藻胆蛋白与荧光免疫分析
作者：吴萍
单位：吴萍(中国科学院生化工程国家重点实验室，北京 100080)
关键词：藻胆蛋白；能量转移；荧光免疫分析
生理科学进展000120 摘要 藻胆蛋白是一种新型的荧光标记物，在荧光免疫分析方面有着广阔的应用前景。其应用领域主要包括荧光激活细胞分类、流式细胞荧光测定、荧光免疫检测以及单分子检测等。在可溶性抗原、抗体检测方面的研究则开展较少。
学科分类号 Q819;R392
荧光免疫分析(FIA)是历史最悠久的一种标记免疫分析，灵敏度很高。它在传染病诊断上有着极为广泛的用途。但是生物样品(如血清)本身的荧光位于400～600nm，与常用的荧光标记物(如FITC)的荧光发射光谱相重叠，自然本底荧光干扰过大，影响检测的敏感性。而藻胆蛋白是一种独特的荧光探针。1982年由美国加州大学的Glazer首先将其开发成荧光试剂投放于市场，藻胆蛋白作为荧光标记物和诊断试剂的价值才开始得到重视，目前已广泛应用于免疫组化、荧光免疫分析等领域。
, 百拇医药
一、藻胆蛋白
藻胆蛋白是海洋藻类中含量颇丰的捕光作用色素，是一类呈红、蓝或紫色的水溶性蛋白质,主要分为藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、异藻蓝蛋白(APC)等三大类。
藻胆蛋白荧光探针具有优良的荧光性质：水溶液中高度可溶，非特异性结合影响小；所发荧光不为其它生物物质自发猝灭；吸光度和荧光量子产率高，且与环境pH值无关，有利于提高灵敏度；STOKES位移较大；易于与其它分子结合形成交联体，可用于多色标记，实现多组分同时测定；适合长期保存，pH4～11的范围内光谱特性几乎不变。
这些独特的优点克服了传统荧光标记物在检测中的荧光背景大、易猝灭等缺点，并有利于激发光的选择，大大提高了荧光检测的敏感性。
二、藻胆蛋白的研究及应用
(一)能量转移 STOKES位移是荧光分析中的重要参数，它的大小决定着荧光探针的可靠性和灵敏性。荧光标记物如具有较大的STOKES位移，荧光检测时来自瑞利散射、拉曼散射的干扰就较小。STOKES位移越大，发射的荧光就越靠近可见光谱的红端，这有利于分析生化样品。因为在红区生化基质和血清成分造成的荧光干扰剧减，检测灵敏度可显著提高。
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藻胆蛋白具有较大的STOKES位移。其中藻红蛋白就高达80nm，直接用作探针，就能达到较高的灵敏度。如要进一步提高灵敏度，一种方法就是利用能量转移原理，选择适宜的配对试剂构成能量转移试剂对制备性质稳定、可标记性强、荧光性能更好的藻胆蛋白偶联荧光标记物来增大STOKES位移。在免疫荧光分析中，藻胆蛋白既是有效的能量供体，又是适宜的受体材料。除不同种类的藻胆蛋白之间可形成交联体复合物外，其它荧光染料如荧光素、德克萨斯红等都可与藻胆蛋白组成能量转移试剂对。1996年，Roederer等[1]以花青染料Cy7与PE、APC分别交联，其中Cy7与PE的交联物的STOKES位移高达300nm。荧光级联的PE-APC交联体，STOKES位移也将近200nm，能量转移效率高达90%。
(二)藻胆蛋白共价偶联物 藻胆蛋白包含大量的赖氨酸残基，B-PE分子含有约85个赖氨酸残基，而APC含36个。通过这些赖氨酸残基侧链，藻胆蛋白可与其它生物大分子相偶联。常用的方法是使用异双功能试剂(如SPDP等)与待偶联的大分子反应，使其衍生化；以吡啶二硫化物使藻胆蛋白巯基化，再将两者按一定比例混合并温育，得藻胆蛋白共价偶合物[2]。
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在提纯藻胆蛋白偶联产物时，凝胶过滤不失为一种有效手段。以琼脂糖凝胶为填料的层析柱，其分离效果就很理想。此外，基于羟基磷灰石的离子交换色谱也较为实用。
(三)应用领域 藻胆蛋白的应用领域主要包括荧光激活细胞分类、流式细胞荧光测定、荧光免疫检测以及单分子检测等多项技术领域。但在检测可溶性抗原、抗体方面，藻胆蛋白荧光探针的试剂化、商品化程度还不很高。
1. 固相荧光免疫测定：采用固相免疫测定原理，直接以藻胆蛋白取代传统的荧光标记染料(荧光素)来制备标记抗体，检测灵敏度可成倍增加，达到pmol/L的检测限。
1984年由Jolley等[3]提出的微粒富集荧光免疫分析(PCFIA)为提高灵敏度提供了另一条途径。1991年，B-PE作为标记物成功地用于PCFIA捕获抗体固定于乳胶微球，为增强灵敏度和简化检测，与样品血清及B-PE标记单抗试剂充分温育后，微球沉积于膜上，多次清洗后读数。微粒富集法使信噪比提高1000倍。
