生物发光法检测血小板ATP、ADP及其初步应用
作者：洪大蓉 赖启明
单位：洪大蓉(南京铁道医学院附属医院， 邮政编码 南京210009)；赖启明(南京铁道医学院附属医院， 邮政编码 南京210009)
关键词：
微循环学杂志000237
本文用荧光素-荧光素酶(Luciferin-Luciferase)与ATP结合生物发光的原理， 检测血小板A TP、 ADP的释放功能， 以诊断血小板释放功能障碍性疾病。
1 资料与方法
1.1 资料
原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者16例(男3例、 女13例)， 年龄11～26岁， 均经我院血 液科诊断。 正常对照组10例(男7例、 女3例)， 年龄33～67岁， 均无心、 肝、 肾、 血 液等疾病的健康献血员。
, http://www.100md.com
试剂： E-E液： 96%乙醇9份加100 mmol/L EDTA-Na 1份(pH=7.4)。 PEP-PK液： 1 0 mmol/L磷酸烯醇丙酮酸400 μl， 丙酮酸激酶40 μl， 0.2 Mol/L Tris缓冲液(pH= 7.4)4 ml， 加蒸馏水至100 ml(活性液)。
取上述活性液50 ml， 置水浴中15 min即为非活性液。
发光剂： 取荧光素-荧光素酶30 mg溶于下列缓冲液中(或按需要量当天配)。 每升缓冲液 中含甘氨酰甘氨酸50 mmol、 硫酸镁10 mmol、 EDTA-Na2 1 mmol, pH=7.6。
ATP标准液： 取5×10-8 Mol/ml ATP粉剂一支溶于1 ml 20 mmol/L、 pH=7.8 Tr is-Hcl缓冲液溶解， 即成5×10-8 Mol/ml ATP原液， 然后稀释成5×10-9～ 5×10-13 Mol/ml ATP液。 上述试剂均购自上海植物生理研究所。
, 百拇医药
取稀释后各管ATP液0.2 ml分别加入3 mg/ml发光剂0.8 ml(此反应在发光光度计中进行)， 立即记录各管相对强度。 以相对发光强度Log值为纵 座标， ATP浓度为横座标制成ATP标准曲线。
仪器： FG-300型发光光度计(中科院上海植物生理研究所制造)。
1.2 方法
标本制备： 取静脉血3 ml加入0.129 Mol/L柠檬酸钠抗凝剂0.6 ml中混匀， 置水 平离心机1 000 r/min离心10 min， 上层为富血小板血浆(PRP)， 调整至血小板数(PLT )为107/μl待测。 取PRP 200 μl加入E-E液200 μl充分混匀后入冰水中10 min， 置4 ℃ 1 000 r/min离心20 min， 分离上清液待测。
检测方法： 准备二支试管(A管活性管， B管非活性管)， 取上述分离上清液各20 μl分别 注入A、 B管中， A管加未经煮沸过PEP-PK液3 ml， B管加入非活性PEP-PK液3 ml。 混匀 后室温放置10 min， 二管置80℃水浴6 min加热。 稍冷后置冰水中冷却5 min。A、 B管分 别取200 μl置二个发光比色杯中， 再置发光暗槽， 分别加发光剂0.8 ml， 立即记录 发光强度得其log值， 从ATP标准曲线中可得到相应的ATP浓度(Mol/L)。 A管为ATP+ADP 值， B管仅为ATP值。 A-B=ATP浓度(Mol/L)。
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2 结 果(见附表)
2.1 初步应用
血小板中ADP经与PEP-PK作用生成ATP与丙酮酸， ATP再与荧光素-荧光素酶作用而发光。 因而本法可同步检测ADP、 ATP。 据报道慢性骨髓增生性疾病综合征(CMPD)和多发性骨髓瘤 (MM)患者ATP释放正常， 而ADP释放障碍， ATP/ADP比值增加。 故对ATP、 ADP释放障碍的 诊断有参考价值。 本文检测ITP患者的ATP、 ADP值明显低于对照组(P<0.05)， ATP/AD P比值明显增大， 提示ITP患者有血小板质的异常(见附表)。
附表 血小板ATP、 ADP测定之结果 (
±s) 组 别
n
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活化ATP+ADP[μmol/1011(PLT)]
