肝脏缺血再灌注损伤与肝微循环变化
作者：熊成龙1 赫 杰1 邬善敏1 陈孝平2 吴在德2
单位：1 湖北医科大学附属第一医院外科, 邮政编码 武汉430060； 2 同济医科大学附属同济医院外科
关键词：微循环；肝脏；缺血再灌注；大鼠
微循环学杂志/990205 目的: 探讨肝脏缺血再灌注过程中肝微循环变化及其在再灌注损伤中的作用。 方法: 采用大鼠缺血再灌注模型, 按肝血流阻断时间将260只大鼠分为假手术对照组、 阻断20、 40、 60和90 min组; 观察各组动物的存活和血清转氨酶的变化, 测定各组动物在血流阻断期末、 开放2 h时的肝坏死范围, 肝门静脉恒压灌流量和肝血窦超微结构的变化。 结果: 各阻断组动物死亡率分别为5%、 10%、 85%和95%; 术后2天内死亡率最高, 伴随血清转氨酶明显上升。 血流阻断20、 40、 60和90 min组再开放2 h, 肝总坏死范围分别为3.9%、 13.5%、 66.4%和82.7%, 其中肝血流开放后的肝坏死范围分别占肝总坏死范围的7.7%、 11.1%、 68.1%和67.2%; 肝门静脉恒压灌流量于阻断期末分别下降5.3%、 14.7%、 44.1%和56.5%; 肝血窦在阻断20、 40 min组无阻塞现象, 阻断60和90 min组出现血细胞, 膜浆泡和纤维束积滞, 阻塞血窦面积占肝血窦总面积的50%。 结论: 肝血流阻断后肝损伤不仅发生在缺血期, 更重要的是发生在再灌注时; 再灌注损伤的发生与缺血时间长短、 肝微循环再灌注障碍有关。
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Liver Ischemia Reperfusion Injury and Changes of Liver Microcirculation
Xiong Chenglong, He Jie, Wu Shanmin, et al
First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060
Objective: To assess the relationship between liver ischemia-reperfusion injury and the changes of liver microcirculation. Methods: A model of normothermic hepatic blood flow clamping and declamping in rat was adopted. The animals survived, alamine aminotransferase serum(SALT) level, extent of hepatic necrosis, liver volume of blood flow and ultrastructure of liver sinusoids during various periods of ischemia and reperfusion were observed comparatively. Results: The mortality in group of false operation, ischemia for 20, 40, 60 and 90 minutes was 0%, 5%, 10%, 85% and 95% respectively; and animals died with a high SALT level. After 20, 40, 60 or 90 minutes ischemia and 120 minutes reperfusion, the ratio of necrotic to no-necrotic liver were 3.9%, 13.5%, 66.4% or 82.7%, of those the percentage necrosis during reperfusion 120 minutes was 7.7%, 11.1%, 68.1% or 67.2% respectively; The liver volume of blood flow decreased to 94.7%, 85.3%, 55.9% or 43.5% of normal values in end of ischemia; Liver sinusoidal obstruction by blebs originating from the hepatocytes, fragments of sinusoidal endothelial cell damage and aggregation of blood cells was observed in group of 60, 90 minutes ischemia. Conclusions: Liver ischemia can result in cellular injury from ischemia itself, but an addition component of injury results from events occurring during reperfusion after lengthening of the ischemia, and show that reperfusion injury was attributed to the microcirculatory disturbance, decreasing liver blood flow, increasing rapidly the degree of irreversible damage and mortality.
