睾丸生殖细胞的凋亡及其调控
作者：郭彩霞 唐铁山 刘以训
单位：郭彩霞 刘以训(中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室)；唐铁山(中国科学院发育生物学研究所，北京100080)
关键词：生殖细胞；凋亡；精子发生；生精周期
生理科学进展000403 摘要 睾丸生殖细胞在分化过程中存在自发性和诱发性凋亡，这是清除过量或异常生殖细胞的一种重要途径。生殖细胞的凋亡涉及内分泌、细胞社会组成和基因等多因素的调控。深入了解生殖细胞凋亡的调控机制，明确决定睾丸生殖细胞(Germ cells, Gc)凋亡机制的分子组成，将为治疗男性不育和开发男性避孕药物奠定理论基础。
学科分类号 Q492.4； R339.21
Germ Cell Apoptosis and Regulation in Testis
, 百拇医药
GUO Cai-Xia LIU Yi-Xun
(State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080)
TANG Tie-Shan
(Institute of Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080
Abstract Both spontaneous and induced germ cell apoptosis occur during the process of germ cell differentiation in testis, which is an important mechanism to remove surplus and abnormal germ cells. It has been known that germ cell apoptosis is under the control of endocrine, cell social association and gene. To elucidate the molecular mechanisms by which germ cell apoptosis is regulated and the elements of the death machinery will provide a basis for effective management of male infertility as well as more targeted approaches to male contraception.
, 百拇医药
Key words Germ cell； Apoptosis; Spermatogenesis; Cycle of seminiferous tubules
睾丸生殖细胞(germ cells，Gc)的增殖分化(精子发生)是一个相当复杂的过程。广义上讲，精子发生开始于原始生殖细胞(primordial germinal cells, PGCs), 在胚胎期的迁移，到达生殖脊后，PGCs开始迅速增殖形成精原干细胞，然后经有丝分裂形成精原细胞。狭义上的精子发生就是指从精原细胞开始到形成外形成熟的精子的过程，包括有丝分裂、减数分裂和减数分裂后三个阶段。有丝分裂阶段是指从精原细胞发育到前细线期精母细胞，该阶段发生于血睾屏障之外；减数分裂阶段是指细线期精母细胞发育到圆形精子细胞；减数分裂后阶段即圆形精子发育为成熟精子的变态过程，这两个阶段在血睾屏障内完成。
目前发现在各种哺乳动物正常精子发生中发生明显的Gc凋亡。在病理条件下，凋亡Gc的数目明显增多。由于Gc的增殖分化受到严格的调控，寻找影响Gc凋亡的调节因子，阐明各种死亡信号的调控机制，将为治疗男性不育和开发男性避孕药物奠定理论基础。
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一、正常精子发生中的生殖细胞凋亡(自发性生殖细胞凋亡)
(一)睾丸生殖细胞的自发凋亡 研究发现，在大鼠和小鼠个体发育首次精子发生期间，会出现一个非常明显的巨大凋亡波，这是保证随后的精子正常发生所必需的[1]。在性成熟的哺乳动物精子发生中，Gc凋亡现象仍然明显，以至实际精子产量比理论预期值减少75%左右(Sharpe. 1994)。另外，在睾丸的胚胎发育期还存在PGCs的凋亡。对于季节性生殖的仓鼠，因光周期改变导致的睾丸组织萎缩和恢复也涉及Gc的自发凋亡。
不同物种自发凋亡的Gc类型有所不同，在大鼠和仓鼠中，主要是一些分化的精原细胞(特别是A型精原细胞)和精母细胞自发凋亡；小鼠中主要是精母细胞发生凋亡；人类的Gc自发凋亡在Gc的各发育阶段都有发生[2]。从生精周期看，自发性Gc凋亡主要发生在阶段Ⅰ、Ⅶ和。
(二)影响生殖细胞自发性凋亡的因素 已发现促性腺激素影响精子发生的首次凋亡波。去垂体大鼠和促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)长效拮抗剂处理的大鼠，Gc凋亡水平增加，补充促卵泡素(FSH)和睾酮后能降低Gc凋亡水平。目前已知Gc自发凋亡与Bax蛋白在Gc内的瞬时高表达相关。在生精上皮表达Bcl2或过量表达Bcl-xl的转基因小鼠中，该早期凋亡波被明显抑制[1]。另外，凋亡诱导因子p53可能也对该过程发挥调控作用。因此，推测性成熟前大鼠和小鼠出现首次凋亡波可能是由于此时促性腺激素水平较低，不足以抑制Bax在Gc的表达；当性成熟时，促性腺激素水平升高，抑制了Bax的转录和表达，导致该凋亡波消失。精子发生首次凋亡波的生理意义很可能是保持Gc与支持细胞(sertoli cells, Sc)的最适数目比，以保证Gc发育和分化的正常进行。
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关于性成熟动物Gc自发凋亡的诱导因子的本质，目前还不清楚。推测可能与Sc数目直接相关。Sc是生精上皮中唯一与Gc接触的细胞，从曲细精管基底部到管腔部，Sc的复杂结构为精子发生的各个阶段提供了结构和生理上的支持。对Sc的三维结构研究表明，一个Sc可同时与47个不同分化阶段的Gc接触，Sc控制着精子发生的微环境。因此我们推测Gc可能通过自发凋亡，使其数目与Sc数相适应。另外，Gc自发凋亡还可能与其分化异常相关。由于哺乳动物的精子产生受到质量控制系统的严格监控，因此精子发生很可能通过自发凋亡消除分化异常的Gc，保证雄性遗传物质的准确传递。
