心肌缺血时红细胞集群在模拟微循环系统中的变化
作者：迟路湘1 何国祥1 郑小林2
单位：1.中国人民解放军第三军医大学西南医院心血管内科, 邮政编码 重庆400038； 2.重庆大学生物工程学院
关键词：心肌缺血；微循环；红细胞；硅微通道
心肌缺血时红细胞集群在模拟微循环 系统中的变化 目的: 旨在了解心肌缺血时红细胞集群在模拟微循环系统中的变化。 方法: 通过建立硅微通道毛细血管模型, 观测红细胞集群在模拟微循环系统中的变形性。 结果: 冠心病心绞痛组, 红细胞滤过指数(IF)、 阻力系数(β)、 堵塞概率(ε)均较对照组明显增大(P<0.01), 入孔时间(te)、 出孔时间(to)、 过孔时间(ti)中位数明显增大。 结论: 心肌缺血时, 红细胞在模拟微循环系统表现为硬度增加, 阻力增大, 运动速度下降, 变形性降低, 堵塞概率增加。
, 百拇医药
Changes of Total Red Blood Cells in a Simulation of Microcirculation during Myocardial Ischaemia
Chi Luxiang, He Guoxiang, Zheng Xiaolin
Southwest Hospital, Third Military Medical University of Chinese PLA, Chongqing 400038
Objective: To understand the change of total red blood cells(RBCs) in a simulation of microcirculation during the myocardial ischaemia. Methods: The simulation system of capillary blood vessels by silicon microchannels was set up, and the deformability of total RBCs was measured in this system. Results: Compared with the control group, the filtration index(IF), filtration resistance(β) and block probability(ε) in the angina pectoris group increased significantly(P<0.01). Moreover, the temporal parameters of a single cell passing through the microchannels(the time for entering the pore, the time for exiting the pore, the total passage time) also increased markedly. Conclusion: The results indicate that during the myocardial ischaemia, the stiffness and resistance of the RBCs increase, the movement velocity of the RBCs decrease, and the block probability of the RBCs increase in a simulation system of microcirculation.
, 百拇医药
Key words:Myocardial ischaemia; Microcirculation; Red blood cell; Silicon Microchannel
有关红细胞变形性研究, 国内外发展了不少方法, 但多数为研究单个红细胞的变形特征[1,2]。 本研究在吸收国外新技术方法的基础上, 在国内首次建立了模拟微循环系统, 即硅微通道毛细血管模型; 并观察了红细胞集群在通过硅通道毛细血管系统时的细胞流变特性。
1 资料和方法
1.1 配套仪器
WAYⅡ微量压积压(江苏), Nikon 210/45型显微镜(日本), QVM-310B监视器(日本), TK-S310EG型CCD摄像头(日本), VIDAS视频图像数据分析仪(德国)。
, 百拇医药
1.2 试样制备
取静脉血2.25 ml, 用3.8%枸橼酸钠0.75 ml抗凝, 3 000 r/min离心8 min, 除去血浆和白细胞层, 用PBS液清洗三次, 并以3 000 r/min离心8 min, 除去上层清液, 制得纯红细胞液, 将红细胞液与PBS液按1∶9体积比制成红细胞悬液。
1.3 试样采集对象
(1) 健康正常人10例, 年龄35～40岁; (2) 冠心病心绞痛10例, 年龄40～52岁, 心绞痛发作时采集血标本, 本组病人冠脉造影证实冠脉狭窄均>50%。
1.4 实验系统及操作方法
系统如附图所示, 按我们成熟的方法进行。
附图 硅微通道毛细血管模型实验系统示意
, 百拇医药