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Key words: Microcirculation; Ischemia reperfusion; Liver; Rat
肝脏缺血再灌注见于许多临床疾病和手术过程中。 肝缺血再灌注时, 肝脏组织细胞发生一系列代谢、 结构和功能的损伤, 甚至导致肝功能衰竭, 是影响疾病预后、 手术成败和病人存活的主要因素之一。 因此研究肝缺血再灌注损伤和防治具有重要的临床意义。 目前有关常温肝缺血再灌注损伤与肝微循环变化的关系有待研究, 本实验对此进行初步观察, 为防治肝缺血再灌注损伤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型与分组
健康Wistar大鼠, 雌雄兼用, 体重200～250 g。 禁食12 h后, 腹腔注射3%戊巴比妥钠300 mg/kg(体重)施行麻醉。 上腹正中切口进腹, 分离切断肝脏周围诸韧带, 解剖肝门。 按大鼠肝脏分叶, 用小号无损伤动脉夹选择性阻断肝脏左、 中叶肝蒂(包括肝动脉、 门静脉和胆管); 保留余肝叶血流, 避免门静脉系统瘀血。 阻断一定时间后, 放开动脉夹, 恢复阻断肝叶的血供; 同时结扎未阻断肝叶肝蒂, 防止其盗流发生, 造成部分肝脏(70%)缺血再灌注模型[1]。 根据不同的肝血流阻断时间, 将260只大鼠随机分成五组: 假手术对照组(肝血流阻断后立即开放), 阻断20、 40、 60和90 min组。 假手术对照组20只动物, 各阻断组均为60只动物。
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1.2 观察项目与方法
死亡率: 每组随机选择20只大鼠, 手术完毕后关闭腹腔, 待动物苏醒后, 自由进食饮水, 喂养7天, 临床观察计算死亡率。
血清转氨酶测定: 对进行死亡率观察的动物, 于术前、 术后2 h和术后1、 2、 4、 7天, 经尾静脉采集血样, 按Reitman法测定血清谷丙转氨酶(ALT)水平。
肝门静脉恒压灌流量测定: 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择20只动物, 行门静脉插管, 结扎肝上、 肝下下腔静脉并切断肝下下腔静脉; 用稀释血液作门静脉灌流, 调定灌流压为0.98 kPa, 记录灌流量[2]。
肝坏死范围测量: 在行肝门静脉灌流量测定后, 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择15只动物, 将阻断肝叶横行切成厚1 cm的片块状, 置于25 ℃的硝基四氮唑蓝液中孵育20 min; 按未染色的区域作为坏死肝组织计算肝脏坏死范围(即占缺血肝叶组织的百分率)[3]; 开放后2 h所测定的肝坏死范围为肝总坏死范围。
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肝血窦超微结构观察: 在行肝门静脉灌流量测定后, 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择5只动物, 用2.5%戊二醛作肝脏灌注固定; 将固定的肝左、 中叶切成50～70块, 随机选择5块行锇酸后固定, 单宁酸导电染色, 液氮冷冻割断, 临界点干燥; 样品喷金后用日立S520型扫描电子显微镜观察。
1.3 实验数据统计学处理
实验所得统计量用率或平均数±标准差表达, 率或平均数的差异显著性检验分别采取U检验法或t检验法。
2 结 果
2.1 动物存活情况
假手术对照组无动物死亡。 血流阻断20、 40、 60和90 min组术后7天动物死亡率分别为5%、 10%、 85%和95%(图1)。 各阻断组动物均以术后2天内死亡率最高。 术后7天, 阻断40 min组有18只(90%)动物存活, 而阻断60 min组仅有2只(15%)动物存活, 二者差异有显著性意义(P<0.05)。
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2.2 血清转氨酶水平变化
各组分别对3～20只动物行血清ALT测定。 ALT水平于肝血流阻断后2 h明显上升, 24 h达高峰, 然后渐渐下降至正常水平。 死亡动物血清ALT水平明显升高。 各组动物术后24 h血清ALT水平分别为110、 160、 180、 380和490 U/L(图1), 阻断40 min组明显低于阻断60 min组(P<0.05)。
