钙稳态失衡在内皮损伤后血管平滑肌增生中的作用增生中的作用
作者：刘乃奎 任晓燕 岑链珍 王雪青 常英姿 吴立玲 唐朝枢 苏静怡
单位：100083北京医科大学心血管研究所(刘乃奎、岑链珍、王雪青、常英姿、吴立玲 、唐朝枢、苏静怡)；青岛医学院病理生理教研室(任晓燕)
关键词：钙；肌，平滑，血管；钙通道阻滞剂
中华医学杂志960418 目的 探讨内皮剥脱后血管平滑肌细胞(VSMC)钙稳态的变化及其在内皮损伤诱导的VSMC增生中的作用。方法 在大鼠球事宜内皮剥脱模型上，用3H-胸腺嘧啶核苷和3H-亮氨酸掺入及45Ca转运的方法。结果 内皮损伤可导致VSMC增生、内膜增厚；VSMC钙内流增多，剥脱后3天时为4.12±0.28对照组为3.28±0.14 nmol/106细胞(P<0.05)；10天时为4.09±0.21、对照组3.31±0.09 nmol/106(P<0.01)、钙外移减少、钙含量升高(剥脱后3天时为995 54、对照组为695 33nmol/106细胞(P<0.01)；10天时为1022 94对照组、709 32nmol/106细胞(P<0.01)、肌浆网和线粒体钙摄取功能增强；应用钙通道阻断剂治疗可以调整内皮剥脱后VSMC的钙稳态失衡，还可以抑制内皮损伤诱导的VSMC增生。结论 钙稳态失衡可能是内皮损伤引起民VSMC增生的细胞学机制之一。
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The disturbance of calcium homeostasis in vascular smooth muscle proliferation after balloon denudation Liu Naikui,Cen Lianzhen,et al.Institute of Cardiovascular Research,Beijing Medical University,Beijing 100083
Objective To investigate the changes of calcium homeostasis in smooth muscle cells(VSMC)and the role of disturbance of calcinm homeostasis in VSMC proliferation after balloon d4enudation. Methods Assay of the cellular incorporation of H-Ceucin and measurment of 45Ca transport weredone on the model of balloon-
, 百拇医药
denuded aorta in rat.Results Enodthelial injury indudced VSMC proliferation,intimal thickening.After balloon denudation,VSMC calcium influx increased(3 days after balloon denuation,3.28±0.14vs4.12±0.28,P<0.05;10 days3.31±0.09vs4.09±0.21nmol/106cells,P<0.01),and calcium efflux decreased,and calcium content increased(3 days after balloon denuation 695±33 vs 995±54,P<0.01;10 days 709±32 vs 1022±94 nmol/106cell,P<0.01).SR and mitochondria calcium uptake increased.Calcium antagonist,verapamil not only regulated the disturbance of calcium homeostasis,but also inhibited endothelium injury-induced VSMC proliferation. Conclusion The disturbance of calcium homeostasis is probablyone of the underlying mechanisms of VSMC proliferation induced by balloon denudation.