本实验系统中, 外管路包括一个PBS缓冲液贮存器、 二个废液瓶以及连接其间的管道和阀门。 为有效去除空气泡, 用-26.7～-66.6 kPa的高负压将管道及硅片座中的空气泡抽出, 同时也用于清洗管道。 低负压(≤-0.981 kPa)用于测量。 低负压测量采用玻璃毛细管水柱, 负压调节在实验中暂用注射器抽吸来实现。 废液瓶除了收集废液外, 还起稳定压力的作用。 图像摄取采用CCD(Charge-Coupled Devices)摄像机。 CCD的分辨率由CCD感光元件数决定, 并用调制传递函数MTF(f)表示。 为获得高的空间分辨率, 应选截止频率高的CCD, 并在频响范围内使MTF(f)愈高愈好。 和光导摄像管相比, CCD不需外加电子扫描, 输出信号与相应像素位置一一对应, 因而再生图像失真度小。 在使用中应注意, 饱和曝光量以上的过亮光像会在像素内产生并积累过饱和信号电荷, 并从一个像素的势阱经衬底扩散到相邻像素的势阱, 形成弥散现象, 使再生图像不该亮的地方也变亮。 一般CCD的饱和曝光量约为0.1～1.0 μJ/cm2。
, 百拇医药
摄像所用光源的光谱特性要与红细胞的光谱吸收特性以及CCD的光谱特性相匹配。 实验表明红细胞对可见光中430 nm、 540 nm、 570 nm的光线具有很强的吸收能力, 若采用光源的光谱中富含这些光, 则将使细胞间隙部分光线明亮, 可获得对比度高、 界限分明的图像。
所采用的等负压过滤试验的典型测量过程:
(1) 将硅片座的基座放在盛有蒸馏水或缓冲液的器皿中, 然后将硅片放到基座的玻璃片上, 旋紧压盖, 使硅片与玻璃片紧密贴合。 在水中进行上述操作是为了排除微通路中可能存在的气泡。
(2) 打开阀A和B, 启动启负压泵(40.0～53.4 kPa)使缓冲液充满硅片座内硅片外的空间, 将蒸馏水置换为缓冲液。
(3) 关闭阀门B, 打开阀门D和A, 开启负压泵, 使缓冲液充满硅片的微通道及内腔。
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(4) 关闭阀A、 B, 将低负压调至-0.981 kPa, 打开阀C, 测定100 μl缓冲液流过硅微通道的时间。
(5) 向100 μl移液管内注入血液试样。
(6) 打开阀C, 在-0.981 kPa的负压吸引下, 测定100 μl血液试样通过微通道的时间(注意: 最初的10 μl溶液通过时间略去不计, 因已被缓冲液所稀释)。
(7) 调节负压, 测量在不同负压情况下红细胞通过微通道的情况。
(8) 关闭阀C, 打开阀B, 用高负压将移液管中的残留液吸除。
(9) 打开阀B、 A, 用高负压将硅片基座内及外管路中的残留试样排除。
(10) 取出硅片放在中性洗液中用超声波清洗干净, 供下次测量使用。
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1.5 红细胞变形性参数指标
计算: (1) 表征单个细胞通过孔道时的群体效应的参数: 红细胞滤过指数(IF)、 单个红细胞通过微通道的阻力系数(β)、 红细胞过孔时的堵塞概率(ε); (2) 表征单个红细胞变形性的参数: 红细胞内液粘度(η)、 红细胞通过微通道的时间参数te(在某一恒定吸压下, 细胞进入通道所需的时间)、 to(红细胞到达通道尾端后完全流出通道所需的时间)、 ti(通道中时间)。
1.6 统计学处理
实验数据均以
±s表示, 组间比较用Students t进行统计检验, P<0.05为差异显著。
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2 结 果
2.1 心肌缺血时表征单个红细胞通过孔道时的群体效应的参数变化(见表1)
表 1 反映单个红细胞通过孔道的群体效应的参数值(n均=10,±s)
组 别
红细胞滤过指数(IF)
阻力系统(β)
堵塞概率(ε)
正常对照组
27.57±11.40
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9.42±5.83
2.21±0.90
心绞痛组
126.14±33.221)
41.12±19.931)
4.28±0.801)
注: 1) 与正常对照组比较: P<0.001
2.2 心肌缺血时表征单个红细胞变形性的参数变化(见表2、 3)
表 2 红细胞内粘度的近似估算值及通道时间参数te、to、ti的中位数
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组 别
压差 (kPa)
内粘度
(mPa
s)
te
to
ti
正常对照组
0.039
10.2
, http://www.100md.com
3.0
2.5
5.0
心绞痛组
0.049
201.5
8.5
4.5
8.0
表 3 红细胞在不同状态下的通道通过时间参数分布频率
指标
组 别
通道时间(ms)
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40
80
120
160
200
240
320
360
600
800
1 000
te
正常对照组
, http://www.100md.com
13
79
3
2
2
心绞痛组
0
91
12
0
2
3
to
, 百拇医药 正常对照组
49
45
4
2
2
心绞痛组
0
78
12
5
3
ti
正常对照组
, http://www.100md.com
6
28
37
12
4
2
2
2
2
心绞痛组
0
30
14
12
, 百拇医药
11
25
5
2
1
3 讨 论
