从蛋白质相互作用研究方法的发展看人们认识事物的过程
作者：王吉村 药立波
单位：王吉村(第四军医大学，陕西 西安 710032)；药立波(第四军医大学，陕西 西安 710032)
关键词：
医学与哲学000517分类号：Q51 文献标识码：A 文章编号：1002-0772(2000)05-0036-02
1 酶联免疫吸附检测法
最简单的研究两蛋白质相互作用的是，在体外验证两蛋白质的相互作用，如验证所制备的抗体是否特异性地与抗原结合，这里要求方法：一要能检测到结合作用，二要排除非特异性结合，这样人们就建立了酶联免疫吸附检测法(ELISA)。原理是，将已知抗原固定在96孔塑料板上，用不同稀释度的抗抗原的第一抗体溶液与其结合，经洗涤去除非特异性结合分子后，加入用辣根过氧化物酶标记的抗第一抗体的第二抗体，洗涤后再加入辣根过氧化物酶的底物，底物被酶作用后就转变为有颜色的物质。这样只有在第一抗体与抗原结合了之后才会有后面的二抗和底物的逐步结合，也才会有颜色的变化。由于这种方法是用酶标二抗和底物呈色，所以有放大效应，灵敏度较高。若抗体的特异性和亲和性非常好，ELISA法就可以用来检测实验样品和临床标本中的抗原水平，例如，临床上乙型肝炎5项指标的检测就是用这种方法。
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ELISA是验证两种已知的蛋白质的相互作用的方法，但在医学基础研究中，往往需要寻找一种与兴趣蛋白结合的目的蛋白，以探讨兴趣蛋白的功能。如何做才能保证找到呢?这就需要用兴趣蛋白去筛选含有目的蛋白的大量蛋白混合物，那么怎样做才能把结合的蛋白质保留而把不结合的去除掉呢?于是人们建立了蛋白质亲和层析法。
2 蛋白质亲和层析法
这种方法是将兴趣蛋白固定于载体(如Sepharose)上装柱，使含有目的蛋白的混合液或细胞提取液流过柱子，其中只有与兴趣蛋白结合的目的蛋白才能被特异性吸附在柱上，混合液中其它成分则被洗涤掉，然后再用合适的洗脱液将目的蛋白洗脱下来。这里若兴趣蛋白和目的蛋白都是已知的，则可用兴趣蛋白纯化目的蛋白。但若兴趣蛋白功能为未知，就可以通过鉴定目的蛋白来推测兴趣蛋白的功能。这种方法是在体外寻找一种结合蛋白，虽简单灵敏，但有一问题：固相化的兴趣蛋白是否是处于天然构象呢?无人知道。若想保证蛋白处于天然构象，就必须在细胞内研究两种蛋白质的相互作用，那么怎样才能捕获到细胞内正发生相互作用的两种蛋白质呢?这样科学家们又建立了免疫共沉淀法。
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3 免疫共沉淀法
此方法的原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
那么能不能找到一种冒险性小，又能直接获得目的蛋白结构信息的方法呢?既然编码蛋白的基因序列比较容易测得，所以能不能把待选的蛋白与编码它的基因联系起来呢?于是科学家们又建立了筛选基因工程蛋白文库的两种方法：cDNA表达文库的筛选和噬菌体表面呈现技术。
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4 cDNA表达文库的筛选
由于未知蛋白的结构分析远较基因结构分析困难，所以就想到从基因水平入手，就将编码蛋白的基因插入到原核表达载体中，使其在大肠杆菌中表达，然后用标记的(同位素或非同位素)兴趣蛋白筛选这些大肠杆菌中表达的外源蛋白。实际操作中，是将一种细胞或组织中的所有cDNA插入到质粒(表达载体)中，转化大肠杆菌，建成一个表达文库，这样就包容了细胞或组织中所有的表达蛋白，使得筛选成功的几率大大提高。然后把文库铺平板，将菌落转印到硝酸纤维素膜上并裂解，用标记的兴趣蛋白与膜杂交。杂交信号阳性者意味着该表达蛋白可能为与兴趣蛋白结合的目的蛋白。然后将此克隆提取质粒，对质粒进行DNA序列分析，就可知道其中插入的外源基因序列。通过基因序列就可初步判断目的蛋白的结构和功能。此方法的最大优点是可获得目的蛋白的基因序列，但其缺点有：(1)费时费力；(2)文库表达的蛋白可能不像在天然状态那样正确折叠。
