病毒性心肌炎急性期预防性干预心脏间质纤维化的实验研究
作者：荆志成 程显声 杨英珍 许增禄
单位：100037 北京，中国医学科学院中国协和医科大学阜外心血管病医院 心血管病研究所心脏肺循环研究室(荆志成、程显声 )；上海医科大学卫生部病毒性心脏病重点实验室(杨英珍)；中国医学科学院中国协和医科大学基础医学院(许增禄)
关键词：心肌炎；胶原
中华医学杂志/980922 【摘要】 目的 探讨在病毒性心肌炎急性期预防性干预心脏间质纤维化的可行性，为明确临床干预病毒性心肌炎心脏间质纤维化的最佳时期提供实验依据。方法 动物分心肌炎组、Losartan(洛沙坦)干预组、正常对照组，比较各组动物的病死率;HE染色及苦味酸天狼猩红胶原特异染色偏振光显像观察心脏间质中I型、III型胶原的表达，并半定量分析；通过阻抗微分法观察心排血量并计算心指数来评价心功能。 结果 Losartan干预后的心肌炎小鼠病死率为75.0%，明显高于无药物干预组41.7%，存活小鼠的心指数：药物干预组为0.014±0.001 ml*min-1*cm2，心肌炎组和正常对照组分别为0.019±0.004 ml*min-1*cm2、0.024±0.002 ml*min-1*cm2，药物干预组胶原的扫描面积积分为2.1±0.8mm, 心肌炎组和正常对照组分别为4.7±2.2 mm、3.7±1.5 mm。结论 病毒性心肌炎急性期胶原已经增生，但其作用是修复坏死的心肌，Losartan能破坏此过程使心功能进一步恶化，加重病情发展，不能把急性期作为干预心肌纤维化的合适时期。
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Preventional intervention of myocardial interstitial fibrosis in murine myocardium with acute myocarditis
Jing Zhicheng*, Cheng Xiansheng*, Yang Yingzhen, et al. * Division of Cardio-Pulmonary Circulation, Fuwai Heart Hospital ＆ Institute of Cardiovascular Disease, PUMC ＆ CAMS, Beijing 100037
【Abstract】 Objectives To explore that whether intervening the fibrosis of heart interstitium in acute viral myocarditis is practical or not, and offer the experimental basis for clinic to choose the optimum period to intervene myocardial fibrosis. Methods Animals were divided into three groups: myocarditis, myocarditis intervened by Losartan, and normal control. The death rate of every group was compared. HE staining and picrosirius red staining and circularly polarized light were used to investigate myocardial collagen expression. Cardiac output was measured by impedance differentiation, and cardiac index was computed to evaluate cardiac function. Results The death rate of the group with Losartan was 75.0%, and that of the myocarditis group was 41.7%. The cardiac index of the group with the drug was 0.014±0.001 ml*min-1*cm2, the myocarditis group 0.019±0.004 ml*min-1*cm2, and the normal control 0.024±0.002 ml*min-1*cm2. The scanning area of collagen in the group with the drug was 2.06±0.77 mm, the myocarditis group 4.72±2.22 mm and the normal control 3.74±1.50 mm. Conclusions Collagen has increased in acute viral myocarditis, but its main role in this time is to repair the necrotic myocardium, and Losartan may block this process and make lesions develop. Therefore, the acute stage is not an practical period for intervening myocardial fibrosis in viral myocarditis.