2.3 肝脏大体观察
正常大鼠肝表面色泽红润, 阻断肝血流后, 颜色变成暗红色; 随阻断时间延长, 渐渐变成浅灰色, 质地变软。
阻断20 min组血流开放后, 肝表面颜色很快恢复正常, 未见肝脏肿胀; 阻断40 min组复流后, 肝表面呈现少量点状无复流区域; 阻断60 min组复流后, 无复流区域增多、 增大, 使肝表面呈现花斑状, 随复流时间延长, 有些无复流区进一步扩大, 有些则缩小、 消失。 阻断90 min组复流后, 肝表面呈灰红相间的斑块状。
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2.4 肝门静脉恒压灌流量变化
阻断20、 40 min组于阻断期末灌流量无明显下降, 分别为正常组的94.7%和85.3%, 血流开放2 h后仍保持91.2%和80.4%; 而阻断60、 90 min组于阻断期末灌流量明显下降, 分别为假手术对照组的55.9%、 43.5%, 开放血流后2 h仍继续下降, 分别为41.7%、 32.8%(图2), 与阻断20、 40 min组比较有极显著性差异(P<0.01)。
2.5 肝坏死范围变化
假手术对照组坏死范围为0.8%。 阻断20、 40、 60和90 min组在阻断期末, 肝坏死范围分别为3.6%、 12.1%、 21.2%和27.1%。 各阻断组血流开放后2 h肝总坏死范围分别为3.9%、 13.5%、 66.4%和82.7%; 由此推算其中的再灌注期间肝坏死范围分别占肝总坏死范围的7.7%、 11.1%、 68.1%和67.2%, 阻断血流40 min组明显小于阻断60 min组(P<0.05), 见图1、 2。
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图 1 大鼠术后7天死亡率、 24 h血清ALT水平和
2h肝总坏死范围的变化
2 大鼠肝血流阻断、 开放期肝坏死范围
和门静脉灌流量的变化
2.6 肝血窦扫描电镜观察
假手术对照组: 正常大鼠肝血窦宽大而不规则, 灌注固定液通过流畅而使血窦无血液有形成分积滞。 在扫描电镜下可清晰地观察到肝血窦衬有一层极薄的内皮, 覆盖在肝细胞窦面微绒毛上。 肝血窦内皮细胞有核部稍厚, 扁平部有许多直径约0.1 μm小孔, 常10～20个聚集成内皮筛板; 内皮小孔上无隔膜、 下无基底膜, 可从小孔窥见其下的肝细胞微绒毛和Disse间隙(图3A)。
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阻断20 min组: 肝血窦内皮小孔扩大; 肝细胞微绒毛水肿, 形成膜浆泡, 从扩大的内皮小孔向血窦腔内膨出(图3B)。 再开放后2 h, 上述变化恢复正常, 肝血窦腔通畅, 无血液有形成分积滞(图3C)。
阻断40 min组: 肝血窦内皮小孔普遍扩大、 融合, 使内皮出现许多大洞隙; 膨出血窦腔内的膜浆泡增多、 增大(图3D)。 再灌注后2 h, 肝血窦腔通畅, 未见膜浆泡和血液有形成分; 内皮小孔数量明显减少, 内皮筛板不规则(图3E)。
阻断60 min组: 肝血窦腔内见大量的明显增大的膜浆泡和血细胞积滞, 并有散在的纤维束分布其中; 内皮小孔扩大, 筛板融合, 内皮回缩似树根状或洞网状覆盖在肝细胞上(图3F)。 再开放后2 h, 肝血窦腔充满大量膜浆泡、 血细胞和纤维束(图3G)。
阻断90 min组: 阻断期末和再开放后2 h, 肝血窦腔内积滞大量膜浆泡、 血细胞和网状纤维束。 大多处内皮皱缩、 塌溃、 脱落, 许多肝血窦无内皮衬托, 肝细胞完全暴露于血窦腔内(图3H、 图3I)。
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各组于血流阻断期末和再开放2 h分别取5块样品进行断面连续扫描摄像, 获得扫描电镜照片440幅; 用半自动体视仪测量肝总血窦面积和被阻塞血窦面积, 然后计算阻塞血窦占总血窦的面积百分率(图4)。 结果阻断60、 90 min组的阻塞肝血窦面积明显大于阻断20、 40 min(P<0.01)。
图 4 大鼠肝血流阻断、 开放后肝血窦腔阻塞面积的变化
3 讨 论
