调节Ryanodine受体的相关蛋白
作者：黄晓莉 肖杭
单位：黄晓莉(南京医科大学应用毒理研究所神经毒理室,南京 210029)；肖杭(南京医科大学应用毒理研究所神经毒理室,南京 210029)
关键词：Ryanodine受体；钙释放通道；蛋白；调节
摘要 Ryanodine受体摘要 Ryanodine受体(RyR)是存在于内质网/ 肌浆网上(ER/ SR)的一种钙释放通道。它能迅速地将Ca2+从ER/SR中释放出来，从而发挥一系列的生理功能。RyR是一种颇复杂的分子，其位于胞质的亚基上有大量可供作用物结合的位点,控制构成离子通道的亚基的活性。其中，一些内源性蛋白对RyR的活性有重要的调节作用。本文主要介绍DHPRs、Triadin、FKBP等这些与RyR功能有密切关系的蛋白。
学科分类号 R337
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细胞内游离Ca2+浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础,它的变化是钙离子跨膜转运和细胞内钙库释放、摄取钙离子等动态平衡的结果。Ryanodine受体(RyR)是最主要的一种细胞内钙释放通道。自1987年证明骨骼肌型RyR存在以来，Ryanodine受体的结构和药理学性质等方面的研究已取得较大的进展[1]。研究发现，RyR受到许多内源性蛋白的作用，从而影响其诱导的胞内钙释放，进一步影响细胞的各项生理功能。
一、二氢吡啶受体
二氢吡啶受体(dihydropyridine receptor,DHPRs)是细胞膜上的一种L型钙通道,它存在于多种组织中，但在骨骼肌、心肌和脑中含量最高。骨骼肌中的DHPR由5个亚基(α1、α2、β、γ和δ)构成，其它组织中的DHPR缺少δ亚基。α1亚单位构成通道的中心孔径，它由4个同源重复序列构成(Ⅰ～Ⅳ)，每个序列又包含7个α螺旋跨膜结构。在肌肉兴奋收缩偶联过程中，有两个必不可少的因素，即细胞内大量Ca2+的快速聚集和肌膜的去极化。前者可通过SR上的RyR来完成，而后者可由DHPR来感受。这就提出两者之间相互作用的可能性。Sham等发现通过DHPR进入的钙比通过INa-Ca进入的钙更易导致钙释放。Cannell等通过计算机模拟技术发现RyR对DHPR引起的钙内流的反应相当迅速，约为0.4ms。此外，Cheng等在静息大鼠心肌中观察到受Ryanodine影响的钙火花，其后在去极化条件下观察到同样受Ryanodine影响的诱发钙火花，且能被Cd2+阻断。这些实验表明了DHPR和RyR之间存在功能上的偶联。Shacklock等用双通道共聚焦显微镜发现，大鼠心室肌细胞中85%的钙火花集中在横小管0.5μm范围内。Lewis-Carl等用免疫荧光双标记法发现兔心脏中DHPR和RyR的标记信号是重叠的，说明两者位置非常接近。现在认为RyR在重肌浆网(HSR)的一个特殊区域即连接性肌浆网(jSR)上高度密集。而DHPR位于与RyR位置相对横小管膜上。此二者位置的靠近提示可能存在由两者组成的释放单位。
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人们为了阐明RyR和DHPR在兴奋收缩偶联中的相互作用，进行了大量的实验。这其中，两种特殊的骨骼肌e-c偶联成分突变动物模型发挥了关键作用。一是自发型突变体鼠, 该鼠缺失一个核苷酸(4010)，从而导致DHPR的α1亚单位的翻译阅读框架的改变。第二个模型是RyR1突变体鼠，该鼠肌细胞缺乏e-c偶联和RyR的足结构。如果用DHPR亚基和RyR1的cDNA分别转染这两个突变体后，原来的骨骼肌e-c偶联恢复[2]。