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【Key words】 Viral myocarditis Collagen
(Natl Med J China, 1998, 78：699-701)
病毒性心肌炎慢性期的主要病理变化为心脏间质纤维化，间质的主要成分Ⅰ型、Ⅲ型胶原大量增生，其中由Ⅰ型胶原为主组成的粗纤维强硬，含量稍增即影响心脏顺应性[1]，Doering的研究也证实，胶原增生即可引起心脏僵硬度增加，舒张功能障碍[2]。因此，临床预防及控制此类胶原增生过程均为治疗病毒性心肌炎慢性期的重要环节。目前在病毒性心肌炎急性期是否能预防性干预这一纤维化过程目尚少见文献报道，大量资料证实，血管紧张素II受体拮抗剂可明显抑制心脏间质胶原的合成过程，为此，我们应用其代表性药物losartan对此问题进行了初步的探讨。
材料与方法
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一、动物模型的制作
45只5周龄雄性Balb/c小鼠，购自中国生物制品药品检定所，随机分为A、B、C 3组，A组12只和与B组24只小鼠每只均腹腔接种柯萨奇B3病毒(CVB3)1×103 PFU 0.4ml，CVB3毒株由首都儿科研究所崔小岱副研究员提供。其中B组在接种病毒后第1天起经口腔喂losartan(美国默沙东公司惠赠)，剂量每天10 mg/kg，A、B 2组均用高蛋白饲料喂养。C组9只小鼠腹腔接种不含病毒的Eagle′s液后常规饲养。10天后，A组死亡5只，B组死亡18只，C组没有死亡。将存活小鼠称重后进行以下处理。
二、心排血量(CO)的测定
按照本室改进的阻抗微分法对所有小鼠的心排血量进行测定，具体操作方法及所用材料按照参考文献[3]进行。根据每只小鼠的体表面积计算心指数(CI)。
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三、心肌标本采集及处理
每只小鼠测定心排血量后均立即开胸取出心脏，滤纸吸干称重后立即放入10%的甲醛中固定24小时行组织化学处理。
将组织按常规冲洗，不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片(厚度5 μm)，应用德国Leica 820-II型石蜡切片机切片。常规HE染色，苦味酸天狼猩红胶原特异染色按照文献[4]进行操作，0.1 g的天狼猩红(Sirius Red F3BA-N, 英国mOBAY Chemical公司) 溶于100 ml饱和的苦味酸溶液中，使其浓度为0.1%。切片脱蜡至水，在苦味酸天狼猩红溶液中染1小时，自来水冲洗，再经Harris苏木精染核，常规脱水，透明，树胶封片，应用日本Olympus BH-2偏振光显微镜观察，Kodar 100 ASA彩色胶卷照相。所用试剂购自北京中山生物技术有限公司。
所有组织化学照片均用Pharmacia 公司的 Ultro Scan LX JI激吸光度扫描仪进行扫描，扫描面积积分(SA)半定量分析。
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本文所有数据均用SPSS软件包进行统计学处理，数据以均数±标准差表示，组间差异比较采用t检验。
结果
一、药物干预组小鼠与病毒性心肌炎组小鼠相比病死率明显增加，分别为75%、42%。其存活小鼠心排血量及心指数下降，统计学分析差异有非常显著意义(附表)。
附表 各组小鼠之间CI、CO的比较(
±s) 组别
鼠数
CI(ml*min-1*cm2)
CO(ml/min)
A组
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7
0.019±0.004
0.91±0.19
B组
6
0.015±0.002*
0.70±0.09*
C组
9
0.024±0.002*
1.40±0.09*
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注：A组：病毒性心肌炎小鼠；B组：药物干预组 C组：正常Balb/c小鼠；与A组比较 * P<0.001
二、组织化学检查
图1 病毒性心肌炎小鼠心脏间质局部Ⅰ型及Ⅲ型胶原已有增生Ⅰ型胶原显色为红、黄色，Ⅲ型胶原显色为蓝、绿色 苦味酸天狼猩红染色×10 图2 药物干预组小鼠心脏间质胶原的表达明显弱于病毒性心肌炎小鼠 苦味酸天狼猩红染色×10 图3 正常Balb/c小鼠心脏间质中黄色Ⅰ型及绿色Ⅲ型胶原的表达 苦味酸天狼猩红染色×10
1.HE染色镜下观察：病毒性心肌炎小鼠与药物干预组小鼠均呈明显灶性心肌坏死，间质纤维细胞增生，但药物干预组小鼠淋巴单核细胞浸润较无药物干预组小鼠明显。
2.苦味酸天狼猩红胶原特异染色-偏振光显像：病毒性心肌炎小鼠心脏间质可见Ⅰ型及Ⅲ型胶原，增生粗大的Ⅰ型胶原反复重叠，排列无序，直径不均匀，有较强的双折射光，偏振光镜下呈亮红色及橘黄色，颜色鲜艳，直径越粗，红色越明亮。Ⅲ型胶原呈绿色，在Ⅰ型胶原中穿插分布，其纤维较纤细(图1)，而药物干预组小鼠心脏间质胶原表达与正常对照组相比明显降低，痕积少量红色及黄色的Ⅰ型胶原及绿色的Ⅲ型胶原(图2，3)。
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三、密度扫描积分结果(图4)。
图4 三组心肌胶原扫描面积积分比较
讨论
病毒性心肌炎慢性期的主要病理学特征为心脏间质纤维化，现代观点认为，即间质胶原网络中Ⅰ型、Ⅲ型胶原增生性重建，临床表现为心脏顺应性下降，僵硬度增加，进而引起舒张功能障碍。因此，临床预防及控制此类胶原增生过程为治疗病毒性心肌炎慢性期的重要环节。但在病毒性心肌炎急性期即预防性干预此纤维化过程是否可行，目前还未见相应文献报道，从我们的工作中看，这种干预过程还为期过早。实验结果显示，药物干预小鼠的病死率明显高于未经药物干预的病毒性心肌炎小鼠，其存活小鼠的心脏指数也明显低于未经药物干预的病毒性心肌炎小鼠与正常对照组小鼠。从苦味酸天狼猩红染色切片的结果来看，losartan明显的抑制了小鼠心脏间质胶原的表达，其扫描面积积分明显低于其他两组，这可能是引起病死率增加，心脏指数降低的直接原因。
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心脏中的胶原主要有维持心脏构型，保护心肌纤维和心肌细胞，协调力量的传导，决定心脏的弹性等作用[1]，但也有易被忽略的重要作用就是对心肌组织损伤的修复。事实上，这种修复能最大程度的限制损伤的范围，维护器官的功能。但同时，因修复而增生的胶原可因增加僵硬度而损害心脏功能，所以，在对心脏间质纤维化进行干预时，需要考虑两点：第一，不能影响对损伤组织必要的修复。第二，消除不需要的，过度增生的胶原纤维。
在病毒性心肌炎急性期，HE染色病理切片可以观察到大量心肌细胞坏死，这是急性期的主要病理学特点，此时苦味酸天狼猩红染色切片的结果也表明心肌内已经有胶原增生，但这时增生的胶原主要作用应该是最大程度的限制心肌组织坏死的范围，维护心脏的功能，而此期我们对胶原增生进行药物干预的结果是加重了病情，增加了病死率。这个结果提示，我们应在急性期过后再考虑消除增多的胶原，才能达到预期的治疗目的。
