精之间的关系，还进行了精子穿透实验。结果显示，体外成熟48h的卵母细胞其多精受精率为73%，比体外成熟36h(83%)、24h(80%)的卵母细胞要低。并且进入卵子的精子数目(1.7)比后两者(分别为3.1和2.9)的少。 结论 多精受精率与皮质颗粒释放的速度和数量的大小有关。研究猪皮质颗粒在体外成熟及体外受精过程中的变化，以及皮质颗粒与多精受精的关系。 方法 用异硫氰荧光素联接的花生四烯酸(FITC-PNA)标记体外成熟不同时间及体外受精不同时间皮质颗粒。 结果 皮质颗粒在猪卵母细胞体外成熟过程中逐渐由皮质部向卵质膜下迁移，并在质膜下排布成单层。体外成熟过程中所排出的第1极体也被FITC-PNA所标记，说明第1极体中含有皮质颗粒。在对不同体外成熟时间的卵母细胞进行授精时发现，皮质颗粒的释放速度与体外成熟时间呈正比例关系。为进一步证实皮质颗粒的排放速度与多精受精之间的关系，还进行了精子穿透实验。结果显示，体外成熟48h的卵母细胞其多精受精率为73%，比体外成熟36h(83%)、24h(80%)的卵母细胞要低。并且进入卵子的精子数目(1.7)比后两者(分别为3.1和2.9)的少。 结论 多精受精率与皮质颗粒释放的速度和数量的大小有关。
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【中图分类号】 Q132.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-04-355
STUDY ON CORTICAL GRANULES CHANGE OF PIG
OOCYTES DURING IVM AND IVF
YANG Xin-zhi YUE Kui-zhong TAN Jing-he YANG Qing-zhang
(Faculty of life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
SONG Xue-xiong
(Division of Animal Science and Technology, Faculty of Agriculture, Okayama University, Okayama 700, Japan)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective
To investigate the behavior of cortical granules(CGs) during IVM and IVF, and the relationship between CGs and polyspermy. Methods We used the FITC-PNA as a probe to label the different period of IVM and IVF pig oocytes. Results CGs migrate towards the cell membrane during IVM, and finally form a monolayer under the membrane. The first polar body can be labeled by FITC-PNA indicating that it contains CGs. After fertilization oocytes maured in vitro, the speed of CGs release is in proportion with maturation time. To confirm the relationship of CGs exocytosis speed with polyspermy, we tested the sperm penetration on the oocytes matured in vitro for different period of time. In oocytes matured in vitro for 48h, polyspermy ratio is 73%, and lower than that in 36h(83%)and 24h(80%). Number of penetrating sperm(1.7)in 48h matured oocytes is also lower than that in 36h(3.1)and 24h(2.9). Conclusion The polyspermy incidence has a direct relation with the speed of CGs exocytosis and its quantity.
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【Key words】 IVM; IVF; CGs;Fluorescence label; Oocytes; Porcine
在多数哺乳动物卵子中，皮质颗粒在受精时能及时排放，这对其单精受精起到了非常重要的作用[1]。无论成熟卵母细胞还是未成熟卵母细胞，在体外都可以被精子所穿透[2，3]，成熟的猪卵母细胞在体外受精的过程中其多精受精率非常高[3]，据报道[4]，无论是体内成熟还是体外成熟的猪卵子，受精后都可以释放皮质颗粒。但两者之间存在某些差别，体内受精的卵子皮质颗粒的释放比体外受精的卵子快，并且皮质颗粒内容物可在卵周隙中分散开来[5]。有人发现，在人的体外受精系统中，皮质颗粒内容物在卵周隙内不能很好的散布[6]。