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Key words Calcium Muscls,smooth,vascular Calcium channel blockers
(Natl Med J China,1996,76:297-300)
已有资料显示，钙通道阴断剂可抑制内皮损伤诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增生，提示钙与内皮损伤后的VSMC异常增生有关。然而，至今关于内皮损伤后VSMC钙调节和钙含量的变化及其在内皮损伤诱导VSMC增生中的作用尚少见报道。我们从整体(大鼠血管内皮剥脱模型)和细胞(培养损伤血管的VSMC)水平上，观察内皮剥脱后VSMC钙稳态的变化及其在内皮损伤诱导的VSMC增生中的作用。
材料和方法
一、材料
1.大鼠球囊内皮剥脱模型：选用体重270-350g雄性Wistar大鼠，随机分为剥脱组，治疗和假手术(对照)组。剥脱组：用0.6%巴比妥钠(5ml/kg，皮下)麻醉动物，经左颈总动脉插入自制的2F球囊，反复抽拉3次，剥脱胸主动脉内皮；治疗组：大鼠从内皮剥脱前3天应用异搏定每天50mg/kg，直到内皮剥脱后3和10天时为止；对照组；动物除不插入球囊导管外，其余操作同剥脱组。
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二、方法
1.血管平滑肌细胞培养：取出上述各组动物的胸主动脉，剪成1mm×1mm大小，按Ross法置37.5%CO2孵箱中，用含15%小牛血清的改良Eagie 培养液传代培养。
2.组织学研究：迅速取出胸主动脉投入10%甲醛液中固定。然后经包埋，切片，苏木素伊红染色后，做光镜下观察。
自大鼠股静脉注入0.5%(2ml/kg)伊文斯蓝，1小时后处死动物，观察内皮剥脱情况。正常血管腔面不染色；内皮损伤后血管腔面染成蓝色。
3.VSMC H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)和3H-亮氨酸掺入：按Uehara等[4]的方法，培养的VSMC中加入1.85×104Bq3H-TdR或1.85×104Bq3H-亮氨酸孵育24小时后，测定细胞的放射性强度。
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4.血管条3H-TdR和3H-亮氨酸掺入：取出上述各组动物的胸主动脉，切成10mm(10mg)大小的血管段，纵行切开，放置1.5ml RPMI1640培养液中，加入1.85×104Bq 3H-TdR或1.85× 104Bq 3H-亮氨酸孵育24小时后，测定组织的放射性强度。
5.钙含量测定：取60mg血管条或107个VSMC于110℃烤干；经消化后于Perkin-Elmer703型原子吸收分光光度计测定各样品的钙含量。
6.细胞钙内流和钙外移测定[6]：钙内流：用生理盐液(PSS)冲洗细胞3次，然后将106个VSMC置于PSS中，37℃孵育15分钟，加入45Ca(3.7×104Bq)，37℃孵育5分钟，用无Ca2+PSS(4℃)冲洗2次，终止45Ca内流，微孔抽滤后，测定滤膜的放射性强度。
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钙外移：用PSS冲洗VSMC3次，然后按钙内流测定法加入45Ca的PSS，37℃孵育3小时，用无Ca2+PSS冲洗3次，接着加入1ml PSS孵育5分钟，取孵育液测其放射性强度。
PSS成份(pH7.4)：NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，CaCl2. 5mmol/L MgCl2mmol/L，葡萄糖10mmol/L，磷酸缓冲液10mmol/L。
无Ca2+PSS：用2mmol/L EGTA代替PSS中的CaCl2。
7.肌浆网(sarcoplasmic reticulum SR)和线粒体粗制膜的制备：按Wei等[6]的方法，修改。将上述各组动物的胸主动脉置于冷介质(0.25mol/L 蔗糖，10mmol/L Tris-HCl，pH7.4)中，修剪，匀浆，2 500r/min离心10分钟，弃去沉淀，取上清，8 500r/min离心20分钟，取沉淀再重复离心60分钟，弃运河 上清液，再重复离心1次为肌浆网。
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8.钙摄取功能的测定：按照Wei等[6]的方法测定肌浆网和线粒体钙摄取功能。
9.统计学处理：所有数值以均数±标准误(
±
)表示，两组之间比较用t检验。
结果
一、内皮剥脱对VSMC增生的影响