在血液循环系统中, 特别是微循环血液中, 红细胞聚集的生理意义就在于它们能增加低剪切流血液粘度及干扰红细胞循环, 形成血瘀。 当血液降低而成淤滞时, 红细胞聚集将产生。 一旦红细胞聚集产生, 将阻碍血流, 红细胞的聚集程度便进一步加重, 因此在临床疾病过程中将引起恶性循环。 有作者对194例冠心病检测红细胞聚集指数和红细胞变形能力, 其中不稳定性心绞痛红细胞聚集性增强, 尽管二组心绞痛均有红细胞变形性下降, 但无差别。 何作云等[3]对冠脉造影证实的不稳定性心绞痛红细胞变形性的分子基础研究证明, 红细胞膜收缩蛋白含量减少是其主要原因。 本实验采用一种新的硅微通道细胞流变学测量系统, 在一定程度上模拟了红细胞通过毛细血管的流变行为, 兼有微管及微孔滤膜的优点而又避免了二者的不足。 本研究结果显示冠心病心绞痛组患者血液的红细胞滤过指数、 阻力系统、 堵塞概率均较正常对照组明显增大, IF值愈大, 硬化程度愈高, 红细胞变形性越差。 而阻力系数β所反映的滤过阻力是一个平均、 群体参数, 所以心肌缺血时, 红细胞在模拟微循环系统中表现为硬度增加, 阻力增大, 运动速度下降, 变形性降低, 堵塞概率增加。 同时还表现为细胞内液粘度增加, 从入孔时间(te)、 出孔时间(to)、 过孔时间(ti)的频率分布峰值来看, 虽差别不很大, 但分布曲线明显出现较长的拖尾或峰值段展宽现象, 且中位数明显增大。 因此, 本方法可灵敏地反映心肌缺血时红细胞变形性的改变, IF、 β、 ε指标可反映群体综合信息, 细胞通过通道的时间参数te、 to、 ti的频率分布进一步提供该群体中单个细胞的进一步信息, 而te、 to、 ti的中位数则着重反映变形性差的细胞在整个细胞中所占比例及对群体流变特性的影响程度。
参考文献
1.何作云, 王瑞兴主编. 临床细胞流变学. 重庆: 重庆大学出版社, 1997. 2.
2.宋英晖,韩曼宇.红细胞变形性与疾病关系研究的近况.微循环学杂志,1998, 8(4):22.
3.何作云, 王红勇, 尹翠娥, 等. 冠心病红细胞变形性及其与膜收缩蛋白相关性分析和意义的初探. 中华血液学杂志, 1994, 15:483.
收稿日期：本文1998-11-10收到,1999-02-06修回, 1999-04-23接受, http://www.100md.com(迟路湘1 何国祥1 郑小林2)
单位：1.中国人民解放军第三军医大学西南医院心血管内科, 邮政编码 重庆400038； 2.重庆大学生物工程学院
关键词：心肌缺血；微循环；红细胞；硅微通道
心肌缺血时红细胞集群在模拟微循环 系统中的变化 目的: 旨在了解心肌缺血时红细胞集群在模拟微循环系统中的变化。 方法: 通过建立硅微通道毛细血管模型, 观测红细胞集群在模拟微循环系统中的变形性。 结果: 冠心病心绞痛组, 红细胞滤过指数(IF)、 阻力系数(β)、 堵塞概率(ε)均较对照组明显增大(P<0.01), 入孔时间(te)、 出孔时间(to)、 过孔时间(ti)中位数明显增大。 结论: 心肌缺血时, 红细胞在模拟微循环系统表现为硬度增加, 阻力增大, 运动速度下降, 变形性降低, 堵塞概率增加。
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Changes of Total Red Blood Cells in a Simulation of Microcirculation during Myocardial Ischaemia
Chi Luxiang, He Guoxiang, Zheng Xiaolin
Southwest Hospital, Third Military Medical University of Chinese PLA, Chongqing 400038
Objective: To understand the change of total red blood cells(RBCs) in a simulation of microcirculation during the myocardial ischaemia. Methods: The simulation system of capillary blood vessels by silicon microchannels was set up, and the deformability of total RBCs was measured in this system. Results: Compared with the control group, the filtration index(IF), filtration resistance(β) and block probability(ε) in the angina pectoris group increased significantly(P<0.01). Moreover, the temporal parameters of a single cell passing through the microchannels(the time for entering the pore, the time for exiting the pore, the total passage time) also increased markedly. Conclusion: The results indicate that during the myocardial ischaemia, the stiffness and resistance of the RBCs increase, the movement velocity of the RBCs decrease, and the block probability of the RBCs increase in a simulation system of microcirculation.