参考文献
, 百拇医药
1 Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease:The fibriller collagen network. JACC,1989,13:1637-1652.
2 Doering CW,Jalil JE,Janicki JS,et al.Collagen network remodelling and diastolic stiffness of the rat left ventricle with pressure overload hypertrophy. Cardiovasc Res,1988,22:686-695.
3 荆志成，程显声，张啸飞. 阻抗微分法测量小鼠心排血量的实验研究. 基础医学与临床，1998，18：70-71.
4 Whittaker P,Kloner RA,Boughner DR,et al. Quantitative assessment of myocardial collagen with picrosirius red staining and circularly polarized light. Basic Res Cardiol, 1994,89:397-410.
(收稿：1997-11-24 修回：1998-05-29), 百拇医药
单位：100037 北京，中国医学科学院中国协和医科大学阜外心血管病医院 心血管病研究所心脏肺循环研究室(荆志成、程显声 )；上海医科大学卫生部病毒性心脏病重点实验室(杨英珍)；中国医学科学院中国协和医科大学基础医学院(许增禄)
关键词：心肌炎；胶原
中华医学杂志/980922 【摘要】 目的 探讨在病毒性心肌炎急性期预防性干预心脏间质纤维化的可行性，为明确临床干预病毒性心肌炎心脏间质纤维化的最佳时期提供实验依据。方法 动物分心肌炎组、Losartan(洛沙坦)干预组、正常对照组，比较各组动物的病死率;HE染色及苦味酸天狼猩红胶原特异染色偏振光显像观察心脏间质中I型、III型胶原的表达，并半定量分析；通过阻抗微分法观察心排血量并计算心指数来评价心功能。 结果 Losartan干预后的心肌炎小鼠病死率为75.0%，明显高于无药物干预组41.7%，存活小鼠的心指数：药物干预组为0.014±0.001 ml*min-1*cm2，心肌炎组和正常对照组分别为0.019±0.004 ml*min-1*cm2、0.024±0.002 ml*min-1*cm2，药物干预组胶原的扫描面积积分为2.1±0.8mm, 心肌炎组和正常对照组分别为4.7±2.2 mm、3.7±1.5 mm。结论 病毒性心肌炎急性期胶原已经增生，但其作用是修复坏死的心肌，Losartan能破坏此过程使心功能进一步恶化，加重病情发展，不能把急性期作为干预心肌纤维化的合适时期。
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Preventional intervention of myocardial interstitial fibrosis in murine myocardium with acute myocarditis
Jing Zhicheng*, Cheng Xiansheng*, Yang Yingzhen, et al. * Division of Cardio-Pulmonary Circulation, Fuwai Heart Hospital ＆ Institute of Cardiovascular Disease, PUMC ＆ CAMS, Beijing 100037
【Abstract】 Objectives To explore that whether intervening the fibrosis of heart interstitium in acute viral myocarditis is practical or not, and offer the experimental basis for clinic to choose the optimum period to intervene myocardial fibrosis. Methods Animals were divided into three groups: myocarditis, myocarditis intervened by Losartan, and normal control. The death rate of every group was compared. HE staining and picrosirius red staining and circularly polarized light were used to investigate myocardial collagen expression. Cardiac output was measured by impedance differentiation, and cardiac index was computed to evaluate cardiac function. Results The death rate of the group with Losartan was 75.0%, and that of the myocarditis group was 41.7%. The cardiac index of the group with the drug was 0.014±0.001 ml*min-1*cm2, the myocarditis group 0.019±0.004 ml*min-1*cm2, and the normal control 0.024±0.002 ml*min-1*cm2. The scanning area of collagen in the group with the drug was 2.06±0.77 mm, the myocarditis group 4.72±2.22 mm and the normal control 3.74±1.50 mm. Conclusions Collagen has increased in acute viral myocarditis, but its main role in this time is to repair the necrotic myocardium, and Losartan may block this process and make lesions develop. Therefore, the acute stage is not an practical period for intervening myocardial fibrosis in viral myocarditis.