内皮剥脱后立即伊文斯蓝染色发现，剥脱区完全蓝染；到内皮剥脱后3、10、21天时，蓝染面积分别为剥脱区面积的25.3%±6.6%，48.6%±12.1%和82.4%±17.5(7例)。光镜观察显示，内皮剥脱后血管平滑肌增生，内膜增厚；新手内膜/中膜面积比值在内皮剥脱后10和21天时分别为33.0%±2.4%和38.9%±4.1%，而对照组血管腔面无蓝染，并无VSMC增生及新生内膜出现。体内应用异搏定(每天50mg/kg)可抑制内皮剥脱后2天时的VSMC 3H-TdR掺入增加和10天时的血管内膜增厚(表1)。
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表1 异搏定对内皮损伤诱导VSMC增生的影响(±) 组别
内皮剥脱后2天
内皮剥脱后10天
3H-TdR
新生内膜/中膜面积
对照组
375±20(7)
剥脱组
4763±434(7)△
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33.0%±.4%(6)
治疗组
1981±216(7)*
11.3%±2.3%(6)*
注：括号内为鼠数，下同；△与对照组比较P<0.01，*与剥脱组比较P<0.01；3H-TdR单位为闪烁计数/min
细胞培养发现，血管损伤后3天和10天的VSMC 3H-TdR掺入分别增加了200%和246%(表2)。异搏定使术后3天培养的VSMC 3H-TdR和3H-亮氨酸掺入减少了43%和58%(表3)
表2 内皮剥脱后培养VSMC3H-TdR掺入钙内流和钙含量变化(±) 组别
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3H-TdR(闪烁计数/min)
钙内流
钙含量
(nmol/×106细胞)
剥脱后3天
对照组
846±35(6)
3.48±0.14(6)
695±34(6)
剥脱组
2536±125*(6)
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4.12±0.28△(6)
995±54*(6)
剥脱后10天
对照组
853±39(6)
3.31±0.09(9)
709±32(6)
剥脱组
2953±181*(6)
4.09±0.21*(9)
1002±94△(6)
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注：与对照组比较△P<0.05 *P<0.01表3 异搏定对内皮剥脱后3天培养VSMC增殖和钙稳态的影响(±) 组别
鼠数
3H-TdR
3H-亮氨酸
钙内流
钙含量
(闪烁计数/min)
(nmol×106细胞)
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对照组
6
845±35
1198±97
3.28±0.14
695±34
剥脱组
6
2537±125△△
2225±136△△
4.12±0.28△
995±54△△
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治疗组
6
1775±115**
1410±4**
3.05±0.29*
820±26*
注：剥脱组与对照组比较△P<0.05；△△P<0.01；治疗组与剥脱组比较*P<0.05，**P<0.01
二、血管内皮剥脱对VSMC钙稳态的影响
大鼠血管平滑肌钙含量从内皮剥脱后3天开始明显升高，10天达到高峰，21天又回天对照组水平(表4)。
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表4 异搏定对内皮剥脱后血管平滑肌钙含量的影响(µmol/g组织，±) 组别
钙含量
3天
10天
21天
对照组
20.7±1.1(8)
24.6±2.3(7)
20.4±2.0(7)
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剥脱组
59.8±13.4(6)△△
65.2±12.3(7)△△
19.9±2.1(7)
治疗组
19.7±3.1(7)**
12.5±0.7(6)**
注：与对照组比较△P<0.05，△△P<0.01；与剥脱组比较*P<0.05，**P<0.01
肌浆网钙摄取仅在血管内皮剥脱后10天时有变化，比对照组增加了38.4%(表5)；线粒体钙摄取在内皮剥脱后3天和10天时显著增加，21天时又回到对照组水平(表5)
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表5 内皮剥脱后培养VSMC肌浆网和线粒体钙摄取的变化(µmol/mg蛋白，±) 组别
肌浆网钙摄取
线粒体钙摄取
剥脱后3天
对照组
18.0±2.4(6)
2.83±0.19(7)
剥脱组
20.1±5.6(6)
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4.64±0.35△(7)
剥脱后10天
对照组
16.7±4.3(7)
2.72±0.17(7)
剥脱组
23.1±2.6(7)△
4.69±0.43△(7)
剥脱后21天
