SD大鼠血管内皮细胞损伤模型的制作方法
作者：赵建宏 林琳 高继发 曹卉 朱凡河 毛庆波
单位：赵建宏(济宁医学院中医学教研室， 邮政编码 济宁272013)；林琳(病理生理学教研室)；高继发(病理生理学教研室)曹卉(微生物学教研室)；朱凡河(病理生理学教研室)；毛庆波(病理生理学教研室)
关键词：大鼠；血管内皮；损伤；动物模型
微循环学杂志000210
目的： 建立SD大鼠血管内皮细胞损伤动物模型。方法： SD大鼠随机分为正常对照组和模型组。 模型组大鼠皮下注射稀释1.5倍的肾上腺素0.05/100 g， 连续5天。 于第4天起， 每二次给药中间时间将大鼠置于0℃冰水中5 min， 共4次。 正常对照组则皮下注射等量0.9% NS。 于第6天， 二组大鼠自颈总动脉取血， 分别测定CEC计数、 t-PA、 PAI活性、 6-Keto-PGF1α含量及血小板最大聚集率。结果： 模型组较正常对照组大鼠CEC计数、 PAI活性、 血小板最大聚集率明显升高(P<0.001～0.01)， t-PA活性、 6-Keto-PGF1α含量降低(P<0.01～0.05)。结论： 大剂量肾上腺素加冰泳刺激确能造成SD大鼠血管内皮细胞损伤。
, 百拇医药
To Establish a Model of Vascular Endothelial Cell Injury in SD Rats
Zhao Jianhong, Lin Lin, Gao Jifa
(Jining Medical College, Jining 272013)
Objective: To establish a model of the vascular endothelial cells (VEC) injury in SD rats.Method: SD rats were randomly divided into the control and the model groups. The model rats were injected adrenaline diluted 1.5 multiple 0.05 ml/100 g for 5 days contionously. From 4th day, they were irritated 5 min into 0℃ cold-water in the middle of the time injecting adrenaline every two times. the control rats were given 0.9% NS as above. After 5 days, all rats were taken blood from their carotid arteries and detected the CEC count, t-PA、 PAI activities, 6-Keto-PGF1α content and the platelet aggregation rate max (CPAgTmax) respectively.Results: In the model group, as compared with those of the control group, t-PA activity and 6-Keto-PGF1α content decreased significantly(P<0.001～0.01).Conclusion: A large dose of adrenaline in combination with cold-water irritation can cause the VEC injury in SD rats certainly.
, 百拇医药
Key words:Rats; Endothelia; Injury; Model
近年的研究表明： 血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)损伤已成为许多疾病发 生发展的基本病理过程， 而且可能是血栓性疾病发生的重要因素之一[1，2]。 多 年来， 血栓性疾病与血液流变学的关系研究较多， 但随着细胞分子生物学的飞速发展， V EC形态及内分泌功能异常与血栓性疾病关系的研究倍受重视。 因此， 从保护VEC的形态及 功能这一新的角度研究新型有效的抗血栓药物， 对于血栓性疾病的防治具有良好的发展前 景及临床使用价值。 有鉴于此， 建立一种能够筛选新药的、 简便有效的VEC损伤动物模型 ， 则是基本的保障条件。 本项实验应用大剂量肾上腺素， 同时给予冰泳刺激的方法， 复 制SD大鼠VEC损伤动物模型， 获得了成功。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1仪器、 试剂