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Key words:Myocardial ischaemia; Microcirculation; Red blood cell; Silicon Microchannel
有关红细胞变形性研究, 国内外发展了不少方法, 但多数为研究单个红细胞的变形特征[1,2]。 本研究在吸收国外新技术方法的基础上, 在国内首次建立了模拟微循环系统, 即硅微通道毛细血管模型; 并观察了红细胞集群在通过硅通道毛细血管系统时的细胞流变特性。
1 资料和方法
1.1 配套仪器
WAYⅡ微量压积压(江苏), Nikon 210/45型显微镜(日本), QVM-310B监视器(日本), TK-S310EG型CCD摄像头(日本), VIDAS视频图像数据分析仪(德国)。
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1.2 试样制备
取静脉血2.25 ml, 用3.8%枸橼酸钠0.75 ml抗凝, 3 000 r/min离心8 min, 除去血浆和白细胞层, 用PBS液清洗三次, 并以3 000 r/min离心8 min, 除去上层清液, 制得纯红细胞液, 将红细胞液与PBS液按1∶9体积比制成红细胞悬液。
1.3 试样采集对象
(1) 健康正常人10例, 年龄35～40岁; (2) 冠心病心绞痛10例, 年龄40～52岁, 心绞痛发作时采集血标本, 本组病人冠脉造影证实冠脉狭窄均>50%。
1.4 实验系统及操作方法
系统如附图所示, 按我们成熟的方法进行。
附图 硅微通道毛细血管模型实验系统示意
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本实验系统中, 外管路包括一个PBS缓冲液贮存器、 二个废液瓶以及连接其间的管道和阀门。 为有效去除空气泡, 用-26.7～-66.6 kPa的高负压将管道及硅片座中的空气泡抽出, 同时也用于清洗管道。 低负压(≤-0.981 kPa)用于测量。 低负压测量采用玻璃毛细管水柱, 负压调节在实验中暂用注射器抽吸来实现。 废液瓶除了收集废液外, 还起稳定压力的作用。 图像摄取采用CCD(Charge-Coupled Devices)摄像机。 CCD的分辨率由CCD感光元件数决定, 并用调制传递函数MTF(f)表示。 为获得高的空间分辨率, 应选截止频率高的CCD, 并在频响范围内使MTF(f)愈高愈好。 和光导摄像管相比, CCD不需外加电子扫描, 输出信号与相应像素位置一一对应, 因而再生图像失真度小。 在使用中应注意, 饱和曝光量以上的过亮光像会在像素内产生并积累过饱和信号电荷, 并从一个像素的势阱经衬底扩散到相邻像素的势阱, 形成弥散现象, 使再生图像不该亮的地方也变亮。 一般CCD的饱和曝光量约为0.1～1.0 μJ/cm2。
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摄像所用光源的光谱特性要与红细胞的光谱吸收特性以及CCD的光谱特性相匹配。 实验表明红细胞对可见光中430 nm、 540 nm、 570 nm的光线具有很强的吸收能力, 若采用光源的光谱中富含这些光, 则将使细胞间隙部分光线明亮, 可获得对比度高、 界限分明的图像。
所采用的等负压过滤试验的典型测量过程:
(1) 将硅片座的基座放在盛有蒸馏水或缓冲液的器皿中, 然后将硅片放到基座的玻璃片上, 旋紧压盖, 使硅片与玻璃片紧密贴合。 在水中进行上述操作是为了排除微通路中可能存在的气泡。
(2) 打开阀A和B, 启动启负压泵(40.0～53.4 kPa)使缓冲液充满硅片座内硅片外的空间, 将蒸馏水置换为缓冲液。
(3) 关闭阀门B, 打开阀门D和A, 开启负压泵, 使缓冲液充满硅片的微通道及内腔。
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(4) 关闭阀A、 B, 将低负压调至-0.981 kPa, 打开阀C, 测定100 μl缓冲液流过硅微通道的时间。
(5) 向100 μl移液管内注入血液试样。
(6) 打开阀C, 在-0.981 kPa的负压吸引下, 测定100 μl血液试样通过微通道的时间(注意: 最初的10 μl溶液通过时间略去不计, 因已被缓冲液所稀释)。
(7) 调节负压, 测量在不同负压情况下红细胞通过微通道的情况。
(8) 关闭阀C, 打开阀B, 用高负压将移液管中的残留液吸除。
(9) 打开阀B、 A, 用高负压将硅片基座内及外管路中的残留试样排除。
(10) 取出硅片放在中性洗液中用超声波清洗干净, 供下次测量使用。
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1.5 红细胞变形性参数指标
计算: (1) 表征单个细胞通过孔道时的群体效应的参数: 红细胞滤过指数(IF)、 单个红细胞通过微通道的阻力系数(β)、 红细胞过孔时的堵塞概率(ε); (2) 表征单个红细胞变形性的参数: 红细胞内液粘度(η)、 红细胞通过微通道的时间参数te(在某一恒定吸压下, 细胞进入通道所需的时间)、 to(红细胞到达通道尾端后完全流出通道所需的时间)、 ti(通道中时间)。