二、睾丸生殖细胞的诱发凋亡
Gc凋亡除在正常精子发生中自发进行外，还可以被多种调节性信号诱发产生。目前已知的诱导信号包括：去除促性腺激素和睾酮的支持、化学药物和睾丸毒素处理、热压、辐射、睾丸急性缺血-再充血(ischemia/reperfusion)等。
, 百拇医药 (一)去除促性腺激素和睾酮的支持 促性腺激素和睾酮是保证Gc分化正常进行的必需存活因子。研究发现，去除促性腺激素支持(去垂体或用GnRH拮抗剂处理)的大鼠，生精周期特异阶段Gc凋亡的程度明显增加[3]，凋亡细胞主要是粗线期精母细胞和精子细胞[4]；补充促黄体生成素(LH)或FSH可逆转这种现象(Tapanainen等. 1993)。外源睾酮能阻止去垂体诱发的Gc凋亡。Erkkila等(1997)发现在曲细精管无血清培养体系中加入睾酮后，Gc凋亡则被明显抑制。用乙基二甲基磺酸盐(ethane dimethane sulfonate, EDS)处理大鼠破坏间质细胞(Leydig cells, Lc), 抑制睾丸内雄激素产生后，粗线期精母细胞和精子细胞的凋亡明显增加[4]。表明促性腺激素和睾酮都对Gc凋亡有抑制作用。
(二)热压 大量的证据表明，精子发生对温度非常敏感。高烧病人或处于高温环境的人，Gc分化明显受影响，生精周期Ⅰ～Ⅳ和Ⅻ～阶段的Gc首先发生凋亡。对热最敏感的Gc是初级精母细胞和圆形精子细胞。男性隐睾症和实验诱发的动物隐睾中，Gc通过凋亡而丢失，雄性生殖力下降或不育[5]。
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适度低温短时处理成年大鼠的睾丸(10℃，30分钟)能诱发生精周期第ⅤⅣ和Ⅻ阶段的Gc凋亡，凋亡的Gc主要是中期相的初级精母细胞，其次是间期相的次级精母细胞和A2型精原细胞[6]。
热压诱发的睾丸Gc凋亡具有明显的发育阶段特异性和细胞特异性。另外，Lue等(1999)研究还发现睾丸内睾酮能保护生精周期Ⅻ～阶段的Gc免受热压的伤害。
此外，睾丸毒素，辐射和睾丸急性缺血-再充血都能诱发GC的调亡[7]。
三、睾丸生殖细胞凋亡的基因调控
已知有许多基因调控Gc凋亡过程。
(一)p53 p53蛋白在维持基因组稳定性上充当分子警察的角色。当DNA受损时，p53便从胞质转运并积累于细胞核中，或是修复DNA，或是诱导细胞凋亡。p53诱导细胞凋亡的机制表明，p53能结合一段特定序列的DNA，促进靶基因的转录。如bax基因启动子区含有与p53结合的序列，故p53直接促进bax基因转录，使Bax蛋白含量增高，引发细胞凋亡。
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p53诱导的凋亡过程包括(1) 活化与氧化还原作用相关的基因；(2) 产生活性氧；(3) 氧化降解线粒体组份，允许凋亡诱导因子等从线粒体释放至胞质活化caspases。p53诱导的凋亡受Bcl2、Fas/Apo-1和胰岛素样生长因子结合蛋白-3的影响[2]。
p53在性成熟前的睾丸中表达量非常高，在成年睾丸中，其水平大大降低。睾丸内p53主要在Gc表达。p53-/-小鼠中，Gc自发性凋亡的程度比正常小鼠低，不正常精子的含量增加，推测p53诱导不正常Gc的自发凋亡。目前已知，p53的作用机制是通过上调bax的表达诱发Gc自发凋亡。其功能可能是参与精子产生的质量控制系统，减少缺陷的Gc，保证雄性配子的遗传稳定性。
尽管在成年睾丸中p53的表达水平明显下降，但与其它组织相比，睾丸内p53含量还是相当高的，它在对热敏感的粗线期精母细胞中表达量最高。Yin等(1997)发现隐睾手术后Gc胞质内的p53进入细胞核内。Western分析发现，隐睾Gc凋亡开始时，p53蛋白的表达水平也发生改变：Gc胞质组份开始出现一条47kD的新带；其可溶性核组份中开始出现了一条35kD的新带，阴囊睾丸对照组仅在Gc开始凋亡当天出现该条带；从Gc凋亡前开始，隐睾Gc的不溶性核组份中53kD的含量高于阴囊对照组[8]。这些结果表明p53参与隐睾中热压诱发的Gc凋亡的调控，隐睾中出现的这些p53新蛋白可能源于p53基因产物的翻译后修饰。对p53-/-和p53+/+小鼠的隐睾研究发现，p53+/+小鼠比p53-/-小鼠提前3天发生凋亡，凋亡的细胞主要是初级精母细胞和圆形精子细胞[9]。推测隐睾诱发的Gc凋亡是通过p53依赖的途径和独立于p53的途径进行的，p53依赖的Gc凋亡可能与DNA受损相关，而独立于p53的Gc凋亡可能由其它因子介导，与其它形式的Gc损害相关。
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(二)Fas/FasL系统 Fas(Apo-1,CD95)是一个跨膜受体蛋白，属于TNFR/NGFR家族，其胞内肽段含有一个死亡结构域。FasL是Fas的配体，属于TNF家族。Fas和FasL是参与多种细胞凋亡调控的死亡因子。Fas和FasL结合后，首先使Fas形成能传递信号的活性形式——三聚体，然后通过含有死亡域的Fas相关蛋白激活Caspases，引发细胞凋亡。
睾丸内生精上皮表达高水平的FasL，Fas主要在精母细胞、精子细胞和Sc表达。在Sc-Gc 共培养体系加入FasL的反义寡核苷酸片段，抑制FasL的表达后，Gc凋亡程度显著降低；加入Fas抗体后，Gc凋亡水平也降低[10,11]。这些研究表明，Fas/FasL系统是激活Gc凋亡的关键性调节因子。
(三)Bcl2家族 Bcl2家族包括凋亡诱导因子Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bok和凋亡抑制因子Bcl2、Bcl-xl、Bclw、Mcl等。Bcl2和Bax可以同源二聚体形式存在，Bcl2、Bcl-xl和Bax、Bad能形成异源二聚体。早在1993年就发现Bcl2和Bax的比例控制着细胞的生存和凋亡，当Bax过量形成同源二聚体时，诱导细胞凋亡；而Bcl2过量时，形成Bcl2同源二聚体和Bcl2/Bax异源二聚体，减少了Bax同源二聚体含量，便抑制细胞的凋亡。Bad可和Bcl2、Bcl-xl形成异源二聚体，遏制Bcl2、Bcl-xl对细胞凋亡的抑制作用。