1.1.1 仪器： GXM酶标光度计(四川分析仪器厂)、 TYXN-91A型智能血液聚 集仪(上海通用机电技术所)、 FT-646A型微机放免仪(北京核仪器厂)。
1.1.2 试剂： 盐酸肾上腺素制剂(北京制药厂提供)、 t-PA、 PAI活性试 剂盒(上海医科大学遗传学研究室提供)、 6-Keto-PGF1α放免试剂盒(北京东亚免 疫所提供)、 兔抗人ⅧR∶Ag抗血清、 羊抗兔FITC-IgG荧光抗体(上海华美生物制品公司 提供)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组： SD大鼠34只， 体重230～290 g， 雌雄不拘(由山东医 科大学实验动物中心提供)， 随机分为正常对照组和模型组各17只。
1.2.2 造模方法：
, 百拇医药
模型组： 将1 mg/ml的盐酸肾上腺素用0.9%生理盐水稀释1.5倍， 于每日的8∶0 0 am、 12∶00 am、 4∶00 pm均在皮下注射稀释后的盐酸肾上腺素0.05 ml /100 g， 连续5天， 自第4天起每二次给药中间时间将大鼠放入0℃的冰水中冰泳5 min， 共4次。
正常对照组： 于相同部位、 相同注射等量0.9%生理盐水。
1.2.3 检测指标：
于第6天晨， 将上述二组大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉(4.5 mg/100 g)， 自颈总动脉 取血分别做循环内皮细胞(CEC)计数、 血浆t-PA、 PAI活性、 6-Keto-PGF1α含 量、 血小板最大聚集率(PAgTmax)测定。
(1) CEC计数： 采用Hladovec方法[3]。 (2) 血浆t-PA、 PAI活性测定： 采用发 色底物分析法， 实验操作按试剂盒说明书。 (3) 6-Keto-PGF1α含量测定： 采用 放免法， 实验操作按试剂盒说明书。 (4) PAgTmax测定： 采用比浊法[4] 。
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1.3 统计学分析
各项数据用
±s表示， 采用t检验分析组间差异的显著性。
1.4 CEC鉴定和观察
将少许CEC混悬液置于玻片上， 干后用95%甲醇固定5 min， 流水冲洗后， 再用PBS缓冲液 漂洗3次。 干后滴加兔抗人ⅧR∶Ag抗血清(将原液1∶100稀释)， 37℃孵育30 min， 再用P BS缓冲液漂洗3次， 干后滴加羊抗兔FITC-IgG荧光抗体(将原液1∶4稀释)， 37℃再孵育30 min， 再用PBS缓冲液漂洗3次。 干后滴加缓冲甘油， 置于Olympus-BH型荧光显微镜下观 察。 本实验排除了血小板等血细胞的影响， 镜下所见的免疫荧光细胞即CEC(见附图)。
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附图 荧光显微镜下的循环内皮细胞×400
2 结 果
大剂量肾上腺素加冰泳刺激后， 大鼠血中CEC数量较正常对照组明显增多(P<0.001 )， 表明模型组大鼠VEC损伤严重， 脱落增多； 同时VEC内分泌功能也发生变化， 表现为 t-PA活性明显降低(P<0.01)， PAI活性明显升高(P<0.01)， 6-Keto-P GF1α含量降低(P<0.05)， PAgTmax显著升高(P<0.01)， 结 果见附表。
附表 正常对照组及模型组大鼠各 项检测指标之比较(n均=17，±s) 组 别
CEC计数
, http://www.100md.com (个/μl)
t-PA
(IU/ml)
PAI
(AU/ml)
6-Keto-PGF1α
(pg/ml)
PA gTmax
(%)
正 常
对照组
0.73±
, http://www.100md.com
0.16
4.49±
1.27
8.04±
2.2
115.95±
23.56
44.42±
11.45
模型组
2.36±
0.831)
, http://www.100md.com 2.11±
1.422)
17.33±
6.442)