以前，对皮质颗粒的研究主要以电子显微镜作为手段。这不仅程序烦琐而且观察的卵子数量也有限。谭景和等[7]利用免疫荧光方法对皮质颗粒进行标记，但这种方法很少利用到哺乳动物的卵母细胞上。尽管目前人们已逐渐弄清了皮质颗粒的结构和功能，但在实验中要大量观察其活动情况还有一定的难度。最近，利用植物凝集素做为探针来标记皮质颗粒的方法在仓鼠[8]，小鼠[9]，以及牛[10]中得到应用。利用这种方法，人们详细研究了在成熟、受精和活化[9，11]过程中小鼠卵子中皮质颗粒的变化。
, 百拇医药
对猪皮质颗粒的荧光标记始于1993年[4]。人们利用这种方法已观察了猪皮质颗粒在卵母细胞成熟、受精及活化中的变化情况[4，12]。但目前为止，不同成熟时间的卵子在体外受精过程中皮质颗粒的排放时间还未见报道。我们分别用体外培养24、36和48h的猪卵母细胞进行体外受精。授精0.5、1.5和3h后，分别观察皮质颗粒的变化情况，并且对不同成熟时间的卵母细胞进行了受精实验。
材料和方法
1.卵母细胞的获取
猪卵巢从刚屠宰的猪中获得。卵巢装在37℃含75mg/L青霉素生理盐水的保温瓶中带回实验室。1～1.5h内抽取直径在2～5mm的卵泡。取颗粒细胞层数较多，细胞质均匀，形态圆而饱满的卵丘-卵母细胞复合体进行体外成熟。培养之前用培养基洗4次。
2.培养基的制备
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2.1 IVM培养基：为TCM-199 B。即TCM-199(Gibco)加超纯水至1 000 ml，添加2.92 mmol/L的乳酸钙(Sigma)，0.91 mmol/L的丙酮酸钠(Sigma)，3.05 mmol/L的葡萄糖(Sigma)，75mg/L的青霉素(Sigma)，50mg/L的链霉素(Sigma)和10%的灭活牛血清(Gibco)。培养时，在TCM-199 B中再另加104IU/L的PMSG(Japan Co.)和hCG(Japan Co.)。
2.2 IVF培养基：在IVM培养基中加入NaHCO3(Sigma)，使其pH调整到7.8，以利于精子的穿入，然后加入咖啡因(Sigma)至最终浓度为10 mmol/L。
3.卵母细胞的体外成熟与体外受精
IVM液做成200μl的滴，加盖石蜡油，放在38.5℃ 5%的CO2培养箱中平衡6h，将筛选出的卵丘-卵母细胞复合体移入滴中，每滴15个卵左右。然后再放入培养箱中进行培养。以刚从卵巢抽取的卵母细胞作为培养0h，培养后的卵母细胞用0.1%的透明质酸酶消化掉外面包裹的卵丘细胞。然后用IVF培养基洗4次，移入已平衡6h的受精滴中，每个受精滴中10个卵。50μl受精滴是含10 mmol/L咖啡因的IVF培养基作成，上面覆盖石蜡油。
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猪的冷冻精液从液氮中取出后直接放到38.5℃不含咖啡因的IVF培养基中。培养基事先在5%CO2培养箱中平衡3h。解冻后的精子离心清洗3次，每次离心力为550×g，5min。然后用IVF培养基悬浮精子，使精子密度为5～6×107个/ml。将50μl的精子悬浮液加入到含卵子的受精滴中，将受精滴放回38.5℃ 5%的CO2培养箱中继续培养。
4.荧光标记
卵子在PBS中洗2次，放在3%的戊二醛(Sigma)中固定30min。然后用PBS洗2次，放到含0.1%Triton-100(Sigma)的PBS中处理5min。用PBS洗3次，将卵子放到100mg/L FITC-PNA(Sigma)的PBS中，置于暗处孵育30min。用PBS洗4次，充分洗掉表面上的FITC-PNA，用盖片盖好后，放到暗盒中待观察。
5. 荧光观察
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将封好的玻片放到Nikon荧光显微镜下，用激发波长为488nm的光观察。
结果
1.猪卵巢卵母细胞体外成熟及受精过程中的皮质颗粒变化
从卵巢中抽取的未成熟卵，分别在体外培养0、24、36和48h，然后用0.1%的透明质酸酶消化颗粒细胞，对其进行荧光标记。结果(表1)显示，体外成熟0h的皮质颗粒位于整个卵子的皮质层中，卵子发出均匀的荧光(Ⅰ级)。体外成熟24h后，皮质颗粒开始向细胞膜方向迁移。卵子质膜内侧有较强的光圈，皮质中还有皮质颗粒，但其发出的荧光较弱(Ⅱ级)。第1极体也被荧光物质所标记。说明第1极体中含有皮质颗粒。体外成熟36h和48h的卵子中，绝大多数的皮质颗粒已排布在质膜下，形成单层的光环(Ⅲ级)。说明皮质颗粒已完成迁移。这时皮质中基本上没有荧光(图)。
表1 体外成熟不同时间皮质颗粒分布情况
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Table 1 Distribution of CGs in different
time of culture in vitro 成熟培养时间
time of
IVM(h)
卵子数目
No.of
oocytes
examined
荧光标记状态
different condition of flourescence