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【Key words】 Viral myocarditis Collagen
(Natl Med J China, 1998, 78：699-701)
病毒性心肌炎慢性期的主要病理变化为心脏间质纤维化，间质的主要成分Ⅰ型、Ⅲ型胶原大量增生，其中由Ⅰ型胶原为主组成的粗纤维强硬，含量稍增即影响心脏顺应性[1]，Doering的研究也证实，胶原增生即可引起心脏僵硬度增加，舒张功能障碍[2]。因此，临床预防及控制此类胶原增生过程均为治疗病毒性心肌炎慢性期的重要环节。目前在病毒性心肌炎急性期是否能预防性干预这一纤维化过程目尚少见文献报道，大量资料证实，血管紧张素II受体拮抗剂可明显抑制心脏间质胶原的合成过程，为此，我们应用其代表性药物losartan对此问题进行了初步的探讨。
材料与方法
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一、动物模型的制作
45只5周龄雄性Balb/c小鼠，购自中国生物制品药品检定所，随机分为A、B、C 3组，A组12只和与B组24只小鼠每只均腹腔接种柯萨奇B3病毒(CVB3)1×103 PFU 0.4ml，CVB3毒株由首都儿科研究所崔小岱副研究员提供。其中B组在接种病毒后第1天起经口腔喂losartan(美国默沙东公司惠赠)，剂量每天10 mg/kg，A、B 2组均用高蛋白饲料喂养。C组9只小鼠腹腔接种不含病毒的Eagle′s液后常规饲养。10天后，A组死亡5只，B组死亡18只，C组没有死亡。将存活小鼠称重后进行以下处理。
二、心排血量(CO)的测定
按照本室改进的阻抗微分法对所有小鼠的心排血量进行测定，具体操作方法及所用材料按照参考文献[3]进行。根据每只小鼠的体表面积计算心指数(CI)。
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三、心肌标本采集及处理
每只小鼠测定心排血量后均立即开胸取出心脏，滤纸吸干称重后立即放入10%的甲醛中固定24小时行组织化学处理。
将组织按常规冲洗，不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片(厚度5 μm)，应用德国Leica 820-II型石蜡切片机切片。常规HE染色，苦味酸天狼猩红胶原特异染色按照文献[4]进行操作，0.1 g的天狼猩红(Sirius Red F3BA-N, 英国mOBAY Chemical公司) 溶于100 ml饱和的苦味酸溶液中，使其浓度为0.1%。切片脱蜡至水，在苦味酸天狼猩红溶液中染1小时，自来水冲洗，再经Harris苏木精染核，常规脱水，透明，树胶封片，应用日本Olympus BH-2偏振光显微镜观察，Kodar 100 ASA彩色胶卷照相。所用试剂购自北京中山生物技术有限公司。
所有组织化学照片均用Pharmacia 公司的 Ultro Scan LX JI激吸光度扫描仪进行扫描，扫描面积积分(SA)半定量分析。
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本文所有数据均用SPSS软件包进行统计学处理，数据以均数±标准差表示，组间差异比较采用t检验。
结果
一、药物干预组小鼠与病毒性心肌炎组小鼠相比病死率明显增加，分别为75%、42%。其存活小鼠心排血量及心指数下降，统计学分析差异有非常显著意义(附表)。
附表 各组小鼠之间CI、CO的比较(
±s) 组别鼠数
CI(ml*min-1*cm2)
CO(ml/min)
A组
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7
0.019±0.004
0.91±0.19
B组
6
0.015±0.002*
0.70±0.09*
C组
9
0.024±0.002*
1.40±0.09*
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注：A组：病毒性心肌炎小鼠；B组：药物干预组 C组：正常Balb/c小鼠；与A组比较 * P<0.001
二、组织化学检查