79.41±
17.933)
68.13±
9.202)
注： 与正常对照组比较： 1) P<0.001， 2) P<0.01， 3) P<0.05
3 讨 论
, 百拇医药
VEC是衬附于血管腔内面的细胞， 它不仅具有屏障及转运功能， 而且还参与机体的凝血、 免疫、 生物活性物质的释放和血管舒缩功能的调节等生命重要过程。 广大的表面积是VEC 实现其复杂生理功能的基础， 同时也是VEC易于遭受损害的重要因素[1，5]。 现 已证实： CEC(circulating endothelial cellsf)即损伤脱落于血液循环中的VEC。 Ma rin[6]建立了从形态学上判断VEC损伤的标准， 确定VEC的缺失与脱落是VEC损伤最 重要的改变之一。 因此CEC数量的变化可以反映VEC损伤脱落的程度， 而且是活体内唯一直 接反映VEC损伤的特异性指标[7]。
目前国内外尚无成熟的VEC损伤动物模型。 我们依据有关报道： VEC是高血压损害的重要靶 器官， 急性血压升高时产生的机械性损害， 可导致VEC通透性增加， 形态和数量异常等血 管壁损伤， 血中新鲜脱落的CEC增多[8]。 据此， 我们根据肾上腺素具有强烈的 缩血管作用， 且冰泳刺激既可造成血管收缩， 又可作为一种不良刺激引起机体的应激反应 ， 使内源性性肾腺素分泌增多， 三方面的作用迭加均可使血管痉挛加重， 血管内压力升 高， 应能造成大鼠VEC损伤。
, 百拇医药
我们选用反映VEC损伤程度的指标CEC计数及VEC产生、 释放的与凝血有关的生物活性物质t -PA、 PAI、 6-Keto-PGF1α(PGI2的代谢产物)及血小板聚集功能的变化加以佐 证。 结果显示： 模型组大鼠不仅VEC损伤脱落增多， 使CEC计数明显增加， 而且VEC内分 泌功能也发生变化， 出现抗栓作用降低(t-PA活性降低、 6-Keto-PGF1α含量降 低)， 促栓作用增强(PAI活性升高)， 由于VEC形态和功能受损， 使抗栓表面变成了致栓表 面， 将使机体易于发生血栓性疾病， 因而模型组大鼠血小板最大聚集率升高。 上述二方 面的变化充分证明： 大剂量肾上腺素加冰泳刺激确能造成大鼠VEC损伤。
本实验首次应用SD大鼠活体复制VEC损伤模型， 而且具有成功率高、 简便等特点。 该模型 的研制， 为从VEC角度完善血栓性疾病的病理生理机制、 阐明临床药理学原理、 寻找新型 血管保护剂、 预防血栓形成， 开辟了新的研究途径， 具有重要的临床实用价值。
, 百拇医药
山东省教委资助课题(J96K19)
本文作者简介：赵建宏(1958～)， 男， 汉族， 副教授
参考文献
1，杨映波， 王正国. 循环内皮细胞研究进展. 生理科学进展， 1993， 24(1)：70 ～72.
2，陈云波， 王奇， 赖世隆. 从血管内皮细胞功能改变看血瘀证实质及活血化瘀机 理. 中国中医基础医学杂志， 1996， 2(1)：37～38.
3，Hladovec J, Rossman P. Circulating endothelial cells isolated together with platelet and the experimental modificatin of their counts in rats, Thromb Res, 1973, 3:665～764.
, 百拇医药
4，王鸿利， 包承鑫， 阮长耿， 等主编. 血栓与止血检验技术. 上海： 上海科学 技术出版社， 1992.24.
5，杨映波， 王正国， 朱佩芳， 等. 化学和机械损伤对血管内皮细胞的影响. 中 国病理生理杂志， 1996， 9(6)：727～29.
6，Marin ML. Immunomodulation of vascular endothelium. l. Uitrostructural changes following ultraviolett B irradiation of periheral veins. J Surg Res, 19 90, 48:134.
7，Takahashi H, Harker LA. Measurement of human endothelial cells in whol e blood. Thromb Res, 1983, 31:1～12.
8，祝之明， 杨成明， 宋克群， 等. 高血压病患者血液中血管内皮细胞的变化及 临床意义. 中华心血管杂志， 1991， 19(4)：15～19.