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2. 均相时间分辨荧光免疫测定：均相免疫荧光分析简便、快速且准确，能量转移是实现这一技术的有效方法。稀土离子的联吡啶穴状体，如Eu3+、Tb3+穴状体具有稳定而强烈的水相荧光，可分别与APC或XL-PC、R-PE或B-PE组成能量转移试剂对，实现能量转移快速均相荧光免疫分析。
1993年，Mathis[4]将Eu的穴状体和异藻蓝蛋白组成能量转移供、受体试剂对，以Eu(TBP)稀土离子穴状体与藻胆蛋白APC分别标记单抗，通过多价抗原由双抗体夹心法构成能量转移供体、受体对，实现能量快速转移，该系统由337nm光激发，发射具有中等寿命的APC特征荧光。由此放大了检测信号，降低了检测样品中非特异性成份的干扰。
3. 抗藻胆蛋白抗体：利用藻胆蛋白的免疫原性质，以抗藻胆蛋白抗体为中介的连接藻胆蛋白和待测抗原物质，这在免疫组化中应用的较多。
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1991年，Lansdorp等[5]将PEAPE法与能量转移原理紧密结合，将PE与花青染料Cy5通过Cy5标记的抗PE抗体而实现非共价偶联，构成能量转移实体，作为一种新型荧光染料，可由氩离子激光器在488nm波长高效激发，发射Cy5的680nm特征荧光。
4.多色荧光检测：藻胆蛋白及其偶联物构成了一系列的荧光探针，呈现多种可区分的荧光。应用于免疫组化，尤其是在细胞多重染色时，不但可同时混合标记，速度快、操作简便，而且不会发生两种染色相互阻断和遮盖的现象；应用于荧光免疫分析，可以实现快速而灵敏的多组分同时测定。
1982年，Glazer等将藻红蛋白首先开发为免疫荧光标记探针，结合传统的荧光素染料改变了一贯以来双色荧光激活细胞分选仪需配备两个激发光源的状况，实现了单激发光源双色荧光标记检测。由于藻胆蛋白荧光探针的开发应用，只需对氩离子激光器光路进行适当改造，即可实现单一激发光源三色免疫荧光检测。1991年，Delia等[6]成功运用改装的氩离子激光器，进行了由氨基香豆素、荧光素、藻红蛋白分别标记的三色荧光检测。
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1983年，Parks等[7]又将另一种藻胆蛋白—异藻蓝蛋白开发为荧光探针，采用双激发光源三色荧光标记的方式来分析鼠B淋巴细胞亚群，所用的三种探针分别为荧光素、藻红蛋白和异藻蓝蛋白。APC的开发不仅增加了荧光染料的种类，同时为氦—氖激光器在荧光免疫检测方面的普及应用提供了广阔前景。自荧光检测问世以来，由于缺乏可在633nm附近被高效激发的荧光探针，氦—氖激光器虽然具有高效、经济、低功率等优点，但在荧光检测中应用较少。APC在633nm波长具有强烈的吸收峰，因此有可能在流式细胞计等荧光检测仪器中引入氦—氖激光器作为光源。Shapiro等[8]在流式细胞计中用氦—氖激光器配伍APC荧光探针检测活化人T淋巴细胞的表面抗原，其检测结果与氩离子激光器配伍荧光素的检测结果相吻合，而且耗能显著降低。
此后，一系列藻胆蛋白荧光探针相继问世，荧光染料的选择范围逐渐扩大。1993年，Gruber等[9]采取人的末梢全血，以单色激光流式细胞计对人体淋巴细胞亚型进行三色免疫荧光的定性、定量分析。所用的三种荧光标记物分别为FITC、PE和PE-Cy5的级联复合物，三种荧光明显区分，可迅速、简便、可靠地实现淋巴细胞分型。
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三、结语
藻胆蛋白是利用海洋生物技术开发成功的第一种高附加值产品，是性能优良的新型荧光标记物。我国藻类资源丰富，藻胆蛋白产品的开发将极大地提高我国产业和产品的技术档次。随着藻种资源的探明、藻胆蛋白提纯工艺的进一步优化，藻胆蛋白在荧光免疫分析方面有着越来越广阔的应用前景。特别是研制可溶性抗原、抗体检测的藻胆蛋白诊断试剂盒将是免疫检测领域的一大热点。
参考文献
1，Roederer M,Kantor AB,Parks DR,et al.Cy7PE and Cy7APC:Bright new probes for immunofluorescence.Cytometry,1996,24∶191～197.