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Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
0
23
23
0
0
24
20
2
17
1
36
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20
0
0
20
48
21
0
0
21
2.体外受精过程中皮质颗粒的变化
把体外成熟24、36和48h的卵子去掉颗粒细胞后，将每个不同成熟时间组的卵子再分为4组，分别授精。授精后0、0.5、1.5和3h放入0.1%的透明质酸酶中用尖口吸管反复吹打，去掉粘在透明带表面上的精子。然后，进行荧光标记，记录释放皮质颗粒的卵子数。从表2可看出，体外成熟24h的卵在授精后，其皮质颗粒的释放较36和48h的卵迟缓。授精3h后才有10%的卵子发生皮质颗粒释放。而体外成熟36h的卵要比24h的快，授精1.5h后约有39%的卵子释放皮质颗粒，3h后达到97%。在成熟48h卵子中，授精0.5h就有77%的卵子释放皮质颗粒，到授精1.5h后，100%的卵子发生皮质颗粒释放现象。可见，皮质颗粒的排放与卵子本身的成熟度有着直接的关系。
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表2 皮质颗粒释放的时间
Table 2 Time course of CGs exocytosis 成熟时间
time of
IVM(h)
卵子数目
No.of
oocytes
examined
授精后不同时间皮质颗粒排放情况
CGs exocytosis after IVF
0 h
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0.5 h
1.5 h
3 h
24
30
0
0
0
3(10)
36
31
0
0
12(39)
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30(97)
48
35
0
26(77)
35(100)
35(100)
3.体外成熟不同时间卵母细胞的授精情况
体外成熟24、36和48h的卵母细胞分别进行体外授精。在授精10h后，充分去掉透明带表面附着的精子。用醋酸酒精固定，2d后用醋酸洋红染色观察精子穿入卵内的情况。结果(表3)显示，体外成熟24h卵母细胞的穿透率为80%，与体外成熟36h(93%)和48h(94%)的卵母细胞相比存在显著的差异(P<0.05)。而体外成熟36h与体外成熟48h的卵相比，其穿透率没有显著的差异。表3 体外成熟不同时间卵母细胞的受精情况
, 百拇医药
Table 3 Fertilization of the oocytes in vitro matured for different period of time 成熟时间
time of IVM(h)
卵 数
No.oocytes examined
穿透数
No.oocytes penetrated
多精入卵数
No.polyspermic oocytes
平均精子穿透数
, 百拇医药
No.penetrationg sperm per oocyte
24
51
41(80)
33(80)
2.9(119/41)
36
58
54(93)
45(83)
3.1(167/54)
48
, 百拇医药
55
52(94)
38(73)
1.7(88/52)
从多精入卵率上看，体外成熟24h的卵多精入卵率为80%，与体外成熟36h(83%)的卵母细胞相比没有显著的差异，但与体外成熟48h(73%)的卵母细胞相比则有显著差异(P<0.05)。体外成熟36h与体外成熟48h的卵母细胞相比，其多精入卵率差异显著(P<0.05)。
从卵内平均精子数看，成熟培养24h的受精卵，平均精子入卵率为2.9个精子/卵。这与成熟培养36h的受精卵(3.1个精子/卵)差异不显著。但两者与体外成熟48h(1.7个精子/卵)的卵相比都有显著的差异(P<0.05)。
结果提示，体外成熟24h的卵母细胞，其精子穿透率较低。这可能与卵子不成熟有关。而成熟卵子的穿透率明显上升。体外成熟24h和36h的受精卵，多精受精率比体外成熟48h卵子的多精受精率高。并且卵内平均精子穿透率也多。说明体外成熟48h的卵子中的皮质颗粒在受精后释放快，从而阻止了其他精子的穿入。讨论
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皮质颗粒在猪卵母细胞成熟过程中的变化情况已有很多报道[4]。许多研究发现，皮质颗粒从卵母细胞的皮质部逐渐向质膜方向迁移，并且这种迁移始于发生泡破裂时。最后排列在质膜下形成一单层。另外，在第1次减数分裂形成的第1极体内也存在皮质颗粒。本实验中，在体外成熟0h的卵母细胞中，皮质颗粒位于卵母细胞核外胞质中。在体外成熟24h，卵母细胞达到M-Ⅰ期时，皮质颗粒已经开始向质膜方向迁移。在体外成熟36h和48h后，卵母细胞处于M-Ⅱ期。这时的皮质颗粒已完成迁移，排列在质膜下方形成单层，第1极体明显含有皮质颗粒。