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研究发现，Bax、Bad、Bcl-xl、Bcl2、Bclw和Bok都在啮齿类的睾丸表达，而Bak在人睾丸中表达。基因敲除和转基因小鼠研究发现，Bcl2家族成员在精子发生中起重要作用。bax基因敲除小鼠，睾丸缺乏成熟精子，曲细精管中积累许多不正常的减数分裂前的Gc，导致雄性不育。Bcl2或Bcl-xl表达水平升高的转基因小鼠，精子发生很不正常，同样引发雄性不育[12]。
(四)CREM 属于bZIP(亮氨酸拉链/碱性域)转录因子类，经PKA磷酸化后激活，刺激cAMP诱导基因的转录。CREM是控制雄性Gc分化和凋亡的总开关[13]。青春期前睾丸中，CREM mRNA表达量很低，编码一个转录抑制因子；性成熟睾丸中，从粗线期精母细胞到分化后期的Gc，CREM mRNA表达水平都很高，编码转录激活因子CREMτ。该因子主要在生精周期Ⅻ～期的圆形精子细胞表达，调控减数分裂后期基因的表达，如过渡蛋白1、血管紧张肽转化酶、Calspermin、RT7等。CREM基因突变或敲除后，曲细精管的直径减少20%～30%，生精上皮缺乏正常的生精波，精子发生停滞在精子细胞的早期阶段，精子形成严重受影响。与bax突变小鼠不同，CREM突变小鼠可能只影响精子形成第一期精子细胞的凋亡。
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CREM的表达受FSH调控，FSH除调控CREM的转录外，还能激活CREMτ。这是由于FSH与FSH受体结合后，通过cAMP信号传递通路激活PKA，后者使CREMτ磷酸化。由于Gc表面不表达FSHR，目前认为Gc对FSH的应答是通过其它信使迅速地从Sc传递到Gc。
(五)c-Kit/SCF c-Kit是一种受体酪氨酸激酶，属于血小板源生长因子受体家族，调控血细胞生成及生殖细胞发育。目前研究发现由于p53 依赖的凋亡涉及线粒体膜的去极化和活性氧类ROS的产生，而c-Kit活化后，能阻止该事件的发生，即c-kit能通过调控线粒体功能和细胞的氧化还原状态抑制p53诱导的细胞凋亡[14]。
c-Kit在小鼠的A型、中间型和B型精原细胞表达，给小鼠注射c-Kit的拮抗型抗体ACK2后，精母细胞和精原细胞的凋亡程度明显增加[15]。人睾丸内，c-Kit主要在Lc和A型精原细胞表达，在精子成熟受阻的病人睾丸中，Lc和A型精原细胞的c-Kit表达水平降低，而它们的凋亡程度升高。这些结果表明，c-Kit能抑制Gc的凋亡。
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SCF是c-kit的配体，它支持PGCs和精原细胞的生长和存活。离体研究发现，SCF能抑制PGCs的凋亡(De Felici等. 1994)。人睾丸中SCF在Sc和Lc表达[15]。小鼠中SCF在Sc表达，它能阻止睾丸Gc的凋亡。SCF可能通过一种间接的机制调控减数分裂后期及分裂的精母细胞的生存，是调控精子输出的重要调控因子。
除上述几种重要的因子外，还发现其它一些基因产物也在Gc凋亡中发挥重要作用。睾丸内原癌基因c-myc在B型精原细胞特异表达，过度表达c-myc的转基因小鼠和大鼠，由于引发减数分裂前期的初级精母细胞凋亡而导致雄性不育[16]。骨髓形成蛋白BMP8B是TGFβ超家族成员，在Gc表达，是精子发生的启动和维持所必需的因子，BMP8b基因突变的雄性小鼠表现出不同程度的Gc缺陷和不育(Zhao等. 1996)。HSP70.2蛋白主要在精母细胞和精子细胞表达，敲除HSP70.2基因的突变小鼠，精母细胞发生凋亡(Eddy. 1998)。A-myb 基因缺失的小鼠，精子发生阻滞在粗线期精母细胞阶段，减数分裂后的精子细胞和精子完全不存在(Toscani等. 1997)。
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我们实验室对孤儿受体TR2，TR3在精子发生中的作用进行了研究[16，17]。结果发现：TR2主要在精母细胞和圆形精子细胞表达；当隐睾内Gc凋亡指数最大时，TR2的表达显著降低；TR3主要在精原细胞和初级精母细胞表达，隐睾手术后，TR3的表达量明显降低，我们推测TR2和TR3可能在Gc分化和凋亡中发挥重要作用。同时，我们还应用mRNA差别显示技术筛选到若干与热压诱发Gc凋亡相关的温度敏感的ESTs[18]。所有这些都表明，Gc凋亡是个相当复杂的过程，涉及多种基因表达产物的调控。目前，关于这些基因对Gc凋亡的调控机制及其相互间的关系还不清楚，需要进行深入的研究。
四、结语
睾丸生殖细胞凋亡涉及多种因素的调控。目前对它的研究还刚刚起步。深入了解生殖细胞凋亡的调控机制，明确外界死亡信号触发生殖细胞凋亡的信号传递通路以及各通路之间的相互联系，将有助于阐明人类雄性不育的分子机制，为治疗男性不育症及开发新的避孕药物提供理论依据。
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本工作获得《国家重点基础研究发展规划》、《攀登预选项目》以及自然科学基金项目(37870368)资助
参考文献
1，Rodriguez I, Ody C, Araki K, et al. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J, 1997, 16∶ 2262～2270.
2，Sinha-Hikim AP, Swerdlof RS. Hormonal and genetic control of germ cell apoptosis in the testis. Rev Reprod, 1999, 4∶38～47.