5 噬菌体表面呈现技术
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其基本原理是：将待筛选的蛋白基因插入到噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因Ⅷ或基因Ⅲ之间，构建成融合蛋白噬菌体文库，表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，而不影响噬菌体的完整性。筛选时，先将兴趣蛋白固相化，如结合在塑料96孔板上，加入文库噬菌体并与兴趣蛋白反应，经过洗涤，不相关的噬菌体被洗掉，有亲和力的噬菌体被捕获。洗脱结合的噬菌体，将其感染大肠杆菌而被繁殖，繁殖的噬菌体再行一轮“吸附—洗涤—洗脱—繁殖”过程，使结合的噬菌体被大大富集，所以这个过程称“淘筛”。经几轮淘筛就能从109～1010的噬菌体文库中筛选到目的蛋白。用这种方法可以构建抗体基因文库和随机肽库，从而可以筛选到能应用到临床的基因工程抗体或多肽药物。这种方法较cDNA表达文库筛选方法的优越之处在于：(1)省时快速；(2)高选择性地筛选复杂混合物(109～1010)；(3)在淘筛过程中，通过改变洗脱条件，可以直接评价结合的特异性。缺点是：(1)噬菌体文库中插入的DNA片段大小有所限制，太大的蛋白基因不能被插入；(2)文库中的表达蛋白也是原核表达而且是融合表达，所以不能保证所有蛋白都能正确折叠；(3)在体外检测相互作用，可能与天然状态不符。
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以上两种方法都是在体外进行两种蛋白的结合作用，所以每种蛋白的构象和两种蛋白质相互作用构象可能与天然状态不符，这样得到的蛋白可能并不是真正的结合蛋白，那么能不能找到一种可以筛选真正在真核细胞内与一种兴趣蛋白结合的目的蛋白，而且又能直接获得目的蛋白基因序列的方法呢?于是人们想到，能不能将这些兴趣蛋白的基因和含目的蛋白的基因文库分别转染到真核细胞中，让它们在细胞内表达，彼此作用，然后用一种方法检测这种结合信号。用什么样的真核细胞呢?高级生物的体细胞太复杂，被转染外源基因后内源蛋白和外源蛋白可能会彼此影响，结果很难判断，那么人们比较熟悉和了解的酵母细胞就成了一个合适的选择；然后怎样检测结合信号呢?能不能将这种结合作用与某种蛋白的活性变化或瞬时表达结合起来呢?经过对这些问题的不断深入思考和尝试，科学家们终于建立了一种在真核细胞内研究两种蛋白质相互作用的系统——酵母双杂交系统。
6 酵母双杂交系统
我们知道细胞内一种基因的转录激活需要有转录因子的调控。在酵母细胞中，转录因子由必需的两部分组成：DNA结合结构域(B)和DNA转录激活结构域(A)，只有二者在所调控的基因序列上游处彼此靠近，才能激活基因转录，表达为蛋白。若将A和B人为地分开，再将它们分别连上兴趣蛋白(X)和目的蛋白(Y)，若X和Y能在细胞内发生结合，那么就将A和B拉近。若这种结合和拉近发生在核内，就可以激活基因的转录。这里是利用酵母的基因Leu和Lac Z作报告基因，它们具有共同的DNA上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)，后者可与DNA结合结构域(B)结合。在实际操作中，首先构建两个质粒表达载体，一个载体上插入B和X的基因使二者融合表达，另一个载体上插入A和Y的基因使二者融合表达，这里Y往往是含目的蛋白基因的cDNA文库，即这一载体表达的是一个融合蛋白文库。将两载体分别转化入酵母细胞，插入基因就在细胞中表达并彼此作用。若X和Y发生结合，则A和B就相互靠近，B结合于USA上，A激活Leu基因和Lac Z基因的转录。结果，体内发生X和Y结合的酵母细胞就能在缺乏Leu的培养基上生长，同时在含有X-gal的培养基上呈蓝色，其它的细胞则不能生长。