Tanabe等为进一步研究RYR和DHPR之间的关系，用心肌细胞DHPRα1亚基的cDNA转染自发型突变体鼠，出现类似于心肌的兴奋收缩偶联。他们利用各种骨骼肌和心肌的DHPRα1亚基的cDNA嵌合体分别转染该鼠，最后发现DHPRα1亚基上第Ⅱ、Ⅲ跨膜序列之间的环状结构Ⅱ～Ⅲ在骨骼肌型兴奋收缩偶联中发挥重要作用。Lu[3]等合成了骨骼肌和心肌DHPRα1亚基的Ⅱ～Ⅲ环结构，并用Ryanodine结合实验和单通道记录等方法来研究与RyR之间的关系。结果显示，无论是来自骨骼肌还是心肌，只要纳摩尔浓度就可激活RyR1，对RyR2则无作用。关于Ⅱ～Ⅲ环与RyR的结合位置，因采用的技术不同，得出的结论也不同。例如，用RyR1的cDNA或RyR1和RyR2的cDNA嵌合体分别转染RyR1突变鼠，结果显示RyR1上的“D2”区(对应1303～1406残基)是骨骼肌型兴奋收缩偶联的基础。但用RyR2的D2区替换RyR1的D2区，同样也能恢复骨骼肌型兴奋收缩偶联。此外，有人对RyR1 N末端的体外翻译产物进行研究，认为只有Leu-922～Asp-1112这个肽段可与DHPRα1Ⅱ～Ⅲ环结合，而RyR2上的同源片段却无此作用[4]。最近一项研究表明，在Ⅱ～Ⅲ环上有一肽段A(Thr-671～Leu-690)是能够刺激骨骼肌RyR的最小单位[5]。
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二、Triadin
Triadin主要存在于jSR上，分子量为95kD。它与RyR在量上呈1∶1关系。Triadin是被发现的第一个与DHPR形成复合物，又与RyR结合的蛋白。这暗示了它在RyR和DHPR的相互作用中发挥作用,它将两者在jSR面连接起来。支持这一假说的实验有：(1)DHPR和RyR的单抗与triadin的免疫沉淀反应； (2)抗triadin抗体对SR中Ca2+释放的作用[2]，等等。研究者针对triadin在两者之间的作用，提出了两种模型。一种认为triadin重复跨jSR膜，且在SR腔内侧互相交联，但它的胞质侧的环状结构伸向胞质中，并同时和DHPR、RyR连接。另一种认为triadin有一个位于胞质的短N末端、一个单跨膜区以及一个位于SR腔的长的并带有较高正电荷的C末端，后者在SR腔内与RyR的环状结构相连。但Knudson等(1993)研究认为triadin的N末端很短，不足以与DHPR连接，所以，它们的连接关系需进一步研究。尽管triadin和RyR的结合部位有不同的看法，但结合已得到了普遍的认同。其中，triadin和RyR腔内环化结构所带电荷的相反则有非常重要的意义[6]。
, 百拇医药
基于以上认识， Protasi[7]认为骨骼肌细胞三联体处SR上RyR与横小管膜上的DHPR以及triadin等蛋白联系紧密，兴奋信号通过这些蛋白的相互作用，最终传递给RyR，促使其打开并释放钙，引起肌肉的收缩。他还在缺少RyR1的骨骼肌细胞IB5中发现DHPR缺少了在正常骨骼肌细胞中的四聚体结构，在用编码RyR1的cDNA转染IB5细胞，DHPR则恢复了四聚体结构，这进一步说明RyR和DHPR之间在功能上存在着密切的联系。
三、FKBPs
FKBPs是一类能与免疫抑制剂FK506特异性结合的蛋白家族，又称FK506结合蛋白。在早先对RyR的研究中发现，分离出的RyR和原位RyR其功能不一致，不论是从肌肉中纯化出的RyR，还是经克隆并在非肌肉细胞上表现出RyR均表现为传导不全。后证实是因为RyR足结构上缺少一种小分子蛋白FKBP。在FKBPs家族中，研究最多的是一种分布于多种组织、分子量为12kD的FKBP12。Timerman等认为FKBP12与RyR1以紧密相连的复合体形式存在，且与通道在数量上有4∶1的关系，即组成钙释放通道四聚体的每个单体上结合一个FKBP12。
, 百拇医药
FKBP对RyR功能的调节机制仍不很清楚。Mark等认为FKBP对RyR1的四聚体结构有稳定作用。在无FKBP情况下，通道开放可能性增加，开放增多，每次开放时间短，通道的开放幅度变化很大，并且导致总钙电流的增强、囊泡出现渗漏以及通道对咖啡因的敏感性增加[8]。这些说明了FKBP可能对钙通道的关闭状态起着蛋白构象上的稳定作用。而将FKBP结合到RyR上，可恢复通道的全或无式开放，且平均开放持续时间延长，这些也暗示了RyR四个亚单位对通道释放钙功能的重要性[2]。此外，Mark还发现在用FK506进行免疫抑制疗法时常会出现心功能不全，可能是因为药物抑制了FKBP的脯氨酰异构酶的活性，使FKBP和RyR分离，增加RyR对其激动剂如咖啡因的敏感性，导致钙从SR中漏出。Timerman等发现，缺失FKBP的骨骼肌肌浆网系终池对钙有一定程度的渗漏，钙重摄取的速度明显降低；如果将FKBP重组到缺失FKBP的肌浆网系终池内，钙重摄取速率则恢复到对照水平。