图1 病毒性心肌炎小鼠心脏间质局部Ⅰ型及Ⅲ型胶原已有增生Ⅰ型胶原显色为红、黄色，Ⅲ型胶原显色为蓝、绿色 苦味酸天狼猩红染色×10 图2 药物干预组小鼠心脏间质胶原的表达明显弱于病毒性心肌炎小鼠 苦味酸天狼猩红染色×10 图3 正常Balb/c小鼠心脏间质中黄色Ⅰ型及绿色Ⅲ型胶原的表达 苦味酸天狼猩红染色×10
1.HE染色镜下观察：病毒性心肌炎小鼠与药物干预组小鼠均呈明显灶性心肌坏死，间质纤维细胞增生，但药物干预组小鼠淋巴单核细胞浸润较无药物干预组小鼠明显。
2.苦味酸天狼猩红胶原特异染色-偏振光显像：病毒性心肌炎小鼠心脏间质可见Ⅰ型及Ⅲ型胶原，增生粗大的Ⅰ型胶原反复重叠，排列无序，直径不均匀，有较强的双折射光，偏振光镜下呈亮红色及橘黄色，颜色鲜艳，直径越粗，红色越明亮。Ⅲ型胶原呈绿色，在Ⅰ型胶原中穿插分布，其纤维较纤细(图1)，而药物干预组小鼠心脏间质胶原表达与正常对照组相比明显降低，痕积少量红色及黄色的Ⅰ型胶原及绿色的Ⅲ型胶原(图2，3)。
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三、密度扫描积分结果(图4)。
图4 三组心肌胶原扫描面积积分比较
讨论
病毒性心肌炎慢性期的主要病理学特征为心脏间质纤维化，现代观点认为，即间质胶原网络中Ⅰ型、Ⅲ型胶原增生性重建，临床表现为心脏顺应性下降，僵硬度增加，进而引起舒张功能障碍。因此，临床预防及控制此类胶原增生过程为治疗病毒性心肌炎慢性期的重要环节。但在病毒性心肌炎急性期即预防性干预此纤维化过程是否可行，目前还未见相应文献报道，从我们的工作中看，这种干预过程还为期过早。实验结果显示，药物干预小鼠的病死率明显高于未经药物干预的病毒性心肌炎小鼠，其存活小鼠的心脏指数也明显低于未经药物干预的病毒性心肌炎小鼠与正常对照组小鼠。从苦味酸天狼猩红染色切片的结果来看，losartan明显的抑制了小鼠心脏间质胶原的表达，其扫描面积积分明显低于其他两组，这可能是引起病死率增加，心脏指数降低的直接原因。
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心脏中的胶原主要有维持心脏构型，保护心肌纤维和心肌细胞，协调力量的传导，决定心脏的弹性等作用[1]，但也有易被忽略的重要作用就是对心肌组织损伤的修复。事实上，这种修复能最大程度的限制损伤的范围，维护器官的功能。但同时，因修复而增生的胶原可因增加僵硬度而损害心脏功能，所以，在对心脏间质纤维化进行干预时，需要考虑两点：第一，不能影响对损伤组织必要的修复。第二，消除不需要的，过度增生的胶原纤维。
在病毒性心肌炎急性期，HE染色病理切片可以观察到大量心肌细胞坏死，这是急性期的主要病理学特点，此时苦味酸天狼猩红染色切片的结果也表明心肌内已经有胶原增生，但这时增生的胶原主要作用应该是最大程度的限制心肌组织坏死的范围，维护心脏的功能，而此期我们对胶原增生进行药物干预的结果是加重了病情，增加了病死率。这个结果提示，我们应在急性期过后再考虑消除增多的胶原，才能达到预期的治疗目的。
参考文献
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1 Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease:The fibriller collagen network. JACC,1989,13:1637-1652.
2 Doering CW,Jalil JE,Janicki JS,et al.Collagen network remodelling and diastolic stiffness of the rat left ventricle with pressure overload hypertrophy. Cardiovasc Res,1988,22:686-695.
3 荆志成，程显声，张啸飞. 阻抗微分法测量小鼠心排血量的实验研究. 基础医学与临床，1998，18：70-71.
4 Whittaker P,Kloner RA,Boughner DR,et al. Quantitative assessment of myocardial collagen with picrosirius red staining and circularly polarized light. Basic Res Cardiol, 1994,89:397-410.
(收稿：1997-11-24 修回：1998-05-29), 百拇医药