对照组
17.4±4.4(6)
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2.78±0.17(7)
剥脱组
18.2±2.6(6)
2.69±0.17(7)
注：与对照组比较△P<0.01
讨论
体内实验表明，钙通道阻断剂异搏定不仅可以降低内皮损伤诱导的VSMC钙含量的升高，而且还可明显抑制损伤诱导的VSMC增生和内膜的增厚。培养受损VSMC时发现，10-5mol/L异搏定可直接抑制培养VSMC钙含量的增加及VSMC DNA和蛋白质合成的增强，提示钙含量变化在VSMC增生中起重要作用。
钙含量升高是由钙调节改变所引起的。细胞钙调节主要包括细胞膜对钙的转运和细胞器对钙的摄取、贮存和释放。由于VSMC线粒体少，肌浆网欠发达，肌膜贮Ca2+量又较少，故细胞外Ca2+的流入与肌细胞膜对Ca2+的主动转运是决定细胞内Ca2+浓度的主要因素[7]。通过本研究发现，内皮剥脱组VSMC钙内流明显高于对照组，而钙外移低于对照组，提示血管内皮损伤后VSMC钙含量增加是由钙内流增多、钙外移减少所致。关于血管内皮损伤引起钙内流增加的机制尚不清楚，可能与血管损伤引起的血管紧张素II、血小板源性生长因子等促生长因互增加有关[1，8]。
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肌浆网是调节细胞内游离Ca2+浓度的重要细胞器，其膜上有丰富的Ca2+泵入肌浆网贮存。Magnier等[9]报道，用血小板源生长因子(10mg/ml)刺激猪主动脉VSMC生长时，肌浆网Ca2+-ATPase活性增加了47.2%，提示肌浆网钙耒改变可能与VSMC增殖有关。本研究结果显示，肌浆网摄钙功能仅在内皮剥脱后10天时增强。肌浆网摄钙功能增强的机制尚不清楚，可能是由细胞外钙内流增加，钙含量升高，激活肌浆网膜的Ca2+-ATPase所致。关于肌浆网钙摄取功能增强在内皮损伤诱导的VSMC增生中的意义尚不清楚。
线粒体是调节细胞钙的另一种重要的细胞器。本实验结果显示发现线粒体摄取钙功能在内皮剥脱后3天和10天时显著增强，21天时又回到对照组水平。线料体摄取钙功能增强的机制亦可能与血管损伤后VSMC钙含量增加有关。关于线粒体摄取鲺功能增强的VSMC增生中的意义尚不清楚。
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综上所述，提示钙稳态失衡可能是内皮损伤引起VSMC增生的细胞学机制之一。若能采取适当措施高速这种钙稳态失衡，将有可能防止再狭窄的发生，这是很值得研究的问题。
本课题为国家“八五/攻关科研基金资助项目
参考文献
1 Ferns GAA, Stewart-Lee AL, anggard EE, et al. Arterial response to mechanical injury: balloon catheter de-endothelialization. Atherosclerosis. 1992, 92: 89.
2 Clowes WA, Reidy MA, clowes MM. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury: smooth muscle growth in teh absence of endothelium. Lab Invest, 1983, 49: 327.
, 百拇医药
3 Ross R. The smooth muscle cell: II growth of smooth muscle in culture and formation of elastic fibers. J Cell Biol, 191, 50: 172.
4 Uehara Y, Numabe A, Kawabata Y, et al. Inhibition of protein synthesis and antiproliferation effect of the angiotensin converting enzme inhibitor trandolaprilat in rat vascular smooth muscle cells. J Hypertens, 1993, 11: 1073.
5 rinaldi g, Bohr DF. Plasm membraene and its abnormalities in hypertension. Am J Med Sci, 1988, 31: 389.
, 百拇医药
6 Wei JW, Janis RA, Danied ED. Calcium accumulation and enzymatic activities of subcellular fraction from aortas and ventricles of genetically hypertensive rats. Circ Res, 1976, 39: 133.