FKBP对RyR的调控还表现在对通道的整流作用。双层脂膜单通道纪录的研究表明，RyR1-FKBP复合体状态下的通道电流表现为单向的由肌浆网腔向胞质传导特性，而反向电流将很快去活。并且，FKBP对RyR1的整流作用还与细胞膜电位有关。这些研究提示，FKBP可能通过改变钙释放通道各亚基构象实现对通道的整流的调控，这种整流特性能有效地防止骨骼肌肌浆网系快速释放钙过程中的反向电流[9]。
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除上述几种蛋白外，细胞中还有一些蛋白，如CaM、S100s、sorcin等，也调节着RyR的活性，尽管对于它们中大多数的特性还不大了解，而这正是该领域中待研究的方面。我们相信，随着研究的进一步深入，这些蛋白-蛋白之间的相互作用会得到更进一步的认识，从而会发现更加新颖独特的RyR调节机制。
国家自然科学基金 (39870702)及江苏省自然科学基金(BK95076301)资助课题
参考文献
1，章晓辉, 朱培闳. Ryanodine受体结构和药理学性质. 生理科学进展, 1997,3∶224～228.
2，Franzini-armstrong C，JW，Kish. Alternate disposition of tetrads in peripheral couplings of skeletal muscie.J，Muscle，Res，Cell Motil,1995,16∶319～324.
, http://www.100md.com
3，Lu X, Xu L， Meiissner G. Activation of the skeletal muscle calcium release channel by a cytoplasmic loop of the dihydropyridine receptor. J Biol Chem,1994,269∶6511～6519.
4，Leong P, MacLennan DH. The cytoplasmic loops between domains II and III and domains III and IV in the skeletal muscle dihydropyridine receptor bind to a contiguous site in the skeletal muscle ryanodine receptor. J Biol Chem 1998, 273∶ 29958～29964.
5，Saiki Y, El-Hayek R， Ikemoto N. Involvement of the Glu724-Pro760 region of the dihydropy-ridine receptor II-III loop in skeletal muscle-type excitation-contraction coupling. ，J Biol Chem, 1999, 274∶7825～7832.
, 百拇医药
6，Coronado R, Morrissettte J, Sukhareva M, et al. Structure and function of ryanodine receptor. Am，J，Physiol，，1994,266∶C1485～C1504.
7，Protasi，F, Franzini-armstrong，C, Allen，PD. Role of ryanodine receptor in the assembly of calcium release units in skeletal muscle.，，J，Cell，Biol，1998,140∶4832～4842.
8，Mark，A. Intracellular calcium-release channels: regulators of cell life and death. Am，J，Physiol，1997,272∶H597～605.