人体器官缺血再灌注是临床常见的基本病理过程。 脏器缺血再灌注过程中, 组织细胞损伤坏死不仅发生在缺血期, 而且可发生在再灌注期间。 肝脏血液循环丰富, 对缺血敏感, 耐受缺血能力差。 本实验中, 大鼠肝血流阻断20、 40、 60和90 min组肝总坏死范围分别为3.9%、 13.8%、 64.4%和82.7%, 其中再灌注期间肝坏死范围分别占肝总坏死范围的7.7%、 11.1%、 68.1%和67.2%, 动物死亡率分别为5%、 10%、 85%和95%, 急性肝损伤指标血清ALT水平在缺血60和90 min组明显升高。 表明肝血流阻断后, 肝损伤程度随缺血时间延长而渐进加重, 再灌注损伤的发生与缺血时间长短密切相关。 当肝缺血超过40 min后, 由于再灌注期肝坏死范围迅速扩大, 导致肝总坏死范围迅速扩大, 动物死亡率迅速上升。 因此再灌注损伤在肝脏长时间缺血后肝功能衰竭的发生中起重要作用。
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肝血窦是肝脏微循环毛细血管, 本实验中观察到, 肝缺血20、 40 min肝血窦无明显阻塞现象, 再灌注后无再灌流紊乱; 而缺血60、 90 min肝血窦发生大面积阻塞, 再灌流后肝血窦灌注能力严重下降, 肝脏存在大量的无灌流区域, 肝血流量明显下降。 这表明肝缺血超过40 min后再灌流时, 面临着肝微循环再灌注障碍, 肝脏仍处于缺血状态, 这是再灌注损伤发生的重要原因。
肝脏缺血再灌注何以导致肝微循环障碍? 本实验结果显示: (1) 肝缺血时, 肝细胞缺氧性水肿, 微绒毛肿胀形成膜浆泡, 从扩大的内皮小孔突出在血窦腔内, 再灌注时像血栓一样引起血窦阻塞。 据报道[4]肝细胞膜浆泡的形成与缺血时肝细胞内ATP水平下降、 钙离子异常增多、 细胞骨架结构破坏有关。 (2) 肝缺血时大量血细胞聚集, 再灌注时阻塞血窦。 这与肝窦枯否氏细胞激活, 释放细胞因子(肿瘤坏死因子、 白介素-1和γ干扰素等), 促使淋巴细胞、 粒细胞通过粘附分子结合在内皮细胞上有关[5]。 (3) 肝缺血时肝血窦内皮细胞缺氧损害, 其表面受体和其下组织结构显露, 致血小板粘附, 血管内凝血成微血栓, 再灌注时阻塞肝血窦。 (4) 肝缺血时, 由于肝窦内皮细胞糖原极少、 能量供应差, 腺嘌呤核苷酸快速分解成黄嘌呤, 同时内皮细胞产生大量黄嘌呤氧化酶, 再灌注供氧后诱导产生大量氧自由基, 破坏膜性结构; 聚集在血窦内的淋巴细胞、 粒细胞和激活的枯否氏细胞可产生大量淋巴因子和氧自由基, 造成内皮损害; 受损害内皮细胞因内皮筛板溃塌形成许多大洞隙, 上无隔膜、 下缺乏基底膜固着, 再灌流时在血流冲击下, 容易脱落, 阻塞血窦[6]。 总之, 肝脏缺血再灌注时肝微循环障碍的原因和导致再灌注损伤的机制复杂, 是目前研究的重要课题。
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参考文献
1.Derry CD, Slapak M. A new model for acute hepatic failure. Br J Surg, 1973, 60(11):901～904.
2.Wisse E, De Zangre RB, Charels K, et al. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology, 1985, 5(4):683～692.
3.Frederiks WM, Fronik GM, Hesseling MG. A method for quantitative analysis of the extent of necrosis in ischemic rat liver. Exp Mol Pathol, 1984, 41:119～125.
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4.Thomas CE, Reed DJ. Current status of calcium in hepatocellular injury. Hepatology, 1990, 10(3):375～384.
5.Caldwell-Kenkel LC, Currin RT, Tanaka Y, et al. Kupffer cell activation and endothelial cell damage after storge of rat liver: effect of reperfusion. Hepatology, 1991, 11(1):85～90.