以前的实验结果表明，到达M-Ⅱ期的卵子受精时，皮质颗粒释放较完全。说明精子的穿透并不是皮质颗粒释放的唯一条件。可能与细胞核与细胞质的成熟程度有关。小鼠卵母细胞发育到M-Ⅰ期受精，卵子可释放皮质颗粒。在猪中，卵母细胞发育到生发泡破裂到达M-Ⅰ期后，大多数的卵子在受精后都可发生皮质反应[12]。但这一时期原核形成率比卵子到达M-Ⅱ期的原核形成率低。皮质颗粒的外排也比M-Ⅱ期的少[5]。说明M-Ⅰ期的卵母细胞的细胞质还没有完全成熟。本实验结果也显示了M-Ⅱ期卵母细胞受精时皮质颗粒释放较多。
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Sathananth和Trounson[6]报道，人体外受精尤其在多精受精的卵子中，皮质颗粒往往会发生排放延迟现象。本实验说明在体外受精过程中，猪的未成熟卵皮质颗粒也出现了排放延迟现象。
在正常体内受精过程中，猪的多精入卵率为40%，但是体外受精的多精入卵率却高达80%。很明显，在体外受精系统中，猪卵母细胞阻止多精受精的机制没有完全发挥其应有的作用。一方面原因是由于体内受精的卵母细胞受精后皮质颗粒的释放速度比其在体外受精时快。另外，体内受精的卵母细胞受精后皮质颗粒内容物可在卵周隙中分散开来[13]。在我们的实验中，体外受精过程中多精受精率在73%～83%之间。这与其他人基本相同。本实验发现，体外成熟时间相对较长的卵母细胞体外受精后，多精受精率明显降低。这可能因为成熟培养时间相对较长的卵母细胞皮质颗粒释放较快，对阻止其他精子入卵起到了一定的作用。另外，我们没能观察到受精卵的卵周隙中含有皮质颗粒内容物。这与Yoshida[4]的结果不同，可能是因为体外受精系统稀释了皮质颗粒释放的内容物。
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本实验得到日本冈山大学农学部繁殖研究室丹羽皓二教授的大力支持，特此致谢。
本文图1～6见插图第13页
图1 体外成熟0h皮质颗粒均匀分布于卵母细胞核外胞质部。 ×200
Fig.1 Distribution for CGs after IVM of 0 hour.CGs were well-distributed in cytoplasm. ×200
图2 体外成熟24h皮质颗粒已开始向质膜方向迁移，第1极体中含有皮质颗粒。 ×200
Fig.2 Distribution of CGs after IVM for 24 hour.CGs were under going migration towards the cell membrane.The first polar body contain CGs. ×200
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图3 体外成熟36h皮质颗粒在质膜下方形成一明亮光环， ×200
Fig.3 The CGs form a bright monolayer under the membrane after IVM for 36 hours. ×200
图4 体外成熟48h皮质颗粒也在质膜下方形成一明亮光环，与培养36h无明显差别。 ×200
Fig.4 The CGs form a bright monolayer under the membrane after IVM for 48 hours. There is no difference from those of 36 hours. ×200
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图5 体外成熟36h卵母细胞受精4.5h后，皮质颗粒内容物与透明带外表面结合。 ×200
Fig.5 Binding of CGs content to the ZP surface after 4.5 hours of IVF with the oocytes matured in vitro for 36 hours. ×200
图6 体外成熟48h卵母细胞受精3h后，皮质颗粒内容物与透明带外表面结合。 ×200
Fig.6 Binding of CGs content to the ZP surface after 3 hours of IVF with the oocytes matured in vitro for 48 hours. ×200
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【基金项目】 东北农业大学青年基金资助项目
【作者简介】 杨信志(1967—)，男(汉族)，山东即墨人，硕士，讲师
参考文献
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【收稿日期】 1999-07-05
【修回日期】 2000-01-14, http://www.100md.com
单位：杨信志(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)；宋学雄(日本冈山大学农学部繁殖研究室)；岳奎忠(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)；谭景和(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)；杨庆章(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)
关键词：体外成熟；体外受精；皮质颗粒；荧光标记；卵母细胞；猪