9，Mackrill，J. Protein-protein interactions in intracellular Ca2+-release channel function. Biochem，J， 1999,337∶345～361., http://www.100md.com
单位：黄晓莉(南京医科大学应用毒理研究所神经毒理室,南京 210029)；肖杭(南京医科大学应用毒理研究所神经毒理室,南京 210029)
关键词：Ryanodine受体；钙释放通道；蛋白；调节
摘要 Ryanodine受体摘要 Ryanodine受体(RyR)是存在于内质网/ 肌浆网上(ER/ SR)的一种钙释放通道。它能迅速地将Ca2+从ER/SR中释放出来，从而发挥一系列的生理功能。RyR是一种颇复杂的分子，其位于胞质的亚基上有大量可供作用物结合的位点,控制构成离子通道的亚基的活性。其中，一些内源性蛋白对RyR的活性有重要的调节作用。本文主要介绍DHPRs、Triadin、FKBP等这些与RyR功能有密切关系的蛋白。
学科分类号 R337
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细胞内游离Ca2+浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础,它的变化是钙离子跨膜转运和细胞内钙库释放、摄取钙离子等动态平衡的结果。Ryanodine受体(RyR)是最主要的一种细胞内钙释放通道。自1987年证明骨骼肌型RyR存在以来，Ryanodine受体的结构和药理学性质等方面的研究已取得较大的进展[1]。研究发现，RyR受到许多内源性蛋白的作用，从而影响其诱导的胞内钙释放，进一步影响细胞的各项生理功能。
一、二氢吡啶受体
二氢吡啶受体(dihydropyridine receptor,DHPRs)是细胞膜上的一种L型钙通道,它存在于多种组织中，但在骨骼肌、心肌和脑中含量最高。骨骼肌中的DHPR由5个亚基(α1、α2、β、γ和δ)构成，其它组织中的DHPR缺少δ亚基。α1亚单位构成通道的中心孔径，它由4个同源重复序列构成(Ⅰ～Ⅳ)，每个序列又包含7个α螺旋跨膜结构。在肌肉兴奋收缩偶联过程中，有两个必不可少的因素，即细胞内大量Ca2+的快速聚集和肌膜的去极化。前者可通过SR上的RyR来完成，而后者可由DHPR来感受。这就提出两者之间相互作用的可能性。Sham等发现通过DHPR进入的钙比通过INa-Ca进入的钙更易导致钙释放。Cannell等通过计算机模拟技术发现RyR对DHPR引起的钙内流的反应相当迅速，约为0.4ms。此外，Cheng等在静息大鼠心肌中观察到受Ryanodine影响的钙火花，其后在去极化条件下观察到同样受Ryanodine影响的诱发钙火花，且能被Cd2+阻断。这些实验表明了DHPR和RyR之间存在功能上的偶联。Shacklock等用双通道共聚焦显微镜发现，大鼠心室肌细胞中85%的钙火花集中在横小管0.5μm范围内。Lewis-Carl等用免疫荧光双标记法发现兔心脏中DHPR和RyR的标记信号是重叠的，说明两者位置非常接近。现在认为RyR在重肌浆网(HSR)的一个特殊区域即连接性肌浆网(jSR)上高度密集。而DHPR位于与RyR位置相对横小管膜上。此二者位置的靠近提示可能存在由两者组成的释放单位。
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人们为了阐明RyR和DHPR在兴奋收缩偶联中的相互作用，进行了大量的实验。这其中，两种特殊的骨骼肌e-c偶联成分突变动物模型发挥了关键作用。一是自发型突变体鼠, 该鼠缺失一个核苷酸(4010)，从而导致DHPR的α1亚单位的翻译阅读框架的改变。第二个模型是RyR1突变体鼠，该鼠肌细胞缺乏e-c偶联和RyR的足结构。如果用DHPR亚基和RyR1的cDNA分别转染这两个突变体后，原来的骨骼肌e-c偶联恢复[2]。