6.熊成龙, 吴在德. 肝血窦内皮细胞缺血再灌注损伤. 国外医学外科学分册, 1993, 3:135～138.
收稿日期：本文1998-10-09收到, 1998-12-25修回,1999-03-29接受, http://www.100md.com(熊成龙1 赫 杰1 邬善敏1 陈孝平2 吴在德2)
单位：1 湖北医科大学附属第一医院外科, 邮政编码 武汉430060； 2 同济医科大学附属同济医院外科
关键词：微循环；肝脏；缺血再灌注；大鼠
微循环学杂志/990205 目的: 探讨肝脏缺血再灌注过程中肝微循环变化及其在再灌注损伤中的作用。 方法: 采用大鼠缺血再灌注模型, 按肝血流阻断时间将260只大鼠分为假手术对照组、 阻断20、 40、 60和90 min组; 观察各组动物的存活和血清转氨酶的变化, 测定各组动物在血流阻断期末、 开放2 h时的肝坏死范围, 肝门静脉恒压灌流量和肝血窦超微结构的变化。 结果: 各阻断组动物死亡率分别为5%、 10%、 85%和95%; 术后2天内死亡率最高, 伴随血清转氨酶明显上升。 血流阻断20、 40、 60和90 min组再开放2 h, 肝总坏死范围分别为3.9%、 13.5%、 66.4%和82.7%, 其中肝血流开放后的肝坏死范围分别占肝总坏死范围的7.7%、 11.1%、 68.1%和67.2%; 肝门静脉恒压灌流量于阻断期末分别下降5.3%、 14.7%、 44.1%和56.5%; 肝血窦在阻断20、 40 min组无阻塞现象, 阻断60和90 min组出现血细胞, 膜浆泡和纤维束积滞, 阻塞血窦面积占肝血窦总面积的50%。 结论: 肝血流阻断后肝损伤不仅发生在缺血期, 更重要的是发生在再灌注时; 再灌注损伤的发生与缺血时间长短、 肝微循环再灌注障碍有关。
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Liver Ischemia Reperfusion Injury and Changes of Liver Microcirculation
Xiong Chenglong, He Jie, Wu Shanmin, et al
First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060
Objective: To assess the relationship between liver ischemia-reperfusion injury and the changes of liver microcirculation. Methods: A model of normothermic hepatic blood flow clamping and declamping in rat was adopted. The animals survived, alamine aminotransferase serum(SALT) level, extent of hepatic necrosis, liver volume of blood flow and ultrastructure of liver sinusoids during various periods of ischemia and reperfusion were observed comparatively. Results: The mortality in group of false operation, ischemia for 20, 40, 60 and 90 minutes was 0%, 5%, 10%, 85% and 95% respectively; and animals died with a high SALT level. After 20, 40, 60 or 90 minutes ischemia and 120 minutes reperfusion, the ratio of necrotic to no-necrotic liver were 3.9%, 13.5%, 66.4% or 82.7%, of those the percentage necrosis during reperfusion 120 minutes was 7.7%, 11.1%, 68.1% or 67.2% respectively; The liver volume of blood flow decreased to 94.7%, 85.3%, 55.9% or 43.5% of normal values in end of ischemia; Liver sinusoidal obstruction by blebs originating from the hepatocytes, fragments of sinusoidal endothelial cell damage and aggregation of blood cells was observed in group of 60, 90 minutes ischemia. Conclusions: Liver ischemia can result in cellular injury from ischemia itself, but an addition component of injury results from events occurring during reperfusion after lengthening of the ischemia, and show that reperfusion injury was attributed to the microcirculatory disturbance, decreasing liver blood flow, increasing rapidly the degree of irreversible damage and mortality.