, 百拇医药 3，Brinkworth MH, Weinbauer GF, Schlatt S, et al. Identification of male germ cells undergoing apoptosis in adult rats. J Reprod Fertil, 1995, 105∶ 25～33.
4，Woolveridge I, de Boer-Brouwer M, Taylor MF, et al. Apoptosis in the rat spermatogenic epithelium following withdrawal: changes in apoptosis-related genes. Biol Reprod, 1999, 60∶ 461～470.
5，Yin Y, Hawkins Kl, DeWolf WC, et al. Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice. J Androl, 1997, 18∶ 159～165.
, 百拇医药
6，Blanco-Rodriguez J, Martinez-Garcia C. Mild hypothermia induces apoptosis in rat testis at specific stages of the seminiferous epithelium. J Androl, 1997, 18∶ 535～539.
7，Turner TT, Tung KSK, Tomomasa Hiroshi et al., Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat. Biol Reprod, 1997, 57∶ 1267～1274.
8，Socher SA, Yin Y, Dewolf WC, et al. Temperature-mediated germ cell loss in the testis is associated with altered expression of the cell-cycle regulator p53. J Urol, 1997, 157∶ 1986～1989.
, 百拇医药
9，Yin Y, DeWolf WC, Morgentaler A. Experimental cryptorchidism induces testicular germ cell apoptosis by p53-dependent and -independent pathways in mice. Biol Reprod, 1998, 58∶ 492～496.
10，Lee J, Richburg JH, Younkin SC, et al. The Fas system is a key regulator of germ cell apoptosis in the testis. Endocrinology, 1997, 138∶ 2081～2088.
11，Lee J, Richburg JH, Shipp EB, et al. The Fas system, a regulator of testicular germ cell apoptosis, is differentially up-regulated in sertoli cell versus germ cell injury of the testis. Endocrinology, 1999, 140∶ 852～858.
, 百拇医药
12，Furuchi T, Masuko K, Nishimune Y, et al. Inhibition of testicular germ cell apoptosis and differentiation in mice misexpression Bcl2 in spermatogonia. Development, 1996, 122∶ 1703～1709.
13，Sassone-Corsi P. CREM: a master-switch governing male germ cell differentiation and apoptosis. Semin Cell Dev Biol, 1998, 9∶ 475～482.
14，Lee JM. Inhibition of p53-dependent apoptosis by the KIT tyrosine: regulation of mitochondrial permeability transition and reactive oxygen species generation. Oncogene, 1998, 17∶ 1653～1662.
, http://www.100md.com
15，Feng HL, Sandlow JI, Sparks AE, et al. Decreased expression of the c-kit receptor is associated with increased apoptosis in subfertile human testis. Fertil Steril, 1999, 71∶ 85～89.
16，Mu XM, Liu YX, Colling LL, et al. The p53/Rb-mediated repression of testicular orphan receptor-2 in the rhesus monkey with cryptorchidison. J Biol Chem, 2000, May 12.
17，Guo CX, HU ZY, Zou RJ, et al. Expression and regulation of orphan receptor TR2 mRNA in germ cells of cryptorchid testisin rat and rhesus monkey. China Sci Bulletin, 2000, 45∶720～725.