7 Movsesian MA. Calcium physiology in smooth muscle. Prog Cardiovasc Dis, 1982, 25: 211.
8 Jackson CL. Animal models of restenosis. Trends Cardiovasc Med, 1994, 4: 122.
9 Magnier C, Papp b, Corrazier E, et al. Regulation of sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during platelet-derived growth factor-induced smooth muscle cell proliferation. J Biol Chem, 1992, 267: 15808.
(收稿：1995-08-09 修回1995-11-27)
本刊“国内外学术动态”、“技术革新”、“临床病理讨论”及：“特色医院”栏目，欢迎广大读者踊跃投高。, http://www.100md.com
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关键词：钙；肌，平滑，血管；钙通道阻滞剂
中华医学杂志960418 目的 探讨内皮剥脱后血管平滑肌细胞(VSMC)钙稳态的变化及其在内皮损伤诱导的VSMC增生中的作用。方法 在大鼠球事宜内皮剥脱模型上，用3H-胸腺嘧啶核苷和3H-亮氨酸掺入及45Ca转运的方法。结果 内皮损伤可导致VSMC增生、内膜增厚；VSMC钙内流增多，剥脱后3天时为4.12±0.28对照组为3.28±0.14 nmol/106细胞(P<0.05)；10天时为4.09±0.21、对照组3.31±0.09 nmol/106(P<0.01)、钙外移减少、钙含量升高(剥脱后3天时为995 54、对照组为695 33nmol/106细胞(P<0.01)；10天时为1022 94对照组、709 32nmol/106细胞(P<0.01)、肌浆网和线粒体钙摄取功能增强；应用钙通道阻断剂治疗可以调整内皮剥脱后VSMC的钙稳态失衡，还可以抑制内皮损伤诱导的VSMC增生。结论 钙稳态失衡可能是内皮损伤引起民VSMC增生的细胞学机制之一。
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The disturbance of calcium homeostasis in vascular smooth muscle proliferation after balloon denudation Liu Naikui,Cen Lianzhen,et al.Institute of Cardiovascular Research,Beijing Medical University,Beijing 100083
Objective To investigate the changes of calcium homeostasis in smooth muscle cells(VSMC)and the role of disturbance of calcinm homeostasis in VSMC proliferation after balloon d4enudation. Methods Assay of the cellular incorporation of H-Ceucin and measurment of 45Ca transport weredone on the model of balloon-
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denuded aorta in rat.Results Enodthelial injury indudced VSMC proliferation,intimal thickening.After balloon denudation,VSMC calcium influx increased(3 days after balloon denuation,3.28±0.14vs4.12±0.28,P<0.05;10 days3.31±0.09vs4.09±0.21nmol/106cells,P<0.01),and calcium efflux decreased,and calcium content increased(3 days after balloon denuation 695±33 vs 995±54,P<0.01;10 days 709±32 vs 1022±94 nmol/106cell,P<0.01).SR and mitochondria calcium uptake increased.Calcium antagonist,verapamil not only regulated the disturbance of calcium homeostasis,but also inhibited endothelium injury-induced VSMC proliferation. Conclusion The disturbance of calcium homeostasis is probablyone of the underlying mechanisms of VSMC proliferation induced by balloon denudation.