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Key words: Microcirculation; Ischemia reperfusion; Liver; Rat
肝脏缺血再灌注见于许多临床疾病和手术过程中。 肝缺血再灌注时, 肝脏组织细胞发生一系列代谢、 结构和功能的损伤, 甚至导致肝功能衰竭, 是影响疾病预后、 手术成败和病人存活的主要因素之一。 因此研究肝缺血再灌注损伤和防治具有重要的临床意义。 目前有关常温肝缺血再灌注损伤与肝微循环变化的关系有待研究, 本实验对此进行初步观察, 为防治肝缺血再灌注损伤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型与分组
健康Wistar大鼠, 雌雄兼用, 体重200～250 g。 禁食12 h后, 腹腔注射3%戊巴比妥钠300 mg/kg(体重)施行麻醉。 上腹正中切口进腹, 分离切断肝脏周围诸韧带, 解剖肝门。 按大鼠肝脏分叶, 用小号无损伤动脉夹选择性阻断肝脏左、 中叶肝蒂(包括肝动脉、 门静脉和胆管); 保留余肝叶血流, 避免门静脉系统瘀血。 阻断一定时间后, 放开动脉夹, 恢复阻断肝叶的血供; 同时结扎未阻断肝叶肝蒂, 防止其盗流发生, 造成部分肝脏(70%)缺血再灌注模型[1]。 根据不同的肝血流阻断时间, 将260只大鼠随机分成五组: 假手术对照组(肝血流阻断后立即开放), 阻断20、 40、 60和90 min组。 假手术对照组20只动物, 各阻断组均为60只动物。
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1.2 观察项目与方法
死亡率: 每组随机选择20只大鼠, 手术完毕后关闭腹腔, 待动物苏醒后, 自由进食饮水, 喂养7天, 临床观察计算死亡率。
血清转氨酶测定: 对进行死亡率观察的动物, 于术前、 术后2 h和术后1、 2、 4、 7天, 经尾静脉采集血样, 按Reitman法测定血清谷丙转氨酶(ALT)水平。
肝门静脉恒压灌流量测定: 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择20只动物, 行门静脉插管, 结扎肝上、 肝下下腔静脉并切断肝下下腔静脉; 用稀释血液作门静脉灌流, 调定灌流压为0.98 kPa, 记录灌流量[2]。
肝坏死范围测量: 在行肝门静脉灌流量测定后, 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择15只动物, 将阻断肝叶横行切成厚1 cm的片块状, 置于25 ℃的硝基四氮唑蓝液中孵育20 min; 按未染色的区域作为坏死肝组织计算肝脏坏死范围(即占缺血肝叶组织的百分率)[3]; 开放后2 h所测定的肝坏死范围为肝总坏死范围。
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肝血窦超微结构观察: 在行肝门静脉灌流量测定后, 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择5只动物, 用2.5%戊二醛作肝脏灌注固定; 将固定的肝左、 中叶切成50～70块, 随机选择5块行锇酸后固定, 单宁酸导电染色, 液氮冷冻割断, 临界点干燥; 样品喷金后用日立S520型扫描电子显微镜观察。
1.3 实验数据统计学处理
实验所得统计量用率或平均数±标准差表达, 率或平均数的差异显著性检验分别采取U检验法或t检验法。
2 结 果
2.1 动物存活情况
假手术对照组无动物死亡。 血流阻断20、 40、 60和90 min组术后7天动物死亡率分别为5%、 10%、 85%和95%(图1)。 各阻断组动物均以术后2天内死亡率最高。 术后7天, 阻断40 min组有18只(90%)动物存活, 而阻断60 min组仅有2只(15%)动物存活, 二者差异有显著性意义(P<0.05)。
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2.2 血清转氨酶水平变化