18，Guo CX, Tang TS, MU XM, et al. Cloning of novel temperature-related expressed Tags in rat testis during spermatogenesis. Biochem Biophs Res Comm, 1999, 258∶401～406., 百拇医药
单位：郭彩霞 刘以训(中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室)；唐铁山(中国科学院发育生物学研究所，北京100080)
关键词：生殖细胞；凋亡；精子发生；生精周期
生理科学进展000403 摘要 睾丸生殖细胞在分化过程中存在自发性和诱发性凋亡，这是清除过量或异常生殖细胞的一种重要途径。生殖细胞的凋亡涉及内分泌、细胞社会组成和基因等多因素的调控。深入了解生殖细胞凋亡的调控机制，明确决定睾丸生殖细胞(Germ cells, Gc)凋亡机制的分子组成，将为治疗男性不育和开发男性避孕药物奠定理论基础。
学科分类号 Q492.4； R339.21
Germ Cell Apoptosis and Regulation in Testis
, 百拇医药
GUO Cai-Xia LIU Yi-Xun
(State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080)
TANG Tie-Shan
(Institute of Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080
Abstract Both spontaneous and induced germ cell apoptosis occur during the process of germ cell differentiation in testis, which is an important mechanism to remove surplus and abnormal germ cells. It has been known that germ cell apoptosis is under the control of endocrine, cell social association and gene. To elucidate the molecular mechanisms by which germ cell apoptosis is regulated and the elements of the death machinery will provide a basis for effective management of male infertility as well as more targeted approaches to male contraception.
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Key words Germ cell； Apoptosis; Spermatogenesis; Cycle of seminiferous tubules
睾丸生殖细胞(germ cells，Gc)的增殖分化(精子发生)是一个相当复杂的过程。广义上讲，精子发生开始于原始生殖细胞(primordial germinal cells, PGCs), 在胚胎期的迁移，到达生殖脊后，PGCs开始迅速增殖形成精原干细胞，然后经有丝分裂形成精原细胞。狭义上的精子发生就是指从精原细胞开始到形成外形成熟的精子的过程，包括有丝分裂、减数分裂和减数分裂后三个阶段。有丝分裂阶段是指从精原细胞发育到前细线期精母细胞，该阶段发生于血睾屏障之外；减数分裂阶段是指细线期精母细胞发育到圆形精子细胞；减数分裂后阶段即圆形精子发育为成熟精子的变态过程，这两个阶段在血睾屏障内完成。
目前发现在各种哺乳动物正常精子发生中发生明显的Gc凋亡。在病理条件下，凋亡Gc的数目明显增多。由于Gc的增殖分化受到严格的调控，寻找影响Gc凋亡的调节因子，阐明各种死亡信号的调控机制，将为治疗男性不育和开发男性避孕药物奠定理论基础。
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一、正常精子发生中的生殖细胞凋亡(自发性生殖细胞凋亡)
(一)睾丸生殖细胞的自发凋亡 研究发现，在大鼠和小鼠个体发育首次精子发生期间，会出现一个非常明显的巨大凋亡波，这是保证随后的精子正常发生所必需的[1]。在性成熟的哺乳动物精子发生中，Gc凋亡现象仍然明显，以至实际精子产量比理论预期值减少75%左右(Sharpe. 1994)。另外，在睾丸的胚胎发育期还存在PGCs的凋亡。对于季节性生殖的仓鼠，因光周期改变导致的睾丸组织萎缩和恢复也涉及Gc的自发凋亡。
不同物种自发凋亡的Gc类型有所不同，在大鼠和仓鼠中，主要是一些分化的精原细胞(特别是A型精原细胞)和精母细胞自发凋亡；小鼠中主要是精母细胞发生凋亡；人类的Gc自发凋亡在Gc的各发育阶段都有发生[2]。从生精周期看，自发性Gc凋亡主要发生在阶段Ⅰ、Ⅶ和。
(二)影响生殖细胞自发性凋亡的因素 已发现促性腺激素影响精子发生的首次凋亡波。去垂体大鼠和促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)长效拮抗剂处理的大鼠，Gc凋亡水平增加，补充促卵泡素(FSH)和睾酮后能降低Gc凋亡水平。目前已知Gc自发凋亡与Bax蛋白在Gc内的瞬时高表达相关。在生精上皮表达Bcl2或过量表达Bcl-xl的转基因小鼠中，该早期凋亡波被明显抑制[1]。另外，凋亡诱导因子p53可能也对该过程发挥调控作用。因此，推测性成熟前大鼠和小鼠出现首次凋亡波可能是由于此时促性腺激素水平较低，不足以抑制Bax在Gc的表达；当性成熟时，促性腺激素水平升高，抑制了Bax的转录和表达，导致该凋亡波消失。精子发生首次凋亡波的生理意义很可能是保持Gc与支持细胞(sertoli cells, Sc)的最适数目比，以保证Gc发育和分化的正常进行。