Tanabe等为进一步研究RYR和DHPR之间的关系，用心肌细胞DHPRα1亚基的cDNA转染自发型突变体鼠，出现类似于心肌的兴奋收缩偶联。他们利用各种骨骼肌和心肌的DHPRα1亚基的cDNA嵌合体分别转染该鼠，最后发现DHPRα1亚基上第Ⅱ、Ⅲ跨膜序列之间的环状结构Ⅱ～Ⅲ在骨骼肌型兴奋收缩偶联中发挥重要作用。Lu[3]等合成了骨骼肌和心肌DHPRα1亚基的Ⅱ～Ⅲ环结构，并用Ryanodine结合实验和单通道记录等方法来研究与RyR之间的关系。结果显示，无论是来自骨骼肌还是心肌，只要纳摩尔浓度就可激活RyR1，对RyR2则无作用。关于Ⅱ～Ⅲ环与RyR的结合位置，因采用的技术不同，得出的结论也不同。例如，用RyR1的cDNA或RyR1和RyR2的cDNA嵌合体分别转染RyR1突变鼠，结果显示RyR1上的“D2”区(对应1303～1406残基)是骨骼肌型兴奋收缩偶联的基础。但用RyR2的D2区替换RyR1的D2区，同样也能恢复骨骼肌型兴奋收缩偶联。此外，有人对RyR1 N末端的体外翻译产物进行研究，认为只有Leu-922～Asp-1112这个肽段可与DHPRα1Ⅱ～Ⅲ环结合，而RyR2上的同源片段却无此作用[4]。最近一项研究表明，在Ⅱ～Ⅲ环上有一肽段A(Thr-671～Leu-690)是能够刺激骨骼肌RyR的最小单位[5]。
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二、Triadin
Triadin主要存在于jSR上，分子量为95kD。它与RyR在量上呈1∶1关系。Triadin是被发现的第一个与DHPR形成复合物，又与RyR结合的蛋白。这暗示了它在RyR和DHPR的相互作用中发挥作用,它将两者在jSR面连接起来。支持这一假说的实验有：(1)DHPR和RyR的单抗与triadin的免疫沉淀反应； (2)抗triadin抗体对SR中Ca2+释放的作用[2]，等等。研究者针对triadin在两者之间的作用，提出了两种模型。一种认为triadin重复跨jSR膜，且在SR腔内侧互相交联，但它的胞质侧的环状结构伸向胞质中，并同时和DHPR、RyR连接。另一种认为triadin有一个位于胞质的短N末端、一个单跨膜区以及一个位于SR腔的长的并带有较高正电荷的C末端，后者在SR腔内与RyR的环状结构相连。但Knudson等(1993)研究认为triadin的N末端很短，不足以与DHPR连接，所以，它们的连接关系需进一步研究。尽管triadin和RyR的结合部位有不同的看法，但结合已得到了普遍的认同。其中，triadin和RyR腔内环化结构所带电荷的相反则有非常重要的意义[6]。
, 百拇医药
基于以上认识， Protasi[7]认为骨骼肌细胞三联体处SR上RyR与横小管膜上的DHPR以及triadin等蛋白联系紧密，兴奋信号通过这些蛋白的相互作用，最终传递给RyR，促使其打开并释放钙，引起肌肉的收缩。他还在缺少RyR1的骨骼肌细胞IB5中发现DHPR缺少了在正常骨骼肌细胞中的四聚体结构，在用编码RyR1的cDNA转染IB5细胞，DHPR则恢复了四聚体结构，这进一步说明RyR和DHPR之间在功能上存在着密切的联系。
三、FKBPs
FKBPs是一类能与免疫抑制剂FK506特异性结合的蛋白家族，又称FK506结合蛋白。在早先对RyR的研究中发现，分离出的RyR和原位RyR其功能不一致，不论是从肌肉中纯化出的RyR，还是经克隆并在非肌肉细胞上表现出RyR均表现为传导不全。后证实是因为RyR足结构上缺少一种小分子蛋白FKBP。在FKBPs家族中，研究最多的是一种分布于多种组织、分子量为12kD的FKBP12。Timerman等认为FKBP12与RyR1以紧密相连的复合体形式存在，且与通道在数量上有4∶1的关系，即组成钙释放通道四聚体的每个单体上结合一个FKBP12。
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FKBP对RyR功能的调节机制仍不很清楚。Mark等认为FKBP对RyR1的四聚体结构有稳定作用。在无FKBP情况下，通道开放可能性增加，开放增多，每次开放时间短，通道的开放幅度变化很大，并且导致总钙电流的增强、囊泡出现渗漏以及通道对咖啡因的敏感性增加[8]。这些说明了FKBP可能对钙通道的关闭状态起着蛋白构象上的稳定作用。而将FKBP结合到RyR上，可恢复通道的全或无式开放，且平均开放持续时间延长，这些也暗示了RyR四个亚单位对通道释放钙功能的重要性[2]。此外，Mark还发现在用FK506进行免疫抑制疗法时常会出现心功能不全，可能是因为药物抑制了FKBP的脯氨酰异构酶的活性，使FKBP和RyR分离，增加RyR对其激动剂如咖啡因的敏感性，导致钙从SR中漏出。Timerman等发现，缺失FKBP的骨骼肌肌浆网系终池对钙有一定程度的渗漏，钙重摄取的速度明显降低；如果将FKBP重组到缺失FKBP的肌浆网系终池内，钙重摄取速率则恢复到对照水平。