解剖学报000416 【摘要】 目的 研究猪皮质颗粒在体外成熟及体外受精过程中的变化，以及皮质颗粒与多精受精的关系。 方法 用异硫氰荧光素联接的花生四烯酸(FITC-PNA)标记体外成熟不同时间及体外受精不同时间皮质颗粒。 结果 皮质颗粒在猪卵母细胞体外成熟过程中逐渐由皮质部向卵质膜下迁移，并在质膜下排布成单层。体外成熟过程中所排出的第1极体也被FITC-PNA所标记，说明第1极体中含有皮质颗粒。在对不同体外成熟时间的卵母细胞进行授精时发现，皮质颗粒的释放速度与体外成熟时间呈正比例关系。为进一步证实皮质颗粒的排放速度与多精受精之间的关系，还进行了精子穿透实验。结果显示，体外成熟48h的卵母细胞其多精受精率为73%，比体外成熟36h(83%)、24h(80%)的卵母细胞要低。并且进入卵子的精子数目(1.7)比后两者(分别为3.1和2.9)的少。 结论 多精受精率与皮质颗粒释放的速度和数量的大小有关。研究猪皮质颗粒在体外成熟及体外受精过程中的变化，以及皮质颗粒与多精受精的关系。 方法 用异硫氰荧光素联接的花生四烯酸(FITC-PNA)标记体外成熟不同时间及体外受精不同时间皮质颗粒。 结果 皮质颗粒在猪卵母细胞体外成熟过程中逐渐由皮质部向卵质膜下迁移，并在质膜下排布成单层。体外成熟过程中所排出的第1极体也被FITC-PNA所标记，说明第1极体中含有皮质颗粒。在对不同体外成熟时间的卵母细胞进行授精时发现，皮质颗粒的释放速度与体外成熟时间呈正比例关系。为进一步证实皮质颗粒的排放速度与多精受精之间的关系，还进行了精子穿透实验。结果显示，体外成熟48h的卵母细胞其多精受精率为73%，比体外成熟36h(83%)、24h(80%)的卵母细胞要低。并且进入卵子的精子数目(1.7)比后两者(分别为3.1和2.9)的少。 结论 多精受精率与皮质颗粒释放的速度和数量的大小有关。
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【中图分类号】 Q132.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-04-355
STUDY ON CORTICAL GRANULES CHANGE OF PIG
OOCYTES DURING IVM AND IVF
YANG Xin-zhi YUE Kui-zhong TAN Jing-he YANG Qing-zhang
(Faculty of life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
SONG Xue-xiong
(Division of Animal Science and Technology, Faculty of Agriculture, Okayama University, Okayama 700, Japan)
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【Abstract】 Objective
To investigate the behavior of cortical granules(CGs) during IVM and IVF, and the relationship between CGs and polyspermy. Methods We used the FITC-PNA as a probe to label the different period of IVM and IVF pig oocytes. Results CGs migrate towards the cell membrane during IVM, and finally form a monolayer under the membrane. The first polar body can be labeled by FITC-PNA indicating that it contains CGs. After fertilization oocytes maured in vitro, the speed of CGs release is in proportion with maturation time. To confirm the relationship of CGs exocytosis speed with polyspermy, we tested the sperm penetration on the oocytes matured in vitro for different period of time. In oocytes matured in vitro for 48h, polyspermy ratio is 73%, and lower than that in 36h(83%)and 24h(80%). Number of penetrating sperm(1.7)in 48h matured oocytes is also lower than that in 36h(3.1)and 24h(2.9). Conclusion The polyspermy incidence has a direct relation with the speed of CGs exocytosis and its quantity.
