内抑素在肿瘤生长和动脉粥样硬化斑块形成中的作用
作者：朱建健 高炜 陈光慧
单位：北京大学医学部心血管基础研究所，北京 100083
关键词：内抑素；肿瘤；动脉粥样硬化
生理科学进展000313 摘要 内抑素是新发现的很强的血管生成抑制剂。它是ⅩⅧ胶原的C末端片断，包含184个氨基酸。内抑素能够特异地抑制内皮细胞增殖和迁移并抑制新生血管生成。内抑素能够有效地抑制肿瘤的生长和转移，为肿瘤的治疗提供了新的希望。内抑素还能够延缓动脉粥样硬化的发展。
学科分类号 R73-3； R543.5
新生血管的生成是实体瘤生长和转移所必需的。肿瘤在生长过程中能够分泌一系列的促血管生成因子，如成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等。近年来的研究提出抑制肿瘤血管生成可以有效地阻止肿瘤生长和转移。这已经成为新的治疗肿瘤的策略。近几年已克隆了一系列血管生成抑制因子如内抑素、血管抑素、组织型金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)等。其中关于内抑素(endostatin)的研究最多。它是从小鼠内皮瘤细胞株的培养液中分离出来的一种内皮细胞增殖的特异性抑制剂，具有很强的抑制血管生成的作用。它现已应用于临床。此外，内抑素尚能延缓动脉粥样硬化的发展。
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一、内抑素的克隆表达
1997年，O'Reilly从小鼠的血管内皮瘤细胞株(EOMA细胞)培养基中分离出了不同于血管抑素的血管生成抑制剂并将其命名为内抑素[1]。这是一种分子量为20kD的能够亲和肝素的蛋白，它能够特异性抑制内皮细胞的增殖。对其氨基酸序列的分析表明它是ⅩⅧ胶原的C末端片断，包含184个氨基酸。ⅩⅧ胶原是由Oh等于1994年首先报道的一种胶原样蛋白家族成员。人的ⅩⅧ胶原的基因定位于21q22.3，可以编码1 516个氨基酸的蛋白质，它主要分布于血管周围区域。ⅩⅧ胶原的C端有NC1区，约300个氨基酸残基，包括N端结合区(约50个残基)，中央的蛋白酶敏感区(约70个残基)和C端的稳定的内抑素区(约180个残基)[2]。内抑素包含有锌结合位点，位于第1、3、11位的组氨酸和第76位的天冬氨酸，内抑素的N端环绕锌形成二聚体结构，N端的锌结合位点与前体紧密相连，说明锌可能参与修饰后抑制血管生成活性的激活或修饰过程本身。内抑素有11个精氨酸残基，可与肝素结合。
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由于内抑素是ⅩⅧ胶原的一部分，本身没有信号肽，因此在表达重组内抑素时需加一个外源的信号肽才能成为分泌蛋白。常用的信号序列有ⅩⅧ胶原和Igκ链的分泌信号序列。O'Reilly等构建了内抑素的原核表达载体，在大肠杆菌中表达出有活性的内抑素，但表达的内抑素不溶于水，难以在体外检测其活性。Dhanabal构建了其真核表达载体，从酵母中生产出水溶性内抑素[2]。在蛋白纯化过程中，内抑素的构型易发生改变，可直接影响到其活性，因此不同实验室中内抑素药效试验结果不尽相同。
二、 内抑素的生物学作用
(一)内抑素特异抑制内皮细胞增殖和血管生成 内抑素在体内以可溶状态存在，它是由ⅩⅧ胶原经过蛋白酶作用而裂解出的一个活性片断。在O'Reilly的研究中，杆状病毒生产的重组内抑素能够特异地抑制牛毛细血管内皮细胞增殖，并呈现剂量依赖效应。而在其他非内皮起源的细胞如牛主动脉平滑肌细胞、牛视网膜色素上皮细胞、Lewis肺癌细胞或血管内皮瘤细胞中，即使增量十倍都未观察到显著的抑制作用。因此，内抑素对内皮细胞具有特异性抑制作用。在剂量为10～20μg时，重组内抑素能够显著抑制鸡绒毛膜尿囊(CAM)中的血管生成[1]。在Dhanabal构建的酵母表达内抑素系统中，还观察到内抑素可以抑制bFGF诱发的内皮细胞的迁移。对VEGF和bFGF诱导的血管生成，内抑素(20μg)的抑制作用分别为47%和39%[2]。
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ⅩⅧ胶原本身对调节血管内皮生长并无作用。ⅩⅧ胶原基因敲除的纯合子小鼠发育正常，并未表现出血管形成的异常。因此ⅩⅧ胶原在胚胎发育中不是作为一种血管生长的负调控因子，而是作为一种具有调控活性的因子的来源。当血管被诱导生成时，完整的ⅩⅧ胶原分子被蛋白酶水解，释放出具有抑制血管内皮生长活性的C端片断——内抑素。直至目前对内抑素产生的调控机制仍不了解，这都有待于进一步工作的阐明。
如上所述，内抑素含有11个精氨酸，与肝素有很高的亲和力。内抑素能够降低IGF-1和bFGF的活性，可能是通过与生长因子信号通路有关的硫酸肝素结合而达到的。另有研究表明，内抑素可诱发内皮细胞凋亡，加入内抑素可明显降低Bcl-2和Bcl-xL存活蛋白的表达[3]。