FKBP对RyR的调控还表现在对通道的整流作用。双层脂膜单通道纪录的研究表明，RyR1-FKBP复合体状态下的通道电流表现为单向的由肌浆网腔向胞质传导特性，而反向电流将很快去活。并且，FKBP对RyR1的整流作用还与细胞膜电位有关。这些研究提示，FKBP可能通过改变钙释放通道各亚基构象实现对通道的整流的调控，这种整流特性能有效地防止骨骼肌肌浆网系快速释放钙过程中的反向电流[9]。
, 百拇医药
除上述几种蛋白外，细胞中还有一些蛋白，如CaM、S100s、sorcin等，也调节着RyR的活性，尽管对于它们中大多数的特性还不大了解，而这正是该领域中待研究的方面。我们相信，随着研究的进一步深入，这些蛋白-蛋白之间的相互作用会得到更进一步的认识，从而会发现更加新颖独特的RyR调节机制。
国家自然科学基金 (39870702)及江苏省自然科学基金(BK95076301)资助课题
参考文献
1，章晓辉, 朱培闳. Ryanodine受体结构和药理学性质. 生理科学进展, 1997,3∶224～228.
2，Franzini-armstrong C，JW，Kish. Alternate disposition of tetrads in peripheral couplings of skeletal muscie.J，Muscle，Res，Cell Motil,1995,16∶319～324.
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3，Lu X, Xu L， Meiissner G. Activation of the skeletal muscle calcium release channel by a cytoplasmic loop of the dihydropyridine receptor. J Biol Chem,1994,269∶6511～6519.
4，Leong P, MacLennan DH. The cytoplasmic loops between domains II and III and domains III and IV in the skeletal muscle dihydropyridine receptor bind to a contiguous site in the skeletal muscle ryanodine receptor. J Biol Chem 1998, 273∶ 29958～29964.
5，Saiki Y, El-Hayek R， Ikemoto N. Involvement of the Glu724-Pro760 region of the dihydropy-ridine receptor II-III loop in skeletal muscle-type excitation-contraction coupling. ，J Biol Chem, 1999, 274∶7825～7832.
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6，Coronado R, Morrissettte J, Sukhareva M, et al. Structure and function of ryanodine receptor. Am，J，Physiol，，1994,266∶C1485～C1504.
7，Protasi，F, Franzini-armstrong，C, Allen，PD. Role of ryanodine receptor in the assembly of calcium release units in skeletal muscle.，，J，Cell，Biol，1998,140∶4832～4842.
8，Mark，A. Intracellular calcium-release channels: regulators of cell life and death. Am，J，Physiol，1997,272∶H597～605.
9，Mackrill，J. Protein-protein interactions in intracellular Ca2+-release channel function. Biochem，J， 1999,337∶345～361., http://www.100md.com