各组分别对3～20只动物行血清ALT测定。 ALT水平于肝血流阻断后2 h明显上升, 24 h达高峰, 然后渐渐下降至正常水平。 死亡动物血清ALT水平明显升高。 各组动物术后24 h血清ALT水平分别为110、 160、 180、 380和490 U/L(图1), 阻断40 min组明显低于阻断60 min组(P<0.05)。
2.3 肝脏大体观察
正常大鼠肝表面色泽红润, 阻断肝血流后, 颜色变成暗红色; 随阻断时间延长, 渐渐变成浅灰色, 质地变软。
阻断20 min组血流开放后, 肝表面颜色很快恢复正常, 未见肝脏肿胀; 阻断40 min组复流后, 肝表面呈现少量点状无复流区域; 阻断60 min组复流后, 无复流区域增多、 增大, 使肝表面呈现花斑状, 随复流时间延长, 有些无复流区进一步扩大, 有些则缩小、 消失。 阻断90 min组复流后, 肝表面呈灰红相间的斑块状。
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2.4 肝门静脉恒压灌流量变化
阻断20、 40 min组于阻断期末灌流量无明显下降, 分别为正常组的94.7%和85.3%, 血流开放2 h后仍保持91.2%和80.4%; 而阻断60、 90 min组于阻断期末灌流量明显下降, 分别为假手术对照组的55.9%、 43.5%, 开放血流后2 h仍继续下降, 分别为41.7%、 32.8%(图2), 与阻断20、 40 min组比较有极显著性差异(P<0.01)。
2.5 肝坏死范围变化
假手术对照组坏死范围为0.8%。 阻断20、 40、 60和90 min组在阻断期末, 肝坏死范围分别为3.6%、 12.1%、 21.2%和27.1%。 各阻断组血流开放后2 h肝总坏死范围分别为3.9%、 13.5%、 66.4%和82.7%; 由此推算其中的再灌注期间肝坏死范围分别占肝总坏死范围的7.7%、 11.1%、 68.1%和67.2%, 阻断血流40 min组明显小于阻断60 min组(P<0.05), 见图1、 2。
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图 1 大鼠术后7天死亡率、 24 h血清ALT水平和
2h肝总坏死范围的变化
2 大鼠肝血流阻断、 开放期肝坏死范围
和门静脉灌流量的变化
2.6 肝血窦扫描电镜观察
假手术对照组: 正常大鼠肝血窦宽大而不规则, 灌注固定液通过流畅而使血窦无血液有形成分积滞。 在扫描电镜下可清晰地观察到肝血窦衬有一层极薄的内皮, 覆盖在肝细胞窦面微绒毛上。 肝血窦内皮细胞有核部稍厚, 扁平部有许多直径约0.1 μm小孔, 常10～20个聚集成内皮筛板; 内皮小孔上无隔膜、 下无基底膜, 可从小孔窥见其下的肝细胞微绒毛和Disse间隙(图3A)。
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阻断20 min组: 肝血窦内皮小孔扩大; 肝细胞微绒毛水肿, 形成膜浆泡, 从扩大的内皮小孔向血窦腔内膨出(图3B)。 再开放后2 h, 上述变化恢复正常, 肝血窦腔通畅, 无血液有形成分积滞(图3C)。
阻断40 min组: 肝血窦内皮小孔普遍扩大、 融合, 使内皮出现许多大洞隙; 膨出血窦腔内的膜浆泡增多、 增大(图3D)。 再灌注后2 h, 肝血窦腔通畅, 未见膜浆泡和血液有形成分; 内皮小孔数量明显减少, 内皮筛板不规则(图3E)。
阻断60 min组: 肝血窦腔内见大量的明显增大的膜浆泡和血细胞积滞, 并有散在的纤维束分布其中; 内皮小孔扩大, 筛板融合, 内皮回缩似树根状或洞网状覆盖在肝细胞上(图3F)。 再开放后2 h, 肝血窦腔充满大量膜浆泡、 血细胞和纤维束(图3G)。
阻断90 min组: 阻断期末和再开放后2 h, 肝血窦腔内积滞大量膜浆泡、 血细胞和网状纤维束。 大多处内皮皱缩、 塌溃、 脱落, 许多肝血窦无内皮衬托, 肝细胞完全暴露于血窦腔内(图3H、 图3I)。
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各组于血流阻断期末和再开放2 h分别取5块样品进行断面连续扫描摄像, 获得扫描电镜照片440幅; 用半自动体视仪测量肝总血窦面积和被阻塞血窦面积, 然后计算阻塞血窦占总血窦的面积百分率(图4)。 结果阻断60、 90 min组的阻塞肝血窦面积明显大于阻断20、 40 min(P<0.01)。