这也可能是内抑素抑制内皮增殖的机制之一。近来有一项关于血管抑素(angiostatin)的研究表明血管抑素可与内皮细胞膜上的ATP合成酶的α/β亚单位结合，造成内皮细胞中ATP减少，从而降低其对缺氧的耐受力并造成不可逆损伤[4]。这为研究内抑素作用机制提供了新的思路。目前对内抑素作用机制还不清楚，尚需进一步研究。
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(二)内抑素可抑制肿瘤的生长和转移 O'Reilly证明内抑素对Lewis肺癌、T241纤维肉瘤、EOMA血管内皮瘤、B16F10黑色素瘤的体内生长均有抑制作用。内抑素皮下注射2.5 mg/kg，每天一次，治疗15天，对Lewis肺癌的抑制率约为53%，在10mg/kg剂量下，肿瘤生长抑制率为97%，在20mg/kg时，几乎全部的肿瘤被抑制。而且在治疗中未发现有药物毒性的表现。在其他几种肿瘤模型中也观察到同样效果。另外发现给予每天0.3mg/kg皮下注射，可几乎全部抑制Lewis肺癌转移灶的生长[1]。
Blezinger等肌肉内注射含内抑素基因的质粒，结果表明，应用240μg质粒肌肉注射每周一次共两周，治疗第13天，肾癌和Lewis肺癌生长被抑制40%。对肾癌肺转移的模型的研究表明，基因治疗能显著抑制转移灶的生长，肺转移灶的数目下降了85%，肺重量较对照减轻32%[5]。Chen应用编码内抑素和血管抑素的质粒与脂质体复合物治疗实验性乳腺癌，瘤内注射的抑制率分别为49%和36%，静脉注射内抑素的抑制率为40%[6]。结果提示，应用内抑素基因治疗肿瘤亦有明显效果，且一次注射，长期有效。内抑素抑制肿瘤生长可能与其抑制血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡有关。血管生成在肿瘤生长中起重要作用，一个内皮细胞可支持50～100个肿瘤细胞的生长。有研究表明，肿瘤细胞离血管越远，其增殖率亦越低，这与其氧供和营养不足有关。在肿瘤组织中，肿瘤细胞的数目与内皮细胞数目是相关的，它们之间能够互相促进，内皮细胞越多，血管越丰富，肿瘤细胞增殖率也越高。因此抑制血管生长能够显著抑制肿瘤生长。内抑素还可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制其生长。O'Reilly研究表明内抑素治疗组较对照组中肿瘤细胞凋亡增加了7倍[1]。Blezinger的研究也发现内抑素基因治疗可促进肿瘤细胞凋亡[5]。但目前关于内抑素诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚不十分了解，有待于进一步阐明。
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(三)内抑素能够延缓动脉粥样硬化的发展 内膜增生是动脉粥样斑块形成的一个重要机制，而内膜下血管的形成是斑块形成的必需条件。Moulton利用Apo E缺失突变的小鼠制作动脉粥样硬化的模型，从第6周起给予胆固醇饲料喂养，从第20周开始以20mg/kg内抑素皮下注射，每天一次，持续16周，可明显抑制动脉粥样斑块的生长，主动脉起始部斑块生长的抑制率可高达85%[7]。在正常血管中，血管壁中的微血管网局限于外膜中，在动脉粥样硬化的血管中，血管网变得更加丰富并延伸至斑块的内膜。这些内膜血管大部分是从原有的外膜血管网中分支而来，斑块血管中内皮细胞增殖率可高达43%。这些新生血管可促进炎症细胞向斑块中浸润并诱发正反馈调节而促进斑块生长。另外，当斑块生长超过一定厚度(>0.25mm)时，单纯依靠营养物质从管腔浸润已不能满足其代谢需要，血管生成成为斑块生长必不可少的前提条件。内抑素可抑制斑块内膜血管生成从而抑制动脉粥样硬化斑块的生长。Moulton等还发现，在内膜血管增生期(20～36周)给予内抑素治疗显著抑制斑块的生长(85%)，而当内膜血管已经建立后(32～48周)治疗，抑制效果就会减弱。在动脉粥样硬化的早期，内膜血管还未增生(6～22周)时给予内抑素对斑块生长并无抑制作用。这说明内抑素主要是通过抑制内膜血管生成而抑制斑块生长的。
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三、结语
内抑素是新发现的强有力的血管生成抑制剂。它的抗肿瘤作用给肿瘤治疗带来了新的思路和希望。目前内抑素已完成临床前研究进入临床试验。内抑素的抑制动脉粥样硬化发展的作用为内抑素增添了新的应用价值。因此，进一步研究血管的生成和抑制，开拓新的血管生成和抑制剂不仅具有重要的理论意义，亦具有重要的应用价值。
参考文献
1，O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: A endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997, 88∶277～285.