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关于性成熟动物Gc自发凋亡的诱导因子的本质，目前还不清楚。推测可能与Sc数目直接相关。Sc是生精上皮中唯一与Gc接触的细胞，从曲细精管基底部到管腔部，Sc的复杂结构为精子发生的各个阶段提供了结构和生理上的支持。对Sc的三维结构研究表明，一个Sc可同时与47个不同分化阶段的Gc接触，Sc控制着精子发生的微环境。因此我们推测Gc可能通过自发凋亡，使其数目与Sc数相适应。另外，Gc自发凋亡还可能与其分化异常相关。由于哺乳动物的精子产生受到质量控制系统的严格监控，因此精子发生很可能通过自发凋亡消除分化异常的Gc，保证雄性遗传物质的准确传递。
二、睾丸生殖细胞的诱发凋亡
Gc凋亡除在正常精子发生中自发进行外，还可以被多种调节性信号诱发产生。目前已知的诱导信号包括：去除促性腺激素和睾酮的支持、化学药物和睾丸毒素处理、热压、辐射、睾丸急性缺血-再充血(ischemia/reperfusion)等。
, 百拇医药 (一)去除促性腺激素和睾酮的支持 促性腺激素和睾酮是保证Gc分化正常进行的必需存活因子。研究发现，去除促性腺激素支持(去垂体或用GnRH拮抗剂处理)的大鼠，生精周期特异阶段Gc凋亡的程度明显增加[3]，凋亡细胞主要是粗线期精母细胞和精子细胞[4]；补充促黄体生成素(LH)或FSH可逆转这种现象(Tapanainen等. 1993)。外源睾酮能阻止去垂体诱发的Gc凋亡。Erkkila等(1997)发现在曲细精管无血清培养体系中加入睾酮后，Gc凋亡则被明显抑制。用乙基二甲基磺酸盐(ethane dimethane sulfonate, EDS)处理大鼠破坏间质细胞(Leydig cells, Lc), 抑制睾丸内雄激素产生后，粗线期精母细胞和精子细胞的凋亡明显增加[4]。表明促性腺激素和睾酮都对Gc凋亡有抑制作用。
(二)热压 大量的证据表明，精子发生对温度非常敏感。高烧病人或处于高温环境的人，Gc分化明显受影响，生精周期Ⅰ～Ⅳ和Ⅻ～阶段的Gc首先发生凋亡。对热最敏感的Gc是初级精母细胞和圆形精子细胞。男性隐睾症和实验诱发的动物隐睾中，Gc通过凋亡而丢失，雄性生殖力下降或不育[5]。
, 百拇医药
适度低温短时处理成年大鼠的睾丸(10℃，30分钟)能诱发生精周期第ⅤⅣ和Ⅻ阶段的Gc凋亡，凋亡的Gc主要是中期相的初级精母细胞，其次是间期相的次级精母细胞和A2型精原细胞[6]。
热压诱发的睾丸Gc凋亡具有明显的发育阶段特异性和细胞特异性。另外，Lue等(1999)研究还发现睾丸内睾酮能保护生精周期Ⅻ～阶段的Gc免受热压的伤害。
此外，睾丸毒素，辐射和睾丸急性缺血-再充血都能诱发GC的调亡[7]。
三、睾丸生殖细胞凋亡的基因调控
已知有许多基因调控Gc凋亡过程。
(一)p53 p53蛋白在维持基因组稳定性上充当分子警察的角色。当DNA受损时，p53便从胞质转运并积累于细胞核中，或是修复DNA，或是诱导细胞凋亡。p53诱导细胞凋亡的机制表明，p53能结合一段特定序列的DNA，促进靶基因的转录。如bax基因启动子区含有与p53结合的序列，故p53直接促进bax基因转录，使Bax蛋白含量增高，引发细胞凋亡。
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p53诱导的凋亡过程包括(1) 活化与氧化还原作用相关的基因；(2) 产生活性氧；(3) 氧化降解线粒体组份，允许凋亡诱导因子等从线粒体释放至胞质活化caspases。p53诱导的凋亡受Bcl2、Fas/Apo-1和胰岛素样生长因子结合蛋白-3的影响[2]。
p53在性成熟前的睾丸中表达量非常高，在成年睾丸中，其水平大大降低。睾丸内p53主要在Gc表达。p53-/-小鼠中，Gc自发性凋亡的程度比正常小鼠低，不正常精子的含量增加，推测p53诱导不正常Gc的自发凋亡。目前已知，p53的作用机制是通过上调bax的表达诱发Gc自发凋亡。其功能可能是参与精子产生的质量控制系统，减少缺陷的Gc，保证雄性配子的遗传稳定性。
尽管在成年睾丸中p53的表达水平明显下降，但与其它组织相比，睾丸内p53含量还是相当高的，它在对热敏感的粗线期精母细胞中表达量最高。Yin等(1997)发现隐睾手术后Gc胞质内的p53进入细胞核内。Western分析发现，隐睾Gc凋亡开始时，p53蛋白的表达水平也发生改变：Gc胞质组份开始出现一条47kD的新带；其可溶性核组份中开始出现了一条35kD的新带，阴囊睾丸对照组仅在Gc开始凋亡当天出现该条带；从Gc凋亡前开始，隐睾Gc的不溶性核组份中53kD的含量高于阴囊对照组[8]。这些结果表明p53参与隐睾中热压诱发的Gc凋亡的调控，隐睾中出现的这些p53新蛋白可能源于p53基因产物的翻译后修饰。对p53-/-和p53+/+小鼠的隐睾研究发现，p53+/+小鼠比p53-/-小鼠提前3天发生凋亡，凋亡的细胞主要是初级精母细胞和圆形精子细胞[9]。推测隐睾诱发的Gc凋亡是通过p53依赖的途径和独立于p53的途径进行的，p53依赖的Gc凋亡可能与DNA受损相关，而独立于p53的Gc凋亡可能由其它因子介导，与其它形式的Gc损害相关。
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(二)Fas/FasL系统 Fas(Apo-1,CD95)是一个跨膜受体蛋白，属于TNFR/NGFR家族，其胞内肽段含有一个死亡结构域。FasL是Fas的配体，属于TNF家族。Fas和FasL是参与多种细胞凋亡调控的死亡因子。Fas和FasL结合后，首先使Fas形成能传递信号的活性形式——三聚体，然后通过含有死亡域的Fas相关蛋白激活Caspases，引发细胞凋亡。
睾丸内生精上皮表达高水平的FasL，Fas主要在精母细胞、精子细胞和Sc表达。在Sc-Gc 共培养体系加入FasL的反义寡核苷酸片段，抑制FasL的表达后，Gc凋亡程度显著降低；加入Fas抗体后，Gc凋亡水平也降低[10,11]。这些研究表明，Fas/FasL系统是激活Gc凋亡的关键性调节因子。
(三)Bcl2家族 Bcl2家族包括凋亡诱导因子Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bok和凋亡抑制因子Bcl2、Bcl-xl、Bclw、Mcl等。Bcl2和Bax可以同源二聚体形式存在，Bcl2、Bcl-xl和Bax、Bad能形成异源二聚体。早在1993年就发现Bcl2和Bax的比例控制着细胞的生存和凋亡，当Bax过量形成同源二聚体时，诱导细胞凋亡；而Bcl2过量时，形成Bcl2同源二聚体和Bcl2/Bax异源二聚体，减少了Bax同源二聚体含量，便抑制细胞的凋亡。Bad可和Bcl2、Bcl-xl形成异源二聚体，遏制Bcl2、Bcl-xl对细胞凋亡的抑制作用。