图 4 大鼠肝血流阻断、 开放后肝血窦腔阻塞面积的变化
3 讨 论
人体器官缺血再灌注是临床常见的基本病理过程。 脏器缺血再灌注过程中, 组织细胞损伤坏死不仅发生在缺血期, 而且可发生在再灌注期间。 肝脏血液循环丰富, 对缺血敏感, 耐受缺血能力差。 本实验中, 大鼠肝血流阻断20、 40、 60和90 min组肝总坏死范围分别为3.9%、 13.8%、 64.4%和82.7%, 其中再灌注期间肝坏死范围分别占肝总坏死范围的7.7%、 11.1%、 68.1%和67.2%, 动物死亡率分别为5%、 10%、 85%和95%, 急性肝损伤指标血清ALT水平在缺血60和90 min组明显升高。 表明肝血流阻断后, 肝损伤程度随缺血时间延长而渐进加重, 再灌注损伤的发生与缺血时间长短密切相关。 当肝缺血超过40 min后, 由于再灌注期肝坏死范围迅速扩大, 导致肝总坏死范围迅速扩大, 动物死亡率迅速上升。 因此再灌注损伤在肝脏长时间缺血后肝功能衰竭的发生中起重要作用。
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肝血窦是肝脏微循环毛细血管, 本实验中观察到, 肝缺血20、 40 min肝血窦无明显阻塞现象, 再灌注后无再灌流紊乱; 而缺血60、 90 min肝血窦发生大面积阻塞, 再灌流后肝血窦灌注能力严重下降, 肝脏存在大量的无灌流区域, 肝血流量明显下降。 这表明肝缺血超过40 min后再灌流时, 面临着肝微循环再灌注障碍, 肝脏仍处于缺血状态, 这是再灌注损伤发生的重要原因。
肝脏缺血再灌注何以导致肝微循环障碍? 本实验结果显示: (1) 肝缺血时, 肝细胞缺氧性水肿, 微绒毛肿胀形成膜浆泡, 从扩大的内皮小孔突出在血窦腔内, 再灌注时像血栓一样引起血窦阻塞。 据报道[4]肝细胞膜浆泡的形成与缺血时肝细胞内ATP水平下降、 钙离子异常增多、 细胞骨架结构破坏有关。 (2) 肝缺血时大量血细胞聚集, 再灌注时阻塞血窦。 这与肝窦枯否氏细胞激活, 释放细胞因子(肿瘤坏死因子、 白介素-1和γ干扰素等), 促使淋巴细胞、 粒细胞通过粘附分子结合在内皮细胞上有关[5]。 (3) 肝缺血时肝血窦内皮细胞缺氧损害, 其表面受体和其下组织结构显露, 致血小板粘附, 血管内凝血成微血栓, 再灌注时阻塞肝血窦。 (4) 肝缺血时, 由于肝窦内皮细胞糖原极少、 能量供应差, 腺嘌呤核苷酸快速分解成黄嘌呤, 同时内皮细胞产生大量黄嘌呤氧化酶, 再灌注供氧后诱导产生大量氧自由基, 破坏膜性结构; 聚集在血窦内的淋巴细胞、 粒细胞和激活的枯否氏细胞可产生大量淋巴因子和氧自由基, 造成内皮损害; 受损害内皮细胞因内皮筛板溃塌形成许多大洞隙, 上无隔膜、 下缺乏基底膜固着, 再灌流时在血流冲击下, 容易脱落, 阻塞血窦[6]。 总之, 肝脏缺血再灌注时肝微循环障碍的原因和导致再灌注损伤的机制复杂, 是目前研究的重要课题。
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参考文献
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4.Thomas CE, Reed DJ. Current status of calcium in hepatocellular injury. Hepatology, 1990, 10(3):375～384.
5.Caldwell-Kenkel LC, Currin RT, Tanaka Y, et al. Kupffer cell activation and endothelial cell damage after storge of rat liver: effect of reperfusion. Hepatology, 1991, 11(1):85～90.
6.熊成龙, 吴在德. 肝血窦内皮细胞缺血再灌注损伤. 国外医学外科学分册, 1993, 3:135～138.
收稿日期：本文1998-10-09收到, 1998-12-25修回,1999-03-29接受, http://www.100md.com(熊成龙1 赫 杰1 邬善敏1 陈孝平2 吴在德2)