1.6 统计学处理
实验数据均以
±s表示, 组间比较用Students t进行统计检验, P<0.05为差异显著。, 百拇医药
2 结 果
2.1 心肌缺血时表征单个红细胞通过孔道时的群体效应的参数变化(见表1)
表 1 反映单个红细胞通过孔道的群体效应的参数值(n均=10,
±s)组 别
红细胞滤过指数(IF)
阻力系统(β)
堵塞概率(ε)
正常对照组
27.57±11.40
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9.42±5.83
2.21±0.90
心绞痛组
126.14±33.221)
41.12±19.931)
4.28±0.801)
注: 1) 与正常对照组比较: P<0.001
2.2 心肌缺血时表征单个红细胞变形性的参数变化(见表2、 3)
表 2 红细胞内粘度的近似估算值及通道时间参数te、to、ti的中位数
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组 别
压差 (kPa)
内粘度
(mPa
s)te
to
ti
正常对照组
0.039
10.2
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3.0
2.5
5.0
心绞痛组
0.049
201.5
8.5
4.5
8.0
表 3 红细胞在不同状态下的通道通过时间参数分布频率
指标
组 别
通道时间(ms)
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40
80
120
160
200
240
320
360
600
800
1 000
te
正常对照组
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13
79
3
2
2
心绞痛组
0
91
12
0
2
3
to
, 百拇医药 正常对照组
49
45
4
2
2
心绞痛组
0
78
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5
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ti
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37
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4
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2
2
2
心绞痛组
0
30
14
12
, 百拇医药
11
25
5
2
1
3 讨 论
在血液循环系统中, 特别是微循环血液中, 红细胞聚集的生理意义就在于它们能增加低剪切流血液粘度及干扰红细胞循环, 形成血瘀。 当血液降低而成淤滞时, 红细胞聚集将产生。 一旦红细胞聚集产生, 将阻碍血流, 红细胞的聚集程度便进一步加重, 因此在临床疾病过程中将引起恶性循环。 有作者对194例冠心病检测红细胞聚集指数和红细胞变形能力, 其中不稳定性心绞痛红细胞聚集性增强, 尽管二组心绞痛均有红细胞变形性下降, 但无差别。 何作云等[3]对冠脉造影证实的不稳定性心绞痛红细胞变形性的分子基础研究证明, 红细胞膜收缩蛋白含量减少是其主要原因。 本实验采用一种新的硅微通道细胞流变学测量系统, 在一定程度上模拟了红细胞通过毛细血管的流变行为, 兼有微管及微孔滤膜的优点而又避免了二者的不足。 本研究结果显示冠心病心绞痛组患者血液的红细胞滤过指数、 阻力系统、 堵塞概率均较正常对照组明显增大, IF值愈大, 硬化程度愈高, 红细胞变形性越差。 而阻力系数β所反映的滤过阻力是一个平均、 群体参数, 所以心肌缺血时, 红细胞在模拟微循环系统中表现为硬度增加, 阻力增大, 运动速度下降, 变形性降低, 堵塞概率增加。 同时还表现为细胞内液粘度增加, 从入孔时间(te)、 出孔时间(to)、 过孔时间(ti)的频率分布峰值来看, 虽差别不很大, 但分布曲线明显出现较长的拖尾或峰值段展宽现象, 且中位数明显增大。 因此, 本方法可灵敏地反映心肌缺血时红细胞变形性的改变, IF、 β、 ε指标可反映群体综合信息, 细胞通过通道的时间参数te、 to、 ti的频率分布进一步提供该群体中单个细胞的进一步信息, 而te、 to、 ti的中位数则着重反映变形性差的细胞在整个细胞中所占比例及对群体流变特性的影响程度。
参考文献
1.何作云, 王瑞兴主编. 临床细胞流变学. 重庆: 重庆大学出版社, 1997. 2.
2.宋英晖,韩曼宇.红细胞变形性与疾病关系研究的近况.微循环学杂志,1998, 8(4):22.
3.何作云, 王红勇, 尹翠娥, 等. 冠心病红细胞变形性及其与膜收缩蛋白相关性分析和意义的初探. 中华血液学杂志, 1994, 15:483.
收稿日期：本文1998-11-10收到,1999-02-06修回, 1999-04-23接受, http://www.100md.com(迟路湘1 何国祥1 郑小林2)