挑取阳性酵母菌落，分离含有A+Y的质粒，进行序列分析，其中Y基因编码的Y蛋白即为目的蛋白。这种方法可以快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，发现新基因，其最大优点是：(1)只需知道兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白，不需进行烦琐的分离纯化或原核表达，也不需制备抗体；(2)蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来；(3)可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。但该系统也有不足：(1)在酵母内表达的外源蛋白均为融合蛋白，A、B、X和Y蛋白的构象都有可能与天然状态不符，造成结果的不准确；(2)本身就具有转录激活活性的兴趣蛋白不适合于该系统；(3)不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统；(4)需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统，因为酵母细胞内没有高级生物细胞内的蛋白修饰系统。
, 百拇医药
到目前为止，科学家们已经解决了从一种细胞内所有表达的蛋白质中筛选结合蛋白的问题，也实现了在酵母细胞内研究两种蛋白质的相互作用，但还有很多问题不能解决，如，(1)不能完全模拟蛋白质作用的天然环境和保证蛋白质的天然构象；(2)不能直接获取目的蛋白的蛋白质结构和功能信息。
我们应有信心，经过科学家们的不断实践及与其它领域学科的合作，不久的将来这些问题会逐一解决。
作者简介：王吉村(1969～)，女，吉林省吉林市人，1996年获第四军医大学内科学硕士学位，1998～至今在攻读分子生物学博士学位。
收稿日期：2000-01-12, http://www.100md.com
单位：王吉村(第四军医大学，陕西 西安 710032)；药立波(第四军医大学，陕西 西安 710032)
关键词：
医学与哲学000517分类号：Q51 文献标识码：A 文章编号：1002-0772(2000)05-0036-02
1 酶联免疫吸附检测法
最简单的研究两蛋白质相互作用的是，在体外验证两蛋白质的相互作用，如验证所制备的抗体是否特异性地与抗原结合，这里要求方法：一要能检测到结合作用，二要排除非特异性结合，这样人们就建立了酶联免疫吸附检测法(ELISA)。原理是，将已知抗原固定在96孔塑料板上，用不同稀释度的抗抗原的第一抗体溶液与其结合，经洗涤去除非特异性结合分子后，加入用辣根过氧化物酶标记的抗第一抗体的第二抗体，洗涤后再加入辣根过氧化物酶的底物，底物被酶作用后就转变为有颜色的物质。这样只有在第一抗体与抗原结合了之后才会有后面的二抗和底物的逐步结合，也才会有颜色的变化。由于这种方法是用酶标二抗和底物呈色，所以有放大效应，灵敏度较高。若抗体的特异性和亲和性非常好，ELISA法就可以用来检测实验样品和临床标本中的抗原水平，例如，临床上乙型肝炎5项指标的检测就是用这种方法。
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ELISA是验证两种已知的蛋白质的相互作用的方法，但在医学基础研究中，往往需要寻找一种与兴趣蛋白结合的目的蛋白，以探讨兴趣蛋白的功能。如何做才能保证找到呢?这就需要用兴趣蛋白去筛选含有目的蛋白的大量蛋白混合物，那么怎样做才能把结合的蛋白质保留而把不结合的去除掉呢?于是人们建立了蛋白质亲和层析法。
2 蛋白质亲和层析法