2，Kronick MN.The use of phycobiliproteins as fluorescent labels in immunoassay.J Immunol Meth,1986,92∶1～13.
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3，Jolley ME,Wang CJ,Ekenberg SJ,et al.Particle concentration fluorescence immunoassay (PCFIA):a new,rapid immunoassay technique with high sensitivity.J Immunol Meth,1984,67∶21～26.
4，Mathis G.Rare earth cryptates and homogeneous fluoroimmunoassays with human sera.Clin Chem,1993,39/9∶1953～1959.
5，Lansdorp PM,Smith C,Safford M,et al.Single laser three color immunofluorescence staining procedures based on energy transfer between phycoerythrin and cyanine 5.Cytometry,1991,12∶723～730.
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6，Delia D,Martinez E,Fontanella E,et al.Two- and three-color immunofluorescence using aminocoumarin,fluorescein,and phycoerythrin-labelled antibodies and single laser flow cytometry.Cytometry,1991,12∶537～544.
7，Parks DR,Hardy RR,Herzenberg LA.Three-color immunofluorescence analysis of mouse B-lymphocyte subpopulations.Cytometry,1984,5∶159～168.
8，Shapiro HM,Glazer AN,Christenson L,et al.Immunofluorescence measurement in a flow cytometer using low-power helium-neon laser excitation.Cytometry,1983,4∶276～279.
9，Gruber R,Reiter C,Riethmǘller G.Triple immunofluorescence flow cytometry,using whole blood,of CD4+ and CD8+ lymphocytes expressing CD45RO and CD45RA.J Immunol Meth,1993,163∶173～179., http://www.100md.com
单位：吴萍(中国科学院生化工程国家重点实验室，北京 100080)
关键词：藻胆蛋白；能量转移；荧光免疫分析
生理科学进展000120 摘要 藻胆蛋白是一种新型的荧光标记物，在荧光免疫分析方面有着广阔的应用前景。其应用领域主要包括荧光激活细胞分类、流式细胞荧光测定、荧光免疫检测以及单分子检测等。在可溶性抗原、抗体检测方面的研究则开展较少。
学科分类号 Q819;R392
荧光免疫分析(FIA)是历史最悠久的一种标记免疫分析，灵敏度很高。它在传染病诊断上有着极为广泛的用途。但是生物样品(如血清)本身的荧光位于400～600nm，与常用的荧光标记物(如FITC)的荧光发射光谱相重叠，自然本底荧光干扰过大，影响检测的敏感性。而藻胆蛋白是一种独特的荧光探针。1982年由美国加州大学的Glazer首先将其开发成荧光试剂投放于市场，藻胆蛋白作为荧光标记物和诊断试剂的价值才开始得到重视，目前已广泛应用于免疫组化、荧光免疫分析等领域。
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一、藻胆蛋白
藻胆蛋白是海洋藻类中含量颇丰的捕光作用色素，是一类呈红、蓝或紫色的水溶性蛋白质,主要分为藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、异藻蓝蛋白(APC)等三大类。
藻胆蛋白荧光探针具有优良的荧光性质：水溶液中高度可溶，非特异性结合影响小；所发荧光不为其它生物物质自发猝灭；吸光度和荧光量子产率高，且与环境pH值无关，有利于提高灵敏度；STOKES位移较大；易于与其它分子结合形成交联体，可用于多色标记，实现多组分同时测定；适合长期保存，pH4～11的范围内光谱特性几乎不变。
这些独特的优点克服了传统荧光标记物在检测中的荧光背景大、易猝灭等缺点，并有利于激发光的选择，大大提高了荧光检测的敏感性。