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【Key words】 IVM; IVF; CGs;Fluorescence label; Oocytes; Porcine
在多数哺乳动物卵子中，皮质颗粒在受精时能及时排放，这对其单精受精起到了非常重要的作用[1]。无论成熟卵母细胞还是未成熟卵母细胞，在体外都可以被精子所穿透[2，3]，成熟的猪卵母细胞在体外受精的过程中其多精受精率非常高[3]，据报道[4]，无论是体内成熟还是体外成熟的猪卵子，受精后都可以释放皮质颗粒。但两者之间存在某些差别，体内受精的卵子皮质颗粒的释放比体外受精的卵子快，并且皮质颗粒内容物可在卵周隙中分散开来[5]。有人发现，在人的体外受精系统中，皮质颗粒内容物在卵周隙内不能很好的散布[6]。
以前，对皮质颗粒的研究主要以电子显微镜作为手段。这不仅程序烦琐而且观察的卵子数量也有限。谭景和等[7]利用免疫荧光方法对皮质颗粒进行标记，但这种方法很少利用到哺乳动物的卵母细胞上。尽管目前人们已逐渐弄清了皮质颗粒的结构和功能，但在实验中要大量观察其活动情况还有一定的难度。最近，利用植物凝集素做为探针来标记皮质颗粒的方法在仓鼠[8]，小鼠[9]，以及牛[10]中得到应用。利用这种方法，人们详细研究了在成熟、受精和活化[9，11]过程中小鼠卵子中皮质颗粒的变化。
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对猪皮质颗粒的荧光标记始于1993年[4]。人们利用这种方法已观察了猪皮质颗粒在卵母细胞成熟、受精及活化中的变化情况[4，12]。但目前为止，不同成熟时间的卵子在体外受精过程中皮质颗粒的排放时间还未见报道。我们分别用体外培养24、36和48h的猪卵母细胞进行体外受精。授精0.5、1.5和3h后，分别观察皮质颗粒的变化情况，并且对不同成熟时间的卵母细胞进行了受精实验。
材料和方法
1.卵母细胞的获取
猪卵巢从刚屠宰的猪中获得。卵巢装在37℃含75mg/L青霉素生理盐水的保温瓶中带回实验室。1～1.5h内抽取直径在2～5mm的卵泡。取颗粒细胞层数较多，细胞质均匀，形态圆而饱满的卵丘-卵母细胞复合体进行体外成熟。培养之前用培养基洗4次。
2.培养基的制备
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2.1 IVM培养基：为TCM-199 B。即TCM-199(Gibco)加超纯水至1 000 ml，添加2.92 mmol/L的乳酸钙(Sigma)，0.91 mmol/L的丙酮酸钠(Sigma)，3.05 mmol/L的葡萄糖(Sigma)，75mg/L的青霉素(Sigma)，50mg/L的链霉素(Sigma)和10%的灭活牛血清(Gibco)。培养时，在TCM-199 B中再另加104IU/L的PMSG(Japan Co.)和hCG(Japan Co.)。
2.2 IVF培养基：在IVM培养基中加入NaHCO3(Sigma)，使其pH调整到7.8，以利于精子的穿入，然后加入咖啡因(Sigma)至最终浓度为10 mmol/L。
3.卵母细胞的体外成熟与体外受精
IVM液做成200μl的滴，加盖石蜡油，放在38.5℃ 5%的CO2培养箱中平衡6h，将筛选出的卵丘-卵母细胞复合体移入滴中，每滴15个卵左右。然后再放入培养箱中进行培养。以刚从卵巢抽取的卵母细胞作为培养0h，培养后的卵母细胞用0.1%的透明质酸酶消化掉外面包裹的卵丘细胞。然后用IVF培养基洗4次，移入已平衡6h的受精滴中，每个受精滴中10个卵。50μl受精滴是含10 mmol/L咖啡因的IVF培养基作成，上面覆盖石蜡油。
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猪的冷冻精液从液氮中取出后直接放到38.5℃不含咖啡因的IVF培养基中。培养基事先在5%CO2培养箱中平衡3h。解冻后的精子离心清洗3次，每次离心力为550×g，5min。然后用IVF培养基悬浮精子，使精子密度为5～6×107个/ml。将50μl的精子悬浮液加入到含卵子的受精滴中，将受精滴放回38.5℃ 5%的CO2培养箱中继续培养。
4.荧光标记
卵子在PBS中洗2次，放在3%的戊二醛(Sigma)中固定30min。然后用PBS洗2次，放到含0.1%Triton-100(Sigma)的PBS中处理5min。用PBS洗3次，将卵子放到100mg/L FITC-PNA(Sigma)的PBS中，置于暗处孵育30min。用PBS洗4次，充分洗掉表面上的FITC-PNA，用盖片盖好后，放到暗盒中待观察。
5. 荧光观察
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将封好的玻片放到Nikon荧光显微镜下，用激发波长为488nm的光观察。
结果
1.猪卵巢卵母细胞体外成熟及受精过程中的皮质颗粒变化
从卵巢中抽取的未成熟卵，分别在体外培养0、24、36和48h，然后用0.1%的透明质酸酶消化颗粒细胞，对其进行荧光标记。结果(表1)显示，体外成熟0h的皮质颗粒位于整个卵子的皮质层中，卵子发出均匀的荧光(Ⅰ级)。体外成熟24h后，皮质颗粒开始向细胞膜方向迁移。卵子质膜内侧有较强的光圈，皮质中还有皮质颗粒，但其发出的荧光较弱(Ⅱ级)。第1极体也被荧光物质所标记。说明第1极体中含有皮质颗粒。体外成熟36h和48h的卵子中，绝大多数的皮质颗粒已排布在质膜下，形成单层的光环(Ⅲ级)。说明皮质颗粒已完成迁移。这时皮质中基本上没有荧光(图)。