这种方法是将兴趣蛋白固定于载体(如Sepharose)上装柱，使含有目的蛋白的混合液或细胞提取液流过柱子，其中只有与兴趣蛋白结合的目的蛋白才能被特异性吸附在柱上，混合液中其它成分则被洗涤掉，然后再用合适的洗脱液将目的蛋白洗脱下来。这里若兴趣蛋白和目的蛋白都是已知的，则可用兴趣蛋白纯化目的蛋白。但若兴趣蛋白功能为未知，就可以通过鉴定目的蛋白来推测兴趣蛋白的功能。这种方法是在体外寻找一种结合蛋白，虽简单灵敏，但有一问题：固相化的兴趣蛋白是否是处于天然构象呢?无人知道。若想保证蛋白处于天然构象，就必须在细胞内研究两种蛋白质的相互作用，那么怎样才能捕获到细胞内正发生相互作用的两种蛋白质呢?这样科学家们又建立了免疫共沉淀法。
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3 免疫共沉淀法
此方法的原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
那么能不能找到一种冒险性小，又能直接获得目的蛋白结构信息的方法呢?既然编码蛋白的基因序列比较容易测得，所以能不能把待选的蛋白与编码它的基因联系起来呢?于是科学家们又建立了筛选基因工程蛋白文库的两种方法：cDNA表达文库的筛选和噬菌体表面呈现技术。
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4 cDNA表达文库的筛选
由于未知蛋白的结构分析远较基因结构分析困难，所以就想到从基因水平入手，就将编码蛋白的基因插入到原核表达载体中，使其在大肠杆菌中表达，然后用标记的(同位素或非同位素)兴趣蛋白筛选这些大肠杆菌中表达的外源蛋白。实际操作中，是将一种细胞或组织中的所有cDNA插入到质粒(表达载体)中，转化大肠杆菌，建成一个表达文库，这样就包容了细胞或组织中所有的表达蛋白，使得筛选成功的几率大大提高。然后把文库铺平板，将菌落转印到硝酸纤维素膜上并裂解，用标记的兴趣蛋白与膜杂交。杂交信号阳性者意味着该表达蛋白可能为与兴趣蛋白结合的目的蛋白。然后将此克隆提取质粒，对质粒进行DNA序列分析，就可知道其中插入的外源基因序列。通过基因序列就可初步判断目的蛋白的结构和功能。此方法的最大优点是可获得目的蛋白的基因序列，但其缺点有：(1)费时费力；(2)文库表达的蛋白可能不像在天然状态那样正确折叠。
5 噬菌体表面呈现技术
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其基本原理是：将待筛选的蛋白基因插入到噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因Ⅷ或基因Ⅲ之间，构建成融合蛋白噬菌体文库，表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，而不影响噬菌体的完整性。筛选时，先将兴趣蛋白固相化，如结合在塑料96孔板上，加入文库噬菌体并与兴趣蛋白反应，经过洗涤，不相关的噬菌体被洗掉，有亲和力的噬菌体被捕获。洗脱结合的噬菌体，将其感染大肠杆菌而被繁殖，繁殖的噬菌体再行一轮“吸附—洗涤—洗脱—繁殖”过程，使结合的噬菌体被大大富集，所以这个过程称“淘筛”。经几轮淘筛就能从109～1010的噬菌体文库中筛选到目的蛋白。用这种方法可以构建抗体基因文库和随机肽库，从而可以筛选到能应用到临床的基因工程抗体或多肽药物。这种方法较cDNA表达文库筛选方法的优越之处在于：(1)省时快速；(2)高选择性地筛选复杂混合物(109～1010)；(3)在淘筛过程中，通过改变洗脱条件，可以直接评价结合的特异性。缺点是：(1)噬菌体文库中插入的DNA片段大小有所限制，太大的蛋白基因不能被插入；(2)文库中的表达蛋白也是原核表达而且是融合表达，所以不能保证所有蛋白都能正确折叠；(3)在体外检测相互作用，可能与天然状态不符。