2，Dhanabal M, Ramchandran R, Volk R, et al. Endostatin: Yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma. Cancer Research, 1999, 59∶189～197.
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3，Dhanabal M, Ramchandran R, Waterman MJ, et al. Endostatin induces endothelial cell apoptosis. J Biol Chem, 1999, 274∶11721～11726.
4，Moser TL, Stack MS, Asplin L, et al. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells. Cell Biology, 1999, 96∶2811～2816.
5，Blezinger P, Wang J, Gondo M, et al. Systemic inhibition of tumor growth and tumor metastases by intramuscular administration of the endostatin gene. Nat Biotechnol, 1999, 17∶343～348.
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6，Chen QR, Kumar D, Stass SA, et al. Liposome complexed to plasmids encoding angiostatin and endostatin inhibit breast cancer in nude mice. Cancer Research, 1999, 59∶3308～3312.
7，Moulton KS, Heller E, Konerding MA, et al. Angiogenesis inhibitors endostatin or TNP-470 reduce intimal neovascularization and plaque growth in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation,1999, 99∶1726～1732., http://www.100md.com
单位：北京大学医学部心血管基础研究所，北京 100083
关键词：内抑素；肿瘤；动脉粥样硬化
生理科学进展000313 摘要 内抑素是新发现的很强的血管生成抑制剂。它是ⅩⅧ胶原的C末端片断，包含184个氨基酸。内抑素能够特异地抑制内皮细胞增殖和迁移并抑制新生血管生成。内抑素能够有效地抑制肿瘤的生长和转移，为肿瘤的治疗提供了新的希望。内抑素还能够延缓动脉粥样硬化的发展。
学科分类号 R73-3； R543.5
新生血管的生成是实体瘤生长和转移所必需的。肿瘤在生长过程中能够分泌一系列的促血管生成因子，如成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等。近年来的研究提出抑制肿瘤血管生成可以有效地阻止肿瘤生长和转移。这已经成为新的治疗肿瘤的策略。近几年已克隆了一系列血管生成抑制因子如内抑素、血管抑素、组织型金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)等。其中关于内抑素(endostatin)的研究最多。它是从小鼠内皮瘤细胞株的培养液中分离出来的一种内皮细胞增殖的特异性抑制剂，具有很强的抑制血管生成的作用。它现已应用于临床。此外，内抑素尚能延缓动脉粥样硬化的发展。
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一、内抑素的克隆表达
1997年，O'Reilly从小鼠的血管内皮瘤细胞株(EOMA细胞)培养基中分离出了不同于血管抑素的血管生成抑制剂并将其命名为内抑素[1]。这是一种分子量为20kD的能够亲和肝素的蛋白，它能够特异性抑制内皮细胞的增殖。对其氨基酸序列的分析表明它是ⅩⅧ胶原的C末端片断，包含184个氨基酸。ⅩⅧ胶原是由Oh等于1994年首先报道的一种胶原样蛋白家族成员。人的ⅩⅧ胶原的基因定位于21q22.3，可以编码1 516个氨基酸的蛋白质，它主要分布于血管周围区域。ⅩⅧ胶原的C端有NC1区，约300个氨基酸残基，包括N端结合区(约50个残基)，中央的蛋白酶敏感区(约70个残基)和C端的稳定的内抑素区(约180个残基)[2]。内抑素包含有锌结合位点，位于第1、3、11位的组氨酸和第76位的天冬氨酸，内抑素的N端环绕锌形成二聚体结构，N端的锌结合位点与前体紧密相连，说明锌可能参与修饰后抑制血管生成活性的激活或修饰过程本身。内抑素有11个精氨酸残基，可与肝素结合。