表1 体外成熟不同时间皮质颗粒分布情况
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Table 1 Distribution of CGs in different
time of culture in vitro 成熟培养时间
time of
IVM(h)
卵子数目
No.of
oocytes
examined
荧光标记状态
different condition of flourescence
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Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
0
23
23
0
0
24
20
2
17
1
36
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20
0
0
20
48
21
0
0
21
2.体外受精过程中皮质颗粒的变化
把体外成熟24、36和48h的卵子去掉颗粒细胞后，将每个不同成熟时间组的卵子再分为4组，分别授精。授精后0、0.5、1.5和3h放入0.1%的透明质酸酶中用尖口吸管反复吹打，去掉粘在透明带表面上的精子。然后，进行荧光标记，记录释放皮质颗粒的卵子数。从表2可看出，体外成熟24h的卵在授精后，其皮质颗粒的释放较36和48h的卵迟缓。授精3h后才有10%的卵子发生皮质颗粒释放。而体外成熟36h的卵要比24h的快，授精1.5h后约有39%的卵子释放皮质颗粒，3h后达到97%。在成熟48h卵子中，授精0.5h就有77%的卵子释放皮质颗粒，到授精1.5h后，100%的卵子发生皮质颗粒释放现象。可见，皮质颗粒的排放与卵子本身的成熟度有着直接的关系。
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表2 皮质颗粒释放的时间
Table 2 Time course of CGs exocytosis 成熟时间
time of
IVM(h)
卵子数目
No.of
oocytes
examined
授精后不同时间皮质颗粒排放情况
CGs exocytosis after IVF
0 h
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0.5 h
1.5 h
3 h
24
30
0
0
0
3(10)
36
31
0
0
12(39)
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30(97)
48
35
0
26(77)
35(100)
35(100)
3.体外成熟不同时间卵母细胞的授精情况
体外成熟24、36和48h的卵母细胞分别进行体外授精。在授精10h后，充分去掉透明带表面附着的精子。用醋酸酒精固定，2d后用醋酸洋红染色观察精子穿入卵内的情况。结果(表3)显示，体外成熟24h卵母细胞的穿透率为80%，与体外成熟36h(93%)和48h(94%)的卵母细胞相比存在显著的差异(P<0.05)。而体外成熟36h与体外成熟48h的卵相比，其穿透率没有显著的差异。表3 体外成熟不同时间卵母细胞的受精情况
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Table 3 Fertilization of the oocytes in vitro matured for different period of time 成熟时间
time of IVM(h)
卵 数
No.oocytes examined
穿透数
No.oocytes penetrated
多精入卵数
No.polyspermic oocytes
平均精子穿透数
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No.penetrationg sperm per oocyte
24
51
41(80)
33(80)
2.9(119/41)
36
58
54(93)
45(83)
3.1(167/54)
48
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55
52(94)
38(73)
1.7(88/52)
从多精入卵率上看，体外成熟24h的卵多精入卵率为80%，与体外成熟36h(83%)的卵母细胞相比没有显著的差异，但与体外成熟48h(73%)的卵母细胞相比则有显著差异(P<0.05)。体外成熟36h与体外成熟48h的卵母细胞相比，其多精入卵率差异显著(P<0.05)。
从卵内平均精子数看，成熟培养24h的受精卵，平均精子入卵率为2.9个精子/卵。这与成熟培养36h的受精卵(3.1个精子/卵)差异不显著。但两者与体外成熟48h(1.7个精子/卵)的卵相比都有显著的差异(P<0.05)。
结果提示，体外成熟24h的卵母细胞，其精子穿透率较低。这可能与卵子不成熟有关。而成熟卵子的穿透率明显上升。体外成熟24h和36h的受精卵，多精受精率比体外成熟48h卵子的多精受精率高。并且卵内平均精子穿透率也多。说明体外成熟48h的卵子中的皮质颗粒在受精后释放快，从而阻止了其他精子的穿入。讨论