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以上两种方法都是在体外进行两种蛋白的结合作用，所以每种蛋白的构象和两种蛋白质相互作用构象可能与天然状态不符，这样得到的蛋白可能并不是真正的结合蛋白，那么能不能找到一种可以筛选真正在真核细胞内与一种兴趣蛋白结合的目的蛋白，而且又能直接获得目的蛋白基因序列的方法呢?于是人们想到，能不能将这些兴趣蛋白的基因和含目的蛋白的基因文库分别转染到真核细胞中，让它们在细胞内表达，彼此作用，然后用一种方法检测这种结合信号。用什么样的真核细胞呢?高级生物的体细胞太复杂，被转染外源基因后内源蛋白和外源蛋白可能会彼此影响，结果很难判断，那么人们比较熟悉和了解的酵母细胞就成了一个合适的选择；然后怎样检测结合信号呢?能不能将这种结合作用与某种蛋白的活性变化或瞬时表达结合起来呢?经过对这些问题的不断深入思考和尝试，科学家们终于建立了一种在真核细胞内研究两种蛋白质相互作用的系统——酵母双杂交系统。
6 酵母双杂交系统
我们知道细胞内一种基因的转录激活需要有转录因子的调控。在酵母细胞中，转录因子由必需的两部分组成：DNA结合结构域(B)和DNA转录激活结构域(A)，只有二者在所调控的基因序列上游处彼此靠近，才能激活基因转录，表达为蛋白。若将A和B人为地分开，再将它们分别连上兴趣蛋白(X)和目的蛋白(Y)，若X和Y能在细胞内发生结合，那么就将A和B拉近。若这种结合和拉近发生在核内，就可以激活基因的转录。这里是利用酵母的基因Leu和Lac Z作报告基因，它们具有共同的DNA上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)，后者可与DNA结合结构域(B)结合。在实际操作中，首先构建两个质粒表达载体，一个载体上插入B和X的基因使二者融合表达，另一个载体上插入A和Y的基因使二者融合表达，这里Y往往是含目的蛋白基因的cDNA文库，即这一载体表达的是一个融合蛋白文库。将两载体分别转化入酵母细胞，插入基因就在细胞中表达并彼此作用。若X和Y发生结合，则A和B就相互靠近，B结合于USA上，A激活Leu基因和Lac Z基因的转录。结果，体内发生X和Y结合的酵母细胞就能在缺乏Leu的培养基上生长，同时在含有X-gal的培养基上呈蓝色，其它的细胞则不能生长。挑取阳性酵母菌落，分离含有A+Y的质粒，进行序列分析，其中Y基因编码的Y蛋白即为目的蛋白。这种方法可以快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，发现新基因，其最大优点是：(1)只需知道兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白，不需进行烦琐的分离纯化或原核表达，也不需制备抗体；(2)蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来；(3)可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。但该系统也有不足：(1)在酵母内表达的外源蛋白均为融合蛋白，A、B、X和Y蛋白的构象都有可能与天然状态不符，造成结果的不准确；(2)本身就具有转录激活活性的兴趣蛋白不适合于该系统；(3)不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统；(4)需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统，因为酵母细胞内没有高级生物细胞内的蛋白修饰系统。
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到目前为止，科学家们已经解决了从一种细胞内所有表达的蛋白质中筛选结合蛋白的问题，也实现了在酵母细胞内研究两种蛋白质的相互作用，但还有很多问题不能解决，如，(1)不能完全模拟蛋白质作用的天然环境和保证蛋白质的天然构象；(2)不能直接获取目的蛋白的蛋白质结构和功能信息。
我们应有信心，经过科学家们的不断实践及与其它领域学科的合作，不久的将来这些问题会逐一解决。
作者简介：王吉村(1969～)，女，吉林省吉林市人，1996年获第四军医大学内科学硕士学位，1998～至今在攻读分子生物学博士学位。
收稿日期：2000-01-12, http://www.100md.com