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由于内抑素是ⅩⅧ胶原的一部分，本身没有信号肽，因此在表达重组内抑素时需加一个外源的信号肽才能成为分泌蛋白。常用的信号序列有ⅩⅧ胶原和Igκ链的分泌信号序列。O'Reilly等构建了内抑素的原核表达载体，在大肠杆菌中表达出有活性的内抑素，但表达的内抑素不溶于水，难以在体外检测其活性。Dhanabal构建了其真核表达载体，从酵母中生产出水溶性内抑素[2]。在蛋白纯化过程中，内抑素的构型易发生改变，可直接影响到其活性，因此不同实验室中内抑素药效试验结果不尽相同。
二、 内抑素的生物学作用
(一)内抑素特异抑制内皮细胞增殖和血管生成 内抑素在体内以可溶状态存在，它是由ⅩⅧ胶原经过蛋白酶作用而裂解出的一个活性片断。在O'Reilly的研究中，杆状病毒生产的重组内抑素能够特异地抑制牛毛细血管内皮细胞增殖，并呈现剂量依赖效应。而在其他非内皮起源的细胞如牛主动脉平滑肌细胞、牛视网膜色素上皮细胞、Lewis肺癌细胞或血管内皮瘤细胞中，即使增量十倍都未观察到显著的抑制作用。因此，内抑素对内皮细胞具有特异性抑制作用。在剂量为10～20μg时，重组内抑素能够显著抑制鸡绒毛膜尿囊(CAM)中的血管生成[1]。在Dhanabal构建的酵母表达内抑素系统中，还观察到内抑素可以抑制bFGF诱发的内皮细胞的迁移。对VEGF和bFGF诱导的血管生成，内抑素(20μg)的抑制作用分别为47%和39%[2]。
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ⅩⅧ胶原本身对调节血管内皮生长并无作用。ⅩⅧ胶原基因敲除的纯合子小鼠发育正常，并未表现出血管形成的异常。因此ⅩⅧ胶原在胚胎发育中不是作为一种血管生长的负调控因子，而是作为一种具有调控活性的因子的来源。当血管被诱导生成时，完整的ⅩⅧ胶原分子被蛋白酶水解，释放出具有抑制血管内皮生长活性的C端片断——内抑素。直至目前对内抑素产生的调控机制仍不了解，这都有待于进一步工作的阐明。
如上所述，内抑素含有11个精氨酸，与肝素有很高的亲和力。内抑素能够降低IGF-1和bFGF的活性，可能是通过与生长因子信号通路有关的硫酸肝素结合而达到的。另有研究表明，内抑素可诱发内皮细胞凋亡，加入内抑素可明显降低Bcl-2和Bcl-xL存活蛋白的表达[3]。
这也可能是内抑素抑制内皮增殖的机制之一。近来有一项关于血管抑素(angiostatin)的研究表明血管抑素可与内皮细胞膜上的ATP合成酶的α/β亚单位结合，造成内皮细胞中ATP减少，从而降低其对缺氧的耐受力并造成不可逆损伤[4]。这为研究内抑素作用机制提供了新的思路。目前对内抑素作用机制还不清楚，尚需进一步研究。
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(二)内抑素可抑制肿瘤的生长和转移 O'Reilly证明内抑素对Lewis肺癌、T241纤维肉瘤、EOMA血管内皮瘤、B16F10黑色素瘤的体内生长均有抑制作用。内抑素皮下注射2.5 mg/kg，每天一次，治疗15天，对Lewis肺癌的抑制率约为53%，在10mg/kg剂量下，肿瘤生长抑制率为97%，在20mg/kg时，几乎全部的肿瘤被抑制。而且在治疗中未发现有药物毒性的表现。在其他几种肿瘤模型中也观察到同样效果。另外发现给予每天0.3mg/kg皮下注射，可几乎全部抑制Lewis肺癌转移灶的生长[1]。
Blezinger等肌肉内注射含内抑素基因的质粒，结果表明，应用240μg质粒肌肉注射每周一次共两周，治疗第13天，肾癌和Lewis肺癌生长被抑制40%。对肾癌肺转移的模型的研究表明，基因治疗能显著抑制转移灶的生长，肺转移灶的数目下降了85%，肺重量较对照减轻32%[5]。Chen应用编码内抑素和血管抑素的质粒与脂质体复合物治疗实验性乳腺癌，瘤内注射的抑制率分别为49%和36%，静脉注射内抑素的抑制率为40%[6]。结果提示，应用内抑素基因治疗肿瘤亦有明显效果，且一次注射，长期有效。内抑素抑制肿瘤生长可能与其抑制血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡有关。血管生成在肿瘤生长中起重要作用，一个内皮细胞可支持50～100个肿瘤细胞的生长。有研究表明，肿瘤细胞离血管越远，其增殖率亦越低，这与其氧供和营养不足有关。在肿瘤组织中，肿瘤细胞的数目与内皮细胞数目是相关的，它们之间能够互相促进，内皮细胞越多，血管越丰富，肿瘤细胞增殖率也越高。因此抑制血管生长能够显著抑制肿瘤生长。内抑素还可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制其生长。O'Reilly研究表明内抑素治疗组较对照组中肿瘤细胞凋亡增加了7倍[1]。Blezinger的研究也发现内抑素基因治疗可促进肿瘤细胞凋亡[5]。但目前关于内抑素诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚不十分了解，有待于进一步阐明。