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Key words Calcium Muscls,smooth,vascular Calcium channel blockers
(Natl Med J China,1996,76:297-300)
已有资料显示，钙通道阴断剂可抑制内皮损伤诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增生，提示钙与内皮损伤后的VSMC异常增生有关。然而，至今关于内皮损伤后VSMC钙调节和钙含量的变化及其在内皮损伤诱导VSMC增生中的作用尚少见报道。我们从整体(大鼠血管内皮剥脱模型)和细胞(培养损伤血管的VSMC)水平上，观察内皮剥脱后VSMC钙稳态的变化及其在内皮损伤诱导的VSMC增生中的作用。
材料和方法
一、材料
1.大鼠球囊内皮剥脱模型：选用体重270-350g雄性Wistar大鼠，随机分为剥脱组，治疗和假手术(对照)组。剥脱组：用0.6%巴比妥钠(5ml/kg，皮下)麻醉动物，经左颈总动脉插入自制的2F球囊，反复抽拉3次，剥脱胸主动脉内皮；治疗组：大鼠从内皮剥脱前3天应用异搏定每天50mg/kg，直到内皮剥脱后3和10天时为止；对照组；动物除不插入球囊导管外，其余操作同剥脱组。
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二、方法
1.血管平滑肌细胞培养：取出上述各组动物的胸主动脉，剪成1mm×1mm大小，按Ross法置37.5%CO2孵箱中，用含15%小牛血清的改良Eagie 培养液传代培养。
2.组织学研究：迅速取出胸主动脉投入10%甲醛液中固定。然后经包埋，切片，苏木素伊红染色后，做光镜下观察。
自大鼠股静脉注入0.5%(2ml/kg)伊文斯蓝，1小时后处死动物，观察内皮剥脱情况。正常血管腔面不染色；内皮损伤后血管腔面染成蓝色。
3.VSMC H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)和3H-亮氨酸掺入：按Uehara等[4]的方法，培养的VSMC中加入1.85×104Bq3H-TdR或1.85×104Bq3H-亮氨酸孵育24小时后，测定细胞的放射性强度。
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4.血管条3H-TdR和3H-亮氨酸掺入：取出上述各组动物的胸主动脉，切成10mm(10mg)大小的血管段，纵行切开，放置1.5ml RPMI1640培养液中，加入1.85×104Bq 3H-TdR或1.85× 104Bq 3H-亮氨酸孵育24小时后，测定组织的放射性强度。
5.钙含量测定：取60mg血管条或107个VSMC于110℃烤干；经消化后于Perkin-Elmer703型原子吸收分光光度计测定各样品的钙含量。
6.细胞钙内流和钙外移测定[6]：钙内流：用生理盐液(PSS)冲洗细胞3次，然后将106个VSMC置于PSS中，37℃孵育15分钟，加入45Ca(3.7×104Bq)，37℃孵育5分钟，用无Ca2+PSS(4℃)冲洗2次，终止45Ca内流，微孔抽滤后，测定滤膜的放射性强度。
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钙外移：用PSS冲洗VSMC3次，然后按钙内流测定法加入45Ca的PSS，37℃孵育3小时，用无Ca2+PSS冲洗3次，接着加入1ml PSS孵育5分钟，取孵育液测其放射性强度。
PSS成份(pH7.4)：NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，CaCl2. 5mmol/L MgCl2mmol/L，葡萄糖10mmol/L，磷酸缓冲液10mmol/L。
无Ca2+PSS：用2mmol/L EGTA代替PSS中的CaCl2。
7.肌浆网(sarcoplasmic reticulum SR)和线粒体粗制膜的制备：按Wei等[6]的方法，修改。将上述各组动物的胸主动脉置于冷介质(0.25mol/L 蔗糖，10mmol/L Tris-HCl，pH7.4)中，修剪，匀浆，2 500r/min离心10分钟，弃去沉淀，取上清，8 500r/min离心20分钟，取沉淀再重复离心60分钟，弃运河 上清液，再重复离心1次为肌浆网。
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8.钙摄取功能的测定：按照Wei等[6]的方法测定肌浆网和线粒体钙摄取功能。
9.统计学处理：所有数值以均数±标准误(
±)表示，两组之间比较用t检验。结果
一、内皮剥脱对VSMC增生的影响