非活化ADP
[μmol/10 11(PLT)]
ADP
[μmol/1011(PLT)]
ATP/ADP
正常对照
10
15.39±14.37
11.80±13.38
6.55±7.69
, 百拇医药
1.8∶1
ITP
16
2.88±4.021)
3.16±4.33
1.51±1.45
2.09∶1
注： 1) x2检验， 与正常对照组比较： P<0.05
2.2 灵敏度
据报道血小板ATP总量为4.6～4.7 μmol/1011PLT， 因而要求灵敏度较高的 检测方法。 本法最低可测出5×10-13 Mol/ml ATP浓度， 且ATP含量与发光强度成正 比。
, 百拇医药
2.3 线性关系
将1×108/μl血小板悬液稀释成6个血小板密度(1×108～1×103/μl)， 分别测其发 光强度， 计算ATP含量， 血小板数与ATP含量的线性关系良好(r=0.93)。
2.4 精密度
取同一份血小板悬液分别作4次平行测定，±s为15.197±0.49， C V为3.2%。
2.5 保存时间
血小板悬液制备后， 立即(10 min内加入E-E液， 否则ATP易降解)加入E-E液， 按标本制 备法分离上清液， 一部分当日测定， 一部分入-70℃低温保存， 10天后检测， 二次检测 发光强度无显著差异(P<0.05)。
, 百拇医药
2.6 优点
一般国内检测血小板内ATP或ATP与血小板聚集同步进行均使用进口仪器， 价格昂贵。 本文 使用国产FG-300型发光光度计和荧光素-荧光素酶价格低廉， 有较好应用前景。
3 结 论
利用生物发光技术可检测红细胞内的ATP浓度， 从而推测出红细胞的寿命， 因而本试验也 为微循环的研究提供一种可靠检测手段。
本文作者简介：洪大蓉(1954～)， 女， 汉族， 副主任医师
本文1999-07-04收到, 2000-01-20接受, 百拇医药
单位：洪大蓉(南京铁道医学院附属医院， 邮政编码 南京210009)；赖启明(南京铁道医学院附属医院， 邮政编码 南京210009)
关键词：
微循环学杂志000237
本文用荧光素-荧光素酶(Luciferin-Luciferase)与ATP结合生物发光的原理， 检测血小板A TP、 ADP的释放功能， 以诊断血小板释放功能障碍性疾病。
1 资料与方法
1.1 资料
原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者16例(男3例、 女13例)， 年龄11～26岁， 均经我院血 液科诊断。 正常对照组10例(男7例、 女3例)， 年龄33～67岁， 均无心、 肝、 肾、 血 液等疾病的健康献血员。
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试剂： E-E液： 96%乙醇9份加100 mmol/L EDTA-Na 1份(pH=7.4)。 PEP-PK液： 1 0 mmol/L磷酸烯醇丙酮酸400 μl， 丙酮酸激酶40 μl， 0.2 Mol/L Tris缓冲液(pH= 7.4)4 ml， 加蒸馏水至100 ml(活性液)。
取上述活性液50 ml， 置水浴中15 min即为非活性液。
发光剂： 取荧光素-荧光素酶30 mg溶于下列缓冲液中(或按需要量当天配)。 每升缓冲液 中含甘氨酰甘氨酸50 mmol、 硫酸镁10 mmol、 EDTA-Na2 1 mmol, pH=7.6。
ATP标准液： 取5×10-8 Mol/ml ATP粉剂一支溶于1 ml 20 mmol/L、 pH=7.8 Tr is-Hcl缓冲液溶解， 即成5×10-8 Mol/ml ATP原液， 然后稀释成5×10-9～ 5×10-13 Mol/ml ATP液。 上述试剂均购自上海植物生理研究所。
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取稀释后各管ATP液0.2 ml分别加入3 mg/ml发光剂0.8 ml(此反应在发光光度计中进行)， 立即记录各管相对强度。 以相对发光强度Log值为纵 座标， ATP浓度为横座标制成ATP标准曲线。
仪器： FG-300型发光光度计(中科院上海植物生理研究所制造)。
1.2 方法