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研究发现，Bax、Bad、Bcl-xl、Bcl2、Bclw和Bok都在啮齿类的睾丸表达，而Bak在人睾丸中表达。基因敲除和转基因小鼠研究发现，Bcl2家族成员在精子发生中起重要作用。bax基因敲除小鼠，睾丸缺乏成熟精子，曲细精管中积累许多不正常的减数分裂前的Gc，导致雄性不育。Bcl2或Bcl-xl表达水平升高的转基因小鼠，精子发生很不正常，同样引发雄性不育[12]。
(四)CREM 属于bZIP(亮氨酸拉链/碱性域)转录因子类，经PKA磷酸化后激活，刺激cAMP诱导基因的转录。CREM是控制雄性Gc分化和凋亡的总开关[13]。青春期前睾丸中，CREM mRNA表达量很低，编码一个转录抑制因子；性成熟睾丸中，从粗线期精母细胞到分化后期的Gc，CREM mRNA表达水平都很高，编码转录激活因子CREMτ。该因子主要在生精周期Ⅻ～期的圆形精子细胞表达，调控减数分裂后期基因的表达，如过渡蛋白1、血管紧张肽转化酶、Calspermin、RT7等。CREM基因突变或敲除后，曲细精管的直径减少20%～30%，生精上皮缺乏正常的生精波，精子发生停滞在精子细胞的早期阶段，精子形成严重受影响。与bax突变小鼠不同，CREM突变小鼠可能只影响精子形成第一期精子细胞的凋亡。
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CREM的表达受FSH调控，FSH除调控CREM的转录外，还能激活CREMτ。这是由于FSH与FSH受体结合后，通过cAMP信号传递通路激活PKA，后者使CREMτ磷酸化。由于Gc表面不表达FSHR，目前认为Gc对FSH的应答是通过其它信使迅速地从Sc传递到Gc。
(五)c-Kit/SCF c-Kit是一种受体酪氨酸激酶，属于血小板源生长因子受体家族，调控血细胞生成及生殖细胞发育。目前研究发现由于p53 依赖的凋亡涉及线粒体膜的去极化和活性氧类ROS的产生，而c-Kit活化后，能阻止该事件的发生，即c-kit能通过调控线粒体功能和细胞的氧化还原状态抑制p53诱导的细胞凋亡[14]。
c-Kit在小鼠的A型、中间型和B型精原细胞表达，给小鼠注射c-Kit的拮抗型抗体ACK2后，精母细胞和精原细胞的凋亡程度明显增加[15]。人睾丸内，c-Kit主要在Lc和A型精原细胞表达，在精子成熟受阻的病人睾丸中，Lc和A型精原细胞的c-Kit表达水平降低，而它们的凋亡程度升高。这些结果表明，c-Kit能抑制Gc的凋亡。
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SCF是c-kit的配体，它支持PGCs和精原细胞的生长和存活。离体研究发现，SCF能抑制PGCs的凋亡(De Felici等. 1994)。人睾丸中SCF在Sc和Lc表达[15]。小鼠中SCF在Sc表达，它能阻止睾丸Gc的凋亡。SCF可能通过一种间接的机制调控减数分裂后期及分裂的精母细胞的生存，是调控精子输出的重要调控因子。
除上述几种重要的因子外，还发现其它一些基因产物也在Gc凋亡中发挥重要作用。睾丸内原癌基因c-myc在B型精原细胞特异表达，过度表达c-myc的转基因小鼠和大鼠，由于引发减数分裂前期的初级精母细胞凋亡而导致雄性不育[16]。骨髓形成蛋白BMP8B是TGFβ超家族成员，在Gc表达，是精子发生的启动和维持所必需的因子，BMP8b基因突变的雄性小鼠表现出不同程度的Gc缺陷和不育(Zhao等. 1996)。HSP70.2蛋白主要在精母细胞和精子细胞表达，敲除HSP70.2基因的突变小鼠，精母细胞发生凋亡(Eddy. 1998)。A-myb 基因缺失的小鼠，精子发生阻滞在粗线期精母细胞阶段，减数分裂后的精子细胞和精子完全不存在(Toscani等. 1997)。
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我们实验室对孤儿受体TR2，TR3在精子发生中的作用进行了研究[16，17]。结果发现：TR2主要在精母细胞和圆形精子细胞表达；当隐睾内Gc凋亡指数最大时，TR2的表达显著降低；TR3主要在精原细胞和初级精母细胞表达，隐睾手术后，TR3的表达量明显降低，我们推测TR2和TR3可能在Gc分化和凋亡中发挥重要作用。同时，我们还应用mRNA差别显示技术筛选到若干与热压诱发Gc凋亡相关的温度敏感的ESTs[18]。所有这些都表明，Gc凋亡是个相当复杂的过程，涉及多种基因表达产物的调控。目前，关于这些基因对Gc凋亡的调控机制及其相互间的关系还不清楚，需要进行深入的研究。
四、结语
睾丸生殖细胞凋亡涉及多种因素的调控。目前对它的研究还刚刚起步。深入了解生殖细胞凋亡的调控机制，明确外界死亡信号触发生殖细胞凋亡的信号传递通路以及各通路之间的相互联系，将有助于阐明人类雄性不育的分子机制，为治疗男性不育症及开发新的避孕药物提供理论依据。
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本工作获得《国家重点基础研究发展规划》、《攀登预选项目》以及自然科学基金项目(37870368)资助
参考文献
1，Rodriguez I, Ody C, Araki K, et al. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J, 1997, 16∶ 2262～2270.
2，Sinha-Hikim AP, Swerdlof RS. Hormonal and genetic control of germ cell apoptosis in the testis. Rev Reprod, 1999, 4∶38～47.
, 百拇医药 3，Brinkworth MH, Weinbauer GF, Schlatt S, et al. Identification of male germ cells undergoing apoptosis in adult rats. J Reprod Fertil, 1995, 105∶ 25～33.