二、藻胆蛋白的研究及应用
(一)能量转移 STOKES位移是荧光分析中的重要参数，它的大小决定着荧光探针的可靠性和灵敏性。荧光标记物如具有较大的STOKES位移，荧光检测时来自瑞利散射、拉曼散射的干扰就较小。STOKES位移越大，发射的荧光就越靠近可见光谱的红端，这有利于分析生化样品。因为在红区生化基质和血清成分造成的荧光干扰剧减，检测灵敏度可显著提高。
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藻胆蛋白具有较大的STOKES位移。其中藻红蛋白就高达80nm，直接用作探针，就能达到较高的灵敏度。如要进一步提高灵敏度，一种方法就是利用能量转移原理，选择适宜的配对试剂构成能量转移试剂对制备性质稳定、可标记性强、荧光性能更好的藻胆蛋白偶联荧光标记物来增大STOKES位移。在免疫荧光分析中，藻胆蛋白既是有效的能量供体，又是适宜的受体材料。除不同种类的藻胆蛋白之间可形成交联体复合物外，其它荧光染料如荧光素、德克萨斯红等都可与藻胆蛋白组成能量转移试剂对。1996年，Roederer等[1]以花青染料Cy7与PE、APC分别交联，其中Cy7与PE的交联物的STOKES位移高达300nm。荧光级联的PE-APC交联体，STOKES位移也将近200nm，能量转移效率高达90%。
(二)藻胆蛋白共价偶联物 藻胆蛋白包含大量的赖氨酸残基，B-PE分子含有约85个赖氨酸残基，而APC含36个。通过这些赖氨酸残基侧链，藻胆蛋白可与其它生物大分子相偶联。常用的方法是使用异双功能试剂(如SPDP等)与待偶联的大分子反应，使其衍生化；以吡啶二硫化物使藻胆蛋白巯基化，再将两者按一定比例混合并温育，得藻胆蛋白共价偶合物[2]。
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在提纯藻胆蛋白偶联产物时，凝胶过滤不失为一种有效手段。以琼脂糖凝胶为填料的层析柱，其分离效果就很理想。此外，基于羟基磷灰石的离子交换色谱也较为实用。
(三)应用领域 藻胆蛋白的应用领域主要包括荧光激活细胞分类、流式细胞荧光测定、荧光免疫检测以及单分子检测等多项技术领域。但在检测可溶性抗原、抗体方面，藻胆蛋白荧光探针的试剂化、商品化程度还不很高。
1. 固相荧光免疫测定：采用固相免疫测定原理，直接以藻胆蛋白取代传统的荧光标记染料(荧光素)来制备标记抗体，检测灵敏度可成倍增加，达到pmol/L的检测限。
1984年由Jolley等[3]提出的微粒富集荧光免疫分析(PCFIA)为提高灵敏度提供了另一条途径。1991年，B-PE作为标记物成功地用于PCFIA捕获抗体固定于乳胶微球，为增强灵敏度和简化检测，与样品血清及B-PE标记单抗试剂充分温育后，微球沉积于膜上，多次清洗后读数。微粒富集法使信噪比提高1000倍。
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2. 均相时间分辨荧光免疫测定：均相免疫荧光分析简便、快速且准确，能量转移是实现这一技术的有效方法。稀土离子的联吡啶穴状体，如Eu3+、Tb3+穴状体具有稳定而强烈的水相荧光，可分别与APC或XL-PC、R-PE或B-PE组成能量转移试剂对，实现能量转移快速均相荧光免疫分析。
1993年，Mathis[4]将Eu的穴状体和异藻蓝蛋白组成能量转移供、受体试剂对，以Eu(TBP)稀土离子穴状体与藻胆蛋白APC分别标记单抗，通过多价抗原由双抗体夹心法构成能量转移供体、受体对，实现能量快速转移，该系统由337nm光激发，发射具有中等寿命的APC特征荧光。由此放大了检测信号，降低了检测样品中非特异性成份的干扰。
3. 抗藻胆蛋白抗体：利用藻胆蛋白的免疫原性质，以抗藻胆蛋白抗体为中介的连接藻胆蛋白和待测抗原物质，这在免疫组化中应用的较多。
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1991年，Lansdorp等[5]将PEAPE法与能量转移原理紧密结合，将PE与花青染料Cy5通过Cy5标记的抗PE抗体而实现非共价偶联，构成能量转移实体，作为一种新型荧光染料，可由氩离子激光器在488nm波长高效激发，发射Cy5的680nm特征荧光。
4.多色荧光检测：藻胆蛋白及其偶联物构成了一系列的荧光探针，呈现多种可区分的荧光。应用于免疫组化，尤其是在细胞多重染色时，不但可同时混合标记，速度快、操作简便，而且不会发生两种染色相互阻断和遮盖的现象；应用于荧光免疫分析，可以实现快速而灵敏的多组分同时测定。
1982年，Glazer等将藻红蛋白首先开发为免疫荧光标记探针，结合传统的荧光素染料改变了一贯以来双色荧光激活细胞分选仪需配备两个激发光源的状况，实现了单激发光源双色荧光标记检测。由于藻胆蛋白荧光探针的开发应用，只需对氩离子激光器光路进行适当改造，即可实现单一激发光源三色免疫荧光检测。1991年，Delia等[6]成功运用改装的氩离子激光器，进行了由氨基香豆素、荧光素、藻红蛋白分别标记的三色荧光检测。