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(三)内抑素能够延缓动脉粥样硬化的发展 内膜增生是动脉粥样斑块形成的一个重要机制，而内膜下血管的形成是斑块形成的必需条件。Moulton利用Apo E缺失突变的小鼠制作动脉粥样硬化的模型，从第6周起给予胆固醇饲料喂养，从第20周开始以20mg/kg内抑素皮下注射，每天一次，持续16周，可明显抑制动脉粥样斑块的生长，主动脉起始部斑块生长的抑制率可高达85%[7]。在正常血管中，血管壁中的微血管网局限于外膜中，在动脉粥样硬化的血管中，血管网变得更加丰富并延伸至斑块的内膜。这些内膜血管大部分是从原有的外膜血管网中分支而来，斑块血管中内皮细胞增殖率可高达43%。这些新生血管可促进炎症细胞向斑块中浸润并诱发正反馈调节而促进斑块生长。另外，当斑块生长超过一定厚度(>0.25mm)时，单纯依靠营养物质从管腔浸润已不能满足其代谢需要，血管生成成为斑块生长必不可少的前提条件。内抑素可抑制斑块内膜血管生成从而抑制动脉粥样硬化斑块的生长。Moulton等还发现，在内膜血管增生期(20～36周)给予内抑素治疗显著抑制斑块的生长(85%)，而当内膜血管已经建立后(32～48周)治疗，抑制效果就会减弱。在动脉粥样硬化的早期，内膜血管还未增生(6～22周)时给予内抑素对斑块生长并无抑制作用。这说明内抑素主要是通过抑制内膜血管生成而抑制斑块生长的。
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三、结语
内抑素是新发现的强有力的血管生成抑制剂。它的抗肿瘤作用给肿瘤治疗带来了新的思路和希望。目前内抑素已完成临床前研究进入临床试验。内抑素的抑制动脉粥样硬化发展的作用为内抑素增添了新的应用价值。因此，进一步研究血管的生成和抑制，开拓新的血管生成和抑制剂不仅具有重要的理论意义，亦具有重要的应用价值。
参考文献
1，O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: A endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997, 88∶277～285.
2，Dhanabal M, Ramchandran R, Volk R, et al. Endostatin: Yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma. Cancer Research, 1999, 59∶189～197.
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3，Dhanabal M, Ramchandran R, Waterman MJ, et al. Endostatin induces endothelial cell apoptosis. J Biol Chem, 1999, 274∶11721～11726.
4，Moser TL, Stack MS, Asplin L, et al. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells. Cell Biology, 1999, 96∶2811～2816.
5，Blezinger P, Wang J, Gondo M, et al. Systemic inhibition of tumor growth and tumor metastases by intramuscular administration of the endostatin gene. Nat Biotechnol, 1999, 17∶343～348.
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6，Chen QR, Kumar D, Stass SA, et al. Liposome complexed to plasmids encoding angiostatin and endostatin inhibit breast cancer in nude mice. Cancer Research, 1999, 59∶3308～3312.
7，Moulton KS, Heller E, Konerding MA, et al. Angiogenesis inhibitors endostatin or TNP-470 reduce intimal neovascularization and plaque growth in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation,1999, 99∶1726～1732., http://www.100md.com