4，Woolveridge I, de Boer-Brouwer M, Taylor MF, et al. Apoptosis in the rat spermatogenic epithelium following withdrawal: changes in apoptosis-related genes. Biol Reprod, 1999, 60∶ 461～470.
5，Yin Y, Hawkins Kl, DeWolf WC, et al. Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice. J Androl, 1997, 18∶ 159～165.
, 百拇医药
6，Blanco-Rodriguez J, Martinez-Garcia C. Mild hypothermia induces apoptosis in rat testis at specific stages of the seminiferous epithelium. J Androl, 1997, 18∶ 535～539.
7，Turner TT, Tung KSK, Tomomasa Hiroshi et al., Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat. Biol Reprod, 1997, 57∶ 1267～1274.
8，Socher SA, Yin Y, Dewolf WC, et al. Temperature-mediated germ cell loss in the testis is associated with altered expression of the cell-cycle regulator p53. J Urol, 1997, 157∶ 1986～1989.
, 百拇医药
9，Yin Y, DeWolf WC, Morgentaler A. Experimental cryptorchidism induces testicular germ cell apoptosis by p53-dependent and -independent pathways in mice. Biol Reprod, 1998, 58∶ 492～496.
10，Lee J, Richburg JH, Younkin SC, et al. The Fas system is a key regulator of germ cell apoptosis in the testis. Endocrinology, 1997, 138∶ 2081～2088.
11，Lee J, Richburg JH, Shipp EB, et al. The Fas system, a regulator of testicular germ cell apoptosis, is differentially up-regulated in sertoli cell versus germ cell injury of the testis. Endocrinology, 1999, 140∶ 852～858.
, 百拇医药
12，Furuchi T, Masuko K, Nishimune Y, et al. Inhibition of testicular germ cell apoptosis and differentiation in mice misexpression Bcl2 in spermatogonia. Development, 1996, 122∶ 1703～1709.
13，Sassone-Corsi P. CREM: a master-switch governing male germ cell differentiation and apoptosis. Semin Cell Dev Biol, 1998, 9∶ 475～482.
14，Lee JM. Inhibition of p53-dependent apoptosis by the KIT tyrosine: regulation of mitochondrial permeability transition and reactive oxygen species generation. Oncogene, 1998, 17∶ 1653～1662.
, http://www.100md.com
15，Feng HL, Sandlow JI, Sparks AE, et al. Decreased expression of the c-kit receptor is associated with increased apoptosis in subfertile human testis. Fertil Steril, 1999, 71∶ 85～89.
16，Mu XM, Liu YX, Colling LL, et al. The p53/Rb-mediated repression of testicular orphan receptor-2 in the rhesus monkey with cryptorchidison. J Biol Chem, 2000, May 12.
17，Guo CX, HU ZY, Zou RJ, et al. Expression and regulation of orphan receptor TR2 mRNA in germ cells of cryptorchid testisin rat and rhesus monkey. China Sci Bulletin, 2000, 45∶720～725.
18，Guo CX, Tang TS, MU XM, et al. Cloning of novel temperature-related expressed Tags in rat testis during spermatogenesis. Biochem Biophs Res Comm, 1999, 258∶401～406., 百拇医药