内皮剥脱后立即伊文斯蓝染色发现，剥脱区完全蓝染；到内皮剥脱后3、10、21天时，蓝染面积分别为剥脱区面积的25.3%±6.6%，48.6%±12.1%和82.4%±17.5(7例)。光镜观察显示，内皮剥脱后血管平滑肌增生，内膜增厚；新手内膜/中膜面积比值在内皮剥脱后10和21天时分别为33.0%±2.4%和38.9%±4.1%，而对照组血管腔面无蓝染，并无VSMC增生及新生内膜出现。体内应用异搏定(每天50mg/kg)可抑制内皮剥脱后2天时的VSMC 3H-TdR掺入增加和10天时的血管内膜增厚(表1)。
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表1 异搏定对内皮损伤诱导VSMC增生的影响(
±) 组别内皮剥脱后2天
内皮剥脱后10天
3H-TdR
新生内膜/中膜面积
对照组
375±20(7)
剥脱组
4763±434(7)△
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33.0%±.4%(6)
治疗组
1981±216(7)*
11.3%±2.3%(6)*
注：括号内为鼠数，下同；△与对照组比较P<0.01，*与剥脱组比较P<0.01；3H-TdR单位为闪烁计数/min
细胞培养发现，血管损伤后3天和10天的VSMC 3H-TdR掺入分别增加了200%和246%(表2)。异搏定使术后3天培养的VSMC 3H-TdR和3H-亮氨酸掺入减少了43%和58%(表3)
表2 内皮剥脱后培养VSMC3H-TdR掺入钙内流和钙含量变化(
±) 组别, 百拇医药
3H-TdR(闪烁计数/min)
钙内流
钙含量
(nmol/×106细胞)
剥脱后3天
对照组
846±35(6)
3.48±0.14(6)
695±34(6)
剥脱组
2536±125*(6)
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4.12±0.28△(6)
995±54*(6)
剥脱后10天
对照组
853±39(6)
3.31±0.09(9)
709±32(6)
剥脱组
2953±181*(6)
4.09±0.21*(9)
1002±94△(6)
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注：与对照组比较△P<0.05 *P<0.01表3 异搏定对内皮剥脱后3天培养VSMC增殖和钙稳态的影响(
±) 组别鼠数
3H-TdR
3H-亮氨酸
钙内流
钙含量
(闪烁计数/min)
(nmol×106细胞)
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对照组
6
845±35
1198±97
3.28±0.14
695±34
剥脱组
6
2537±125△△
2225±136△△
4.12±0.28△
995±54△△
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治疗组
6
1775±115**
1410±4**
3.05±0.29*
820±26*
注：剥脱组与对照组比较△P<0.05；△△P<0.01；治疗组与剥脱组比较*P<0.05，**P<0.01
二、血管内皮剥脱对VSMC钙稳态的影响
大鼠血管平滑肌钙含量从内皮剥脱后3天开始明显升高，10天达到高峰，21天又回天对照组水平(表4)。
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表4 异搏定对内皮剥脱后血管平滑肌钙含量的影响(µmol/g组织，
±) 组别钙含量
3天
10天
21天
对照组
20.7±1.1(8)
24.6±2.3(7)
20.4±2.0(7)
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剥脱组
59.8±13.4(6)△△
65.2±12.3(7)△△
19.9±2.1(7)
治疗组
19.7±3.1(7)**
12.5±0.7(6)**
注：与对照组比较△P<0.05，△△P<0.01；与剥脱组比较*P<0.05，**P<0.01
肌浆网钙摄取仅在血管内皮剥脱后10天时有变化，比对照组增加了38.4%(表5)；线粒体钙摄取在内皮剥脱后3天和10天时显著增加，21天时又回到对照组水平(表5)
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表5 内皮剥脱后培养VSMC肌浆网和线粒体钙摄取的变化(µmol/mg蛋白，
±) 组别肌浆网钙摄取
线粒体钙摄取
剥脱后3天
对照组
18.0±2.4(6)
2.83±0.19(7)
剥脱组
20.1±5.6(6)
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4.64±0.35△(7)
剥脱后10天
对照组
16.7±4.3(7)
2.72±0.17(7)