标本制备： 取静脉血3 ml加入0.129 Mol/L柠檬酸钠抗凝剂0.6 ml中混匀， 置水 平离心机1 000 r/min离心10 min， 上层为富血小板血浆(PRP)， 调整至血小板数(PLT )为107/μl待测。 取PRP 200 μl加入E-E液200 μl充分混匀后入冰水中10 min， 置4 ℃ 1 000 r/min离心20 min， 分离上清液待测。
检测方法： 准备二支试管(A管活性管， B管非活性管)， 取上述分离上清液各20 μl分别 注入A、 B管中， A管加未经煮沸过PEP-PK液3 ml， B管加入非活性PEP-PK液3 ml。 混匀 后室温放置10 min， 二管置80℃水浴6 min加热。 稍冷后置冰水中冷却5 min。A、 B管分 别取200 μl置二个发光比色杯中， 再置发光暗槽， 分别加发光剂0.8 ml， 立即记录 发光强度得其log值， 从ATP标准曲线中可得到相应的ATP浓度(Mol/L)。 A管为ATP+ADP 值， B管仅为ATP值。 A-B=ATP浓度(Mol/L)。
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2 结 果(见附表)
2.1 初步应用
血小板中ADP经与PEP-PK作用生成ATP与丙酮酸， ATP再与荧光素-荧光素酶作用而发光。 因而本法可同步检测ADP、 ATP。 据报道慢性骨髓增生性疾病综合征(CMPD)和多发性骨髓瘤 (MM)患者ATP释放正常， 而ADP释放障碍， ATP/ADP比值增加。 故对ATP、 ADP释放障碍的 诊断有参考价值。 本文检测ITP患者的ATP、 ADP值明显低于对照组(P<0.05)， ATP/AD P比值明显增大， 提示ITP患者有血小板质的异常(见附表)。
附表 血小板ATP、 ADP测定之结果 (
±s) 组 别n
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活化ATP+ADP[μmol/1011(PLT)]
非活化ADP
[μmol/10 11(PLT)]
ADP
[μmol/1011(PLT)]
ATP/ADP
正常对照
10
15.39±14.37
11.80±13.38
6.55±7.69
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1.8∶1
ITP
16
2.88±4.021)
3.16±4.33
1.51±1.45
2.09∶1
注： 1) x2检验， 与正常对照组比较： P<0.05
2.2 灵敏度
据报道血小板ATP总量为4.6～4.7 μmol/1011PLT， 因而要求灵敏度较高的 检测方法。 本法最低可测出5×10-13 Mol/ml ATP浓度， 且ATP含量与发光强度成正 比。
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2.3 线性关系
将1×108/μl血小板悬液稀释成6个血小板密度(1×108～1×103/μl)， 分别测其发 光强度， 计算ATP含量， 血小板数与ATP含量的线性关系良好(r=0.93)。
2.4 精密度
取同一份血小板悬液分别作4次平行测定，
±s为15.197±0.49， C V为3.2%。2.5 保存时间
血小板悬液制备后， 立即(10 min内加入E-E液， 否则ATP易降解)加入E-E液， 按标本制 备法分离上清液， 一部分当日测定， 一部分入-70℃低温保存， 10天后检测， 二次检测 发光强度无显著差异(P<0.05)。
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2.6 优点
一般国内检测血小板内ATP或ATP与血小板聚集同步进行均使用进口仪器， 价格昂贵。 本文 使用国产FG-300型发光光度计和荧光素-荧光素酶价格低廉， 有较好应用前景。
3 结 论
利用生物发光技术可检测红细胞内的ATP浓度， 从而推测出红细胞的寿命， 因而本试验也 为微循环的研究提供一种可靠检测手段。
本文作者简介：洪大蓉(1954～)， 女， 汉族， 副主任医师
本文1999-07-04收到, 2000-01-20接受, 百拇医药