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1983年，Parks等[7]又将另一种藻胆蛋白—异藻蓝蛋白开发为荧光探针，采用双激发光源三色荧光标记的方式来分析鼠B淋巴细胞亚群，所用的三种探针分别为荧光素、藻红蛋白和异藻蓝蛋白。APC的开发不仅增加了荧光染料的种类，同时为氦—氖激光器在荧光免疫检测方面的普及应用提供了广阔前景。自荧光检测问世以来，由于缺乏可在633nm附近被高效激发的荧光探针，氦—氖激光器虽然具有高效、经济、低功率等优点，但在荧光检测中应用较少。APC在633nm波长具有强烈的吸收峰，因此有可能在流式细胞计等荧光检测仪器中引入氦—氖激光器作为光源。Shapiro等[8]在流式细胞计中用氦—氖激光器配伍APC荧光探针检测活化人T淋巴细胞的表面抗原，其检测结果与氩离子激光器配伍荧光素的检测结果相吻合，而且耗能显著降低。
此后，一系列藻胆蛋白荧光探针相继问世，荧光染料的选择范围逐渐扩大。1993年，Gruber等[9]采取人的末梢全血，以单色激光流式细胞计对人体淋巴细胞亚型进行三色免疫荧光的定性、定量分析。所用的三种荧光标记物分别为FITC、PE和PE-Cy5的级联复合物，三种荧光明显区分，可迅速、简便、可靠地实现淋巴细胞分型。
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三、结语
藻胆蛋白是利用海洋生物技术开发成功的第一种高附加值产品，是性能优良的新型荧光标记物。我国藻类资源丰富，藻胆蛋白产品的开发将极大地提高我国产业和产品的技术档次。随着藻种资源的探明、藻胆蛋白提纯工艺的进一步优化，藻胆蛋白在荧光免疫分析方面有着越来越广阔的应用前景。特别是研制可溶性抗原、抗体检测的藻胆蛋白诊断试剂盒将是免疫检测领域的一大热点。
参考文献
1，Roederer M,Kantor AB,Parks DR,et al.Cy7PE and Cy7APC:Bright new probes for immunofluorescence.Cytometry,1996,24∶191～197.
2，Kronick MN.The use of phycobiliproteins as fluorescent labels in immunoassay.J Immunol Meth,1986,92∶1～13.
, 百拇医药
3，Jolley ME,Wang CJ,Ekenberg SJ,et al.Particle concentration fluorescence immunoassay (PCFIA):a new,rapid immunoassay technique with high sensitivity.J Immunol Meth,1984,67∶21～26.
4，Mathis G.Rare earth cryptates and homogeneous fluoroimmunoassays with human sera.Clin Chem,1993,39/9∶1953～1959.
5，Lansdorp PM,Smith C,Safford M,et al.Single laser three color immunofluorescence staining procedures based on energy transfer between phycoerythrin and cyanine 5.Cytometry,1991,12∶723～730.
, 百拇医药
6，Delia D,Martinez E,Fontanella E,et al.Two- and three-color immunofluorescence using aminocoumarin,fluorescein,and phycoerythrin-labelled antibodies and single laser flow cytometry.Cytometry,1991,12∶537～544.
7，Parks DR,Hardy RR,Herzenberg LA.Three-color immunofluorescence analysis of mouse B-lymphocyte subpopulations.Cytometry,1984,5∶159～168.
8，Shapiro HM,Glazer AN,Christenson L,et al.Immunofluorescence measurement in a flow cytometer using low-power helium-neon laser excitation.Cytometry,1983,4∶276～279.
9，Gruber R,Reiter C,Riethmǘller G.Triple immunofluorescence flow cytometry,using whole blood,of CD4+ and CD8+ lymphocytes expressing CD45RO and CD45RA.J Immunol Meth,1993,163∶173～179., http://www.100md.com