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皮质颗粒在猪卵母细胞成熟过程中的变化情况已有很多报道[4]。许多研究发现，皮质颗粒从卵母细胞的皮质部逐渐向质膜方向迁移，并且这种迁移始于发生泡破裂时。最后排列在质膜下形成一单层。另外，在第1次减数分裂形成的第1极体内也存在皮质颗粒。本实验中，在体外成熟0h的卵母细胞中，皮质颗粒位于卵母细胞核外胞质中。在体外成熟24h，卵母细胞达到M-Ⅰ期时，皮质颗粒已经开始向质膜方向迁移。在体外成熟36h和48h后，卵母细胞处于M-Ⅱ期。这时的皮质颗粒已完成迁移，排列在质膜下方形成单层，第1极体明显含有皮质颗粒。
以前的实验结果表明，到达M-Ⅱ期的卵子受精时，皮质颗粒释放较完全。说明精子的穿透并不是皮质颗粒释放的唯一条件。可能与细胞核与细胞质的成熟程度有关。小鼠卵母细胞发育到M-Ⅰ期受精，卵子可释放皮质颗粒。在猪中，卵母细胞发育到生发泡破裂到达M-Ⅰ期后，大多数的卵子在受精后都可发生皮质反应[12]。但这一时期原核形成率比卵子到达M-Ⅱ期的原核形成率低。皮质颗粒的外排也比M-Ⅱ期的少[5]。说明M-Ⅰ期的卵母细胞的细胞质还没有完全成熟。本实验结果也显示了M-Ⅱ期卵母细胞受精时皮质颗粒释放较多。
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Sathananth和Trounson[6]报道，人体外受精尤其在多精受精的卵子中，皮质颗粒往往会发生排放延迟现象。本实验说明在体外受精过程中，猪的未成熟卵皮质颗粒也出现了排放延迟现象。
在正常体内受精过程中，猪的多精入卵率为40%，但是体外受精的多精入卵率却高达80%。很明显，在体外受精系统中，猪卵母细胞阻止多精受精的机制没有完全发挥其应有的作用。一方面原因是由于体内受精的卵母细胞受精后皮质颗粒的释放速度比其在体外受精时快。另外，体内受精的卵母细胞受精后皮质颗粒内容物可在卵周隙中分散开来[13]。在我们的实验中，体外受精过程中多精受精率在73%～83%之间。这与其他人基本相同。本实验发现，体外成熟时间相对较长的卵母细胞体外受精后，多精受精率明显降低。这可能因为成熟培养时间相对较长的卵母细胞皮质颗粒释放较快，对阻止其他精子入卵起到了一定的作用。另外，我们没能观察到受精卵的卵周隙中含有皮质颗粒内容物。这与Yoshida[4]的结果不同，可能是因为体外受精系统稀释了皮质颗粒释放的内容物。
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本实验得到日本冈山大学农学部繁殖研究室丹羽皓二教授的大力支持，特此致谢。
本文图1～6见插图第13页
图1 体外成熟0h皮质颗粒均匀分布于卵母细胞核外胞质部。 ×200
Fig.1 Distribution for CGs after IVM of 0 hour.CGs were well-distributed in cytoplasm. ×200
图2 体外成熟24h皮质颗粒已开始向质膜方向迁移，第1极体中含有皮质颗粒。 ×200
Fig.2 Distribution of CGs after IVM for 24 hour.CGs were under going migration towards the cell membrane.The first polar body contain CGs. ×200
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图3 体外成熟36h皮质颗粒在质膜下方形成一明亮光环， ×200
Fig.3 The CGs form a bright monolayer under the membrane after IVM for 36 hours. ×200
图4 体外成熟48h皮质颗粒也在质膜下方形成一明亮光环，与培养36h无明显差别。 ×200
Fig.4 The CGs form a bright monolayer under the membrane after IVM for 48 hours. There is no difference from those of 36 hours. ×200
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图5 体外成熟36h卵母细胞受精4.5h后，皮质颗粒内容物与透明带外表面结合。 ×200
Fig.5 Binding of CGs content to the ZP surface after 4.5 hours of IVF with the oocytes matured in vitro for 36 hours. ×200
图6 体外成熟48h卵母细胞受精3h后，皮质颗粒内容物与透明带外表面结合。 ×200
Fig.6 Binding of CGs content to the ZP surface after 3 hours of IVF with the oocytes matured in vitro for 48 hours. ×200
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【基金项目】 东北农业大学青年基金资助项目
【作者简介】 杨信志(1967—)，男(汉族)，山东即墨人，硕士，讲师
参考文献
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【收稿日期】 1999-07-05
【修回日期】 2000-01-14, http://www.100md.com