剥脱组
23.1±2.6(7)△
4.69±0.43△(7)
剥脱后21天
对照组
17.4±4.4(6)
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2.78±0.17(7)
剥脱组
18.2±2.6(6)
2.69±0.17(7)
注：与对照组比较△P<0.01
讨论
体内实验表明，钙通道阻断剂异搏定不仅可以降低内皮损伤诱导的VSMC钙含量的升高，而且还可明显抑制损伤诱导的VSMC增生和内膜的增厚。培养受损VSMC时发现，10-5mol/L异搏定可直接抑制培养VSMC钙含量的增加及VSMC DNA和蛋白质合成的增强，提示钙含量变化在VSMC增生中起重要作用。
钙含量升高是由钙调节改变所引起的。细胞钙调节主要包括细胞膜对钙的转运和细胞器对钙的摄取、贮存和释放。由于VSMC线粒体少，肌浆网欠发达，肌膜贮Ca2+量又较少，故细胞外Ca2+的流入与肌细胞膜对Ca2+的主动转运是决定细胞内Ca2+浓度的主要因素[7]。通过本研究发现，内皮剥脱组VSMC钙内流明显高于对照组，而钙外移低于对照组，提示血管内皮损伤后VSMC钙含量增加是由钙内流增多、钙外移减少所致。关于血管内皮损伤引起钙内流增加的机制尚不清楚，可能与血管损伤引起的血管紧张素II、血小板源性生长因子等促生长因互增加有关[1，8]。
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肌浆网是调节细胞内游离Ca2+浓度的重要细胞器，其膜上有丰富的Ca2+泵入肌浆网贮存。Magnier等[9]报道，用血小板源生长因子(10mg/ml)刺激猪主动脉VSMC生长时，肌浆网Ca2+-ATPase活性增加了47.2%，提示肌浆网钙耒改变可能与VSMC增殖有关。本研究结果显示，肌浆网摄钙功能仅在内皮剥脱后10天时增强。肌浆网摄钙功能增强的机制尚不清楚，可能是由细胞外钙内流增加，钙含量升高，激活肌浆网膜的Ca2+-ATPase所致。关于肌浆网钙摄取功能增强在内皮损伤诱导的VSMC增生中的意义尚不清楚。
线粒体是调节细胞钙的另一种重要的细胞器。本实验结果显示发现线粒体摄取钙功能在内皮剥脱后3天和10天时显著增强，21天时又回到对照组水平。线料体摄取钙功能增强的机制亦可能与血管损伤后VSMC钙含量增加有关。关于线粒体摄取鲺功能增强的VSMC增生中的意义尚不清楚。
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综上所述，提示钙稳态失衡可能是内皮损伤引起VSMC增生的细胞学机制之一。若能采取适当措施高速这种钙稳态失衡，将有可能防止再狭窄的发生，这是很值得研究的问题。
本课题为国家“八五/攻关科研基金资助项目
参考文献
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4 Uehara Y, Numabe A, Kawabata Y, et al. Inhibition of protein synthesis and antiproliferation effect of the angiotensin converting enzme inhibitor trandolaprilat in rat vascular smooth muscle cells. J Hypertens, 1993, 11: 1073.
5 rinaldi g, Bohr DF. Plasm membraene and its abnormalities in hypertension. Am J Med Sci, 1988, 31: 389.
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7 Movsesian MA. Calcium physiology in smooth muscle. Prog Cardiovasc Dis, 1982, 25: 211.
8 Jackson CL. Animal models of restenosis. Trends Cardiovasc Med, 1994, 4: 122.
9 Magnier C, Papp b, Corrazier E, et al. Regulation of sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during platelet-derived growth factor-induced smooth muscle cell proliferation. J Biol Chem, 1992, 267: 15808.
(收稿：1995-08-09 修回1995-11-27)
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