本文1999-11-19收到, 2000-04-24接受, 百拇医药
单位：赵建宏(济宁医学院中医学教研室， 邮政编码 济宁272013)；林琳(病理生理学教研室)；高继发(病理生理学教研室)曹卉(微生物学教研室)；朱凡河(病理生理学教研室)；毛庆波(病理生理学教研室)
关键词：大鼠；血管内皮；损伤；动物模型
微循环学杂志000210
目的： 建立SD大鼠血管内皮细胞损伤动物模型。方法： SD大鼠随机分为正常对照组和模型组。 模型组大鼠皮下注射稀释1.5倍的肾上腺素0.05/100 g， 连续5天。 于第4天起， 每二次给药中间时间将大鼠置于0℃冰水中5 min， 共4次。 正常对照组则皮下注射等量0.9% NS。 于第6天， 二组大鼠自颈总动脉取血， 分别测定CEC计数、 t-PA、 PAI活性、 6-Keto-PGF1α含量及血小板最大聚集率。结果： 模型组较正常对照组大鼠CEC计数、 PAI活性、 血小板最大聚集率明显升高(P<0.001～0.01)， t-PA活性、 6-Keto-PGF1α含量降低(P<0.01～0.05)。结论： 大剂量肾上腺素加冰泳刺激确能造成SD大鼠血管内皮细胞损伤。
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To Establish a Model of Vascular Endothelial Cell Injury in SD Rats
Zhao Jianhong, Lin Lin, Gao Jifa
(Jining Medical College, Jining 272013)
Objective: To establish a model of the vascular endothelial cells (VEC) injury in SD rats.Method: SD rats were randomly divided into the control and the model groups. The model rats were injected adrenaline diluted 1.5 multiple 0.05 ml/100 g for 5 days contionously. From 4th day, they were irritated 5 min into 0℃ cold-water in the middle of the time injecting adrenaline every two times. the control rats were given 0.9% NS as above. After 5 days, all rats were taken blood from their carotid arteries and detected the CEC count, t-PA、 PAI activities, 6-Keto-PGF1α content and the platelet aggregation rate max (CPAgTmax) respectively.Results: In the model group, as compared with those of the control group, t-PA activity and 6-Keto-PGF1α content decreased significantly(P<0.001～0.01).Conclusion: A large dose of adrenaline in combination with cold-water irritation can cause the VEC injury in SD rats certainly.
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Key words:Rats; Endothelia; Injury; Model
近年的研究表明： 血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)损伤已成为许多疾病发 生发展的基本病理过程， 而且可能是血栓性疾病发生的重要因素之一[1，2]。 多 年来， 血栓性疾病与血液流变学的关系研究较多， 但随着细胞分子生物学的飞速发展， V EC形态及内分泌功能异常与血栓性疾病关系的研究倍受重视。 因此， 从保护VEC的形态及 功能这一新的角度研究新型有效的抗血栓药物， 对于血栓性疾病的防治具有良好的发展前 景及临床使用价值。 有鉴于此， 建立一种能够筛选新药的、 简便有效的VEC损伤动物模型 ， 则是基本的保障条件。 本项实验应用大剂量肾上腺素， 同时给予冰泳刺激的方法， 复 制SD大鼠VEC损伤动物模型， 获得了成功。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1仪器、 试剂
1.1.1 仪器： GXM酶标光度计(四川分析仪器厂)、 TYXN-91A型智能血液聚 集仪(上海通用机电技术所)、 FT-646A型微机放免仪(北京核仪器厂)。
1.1.2 试剂： 盐酸肾上腺素制剂(北京制药厂提供)、 t-PA、 PAI活性试 剂盒(上海医科大学遗传学研究室提供)、 6-Keto-PGF1α放免试剂盒(北京东亚免 疫所提供)、 兔抗人ⅧR∶Ag抗血清、 羊抗兔FITC-IgG荧光抗体(上海华美生物制品公司 提供)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组： SD大鼠34只， 体重230～290 g， 雌雄不拘(由山东医 科大学实验动物中心提供)， 随机分为正常对照组和模型组各17只。
1.2.2 造模方法：
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模型组： 将1 mg/ml的盐酸肾上腺素用0.9%生理盐水稀释1.5倍， 于每日的8∶0 0 am、 12∶00 am、 4∶00 pm均在皮下注射稀释后的盐酸肾上腺素0.05 ml /100 g， 连续5天， 自第4天起每二次给药中间时间将大鼠放入0℃的冰水中冰泳5 min， 共4次。
正常对照组： 于相同部位、 相同注射等量0.9%生理盐水。
1.2.3 检测指标：
于第6天晨， 将上述二组大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉(4.5 mg/100 g)， 自颈总动脉 取血分别做循环内皮细胞(CEC)计数、 血浆t-PA、 PAI活性、 6-Keto-PGF1α含 量、 血小板最大聚集率(PAgTmax)测定。
(1) CEC计数： 采用Hladovec方法[3]。 (2) 血浆t-PA、 PAI活性测定： 采用发 色底物分析法， 实验操作按试剂盒说明书。 (3) 6-Keto-PGF1α含量测定： 采用 放免法， 实验操作按试剂盒说明书。 (4) PAgTmax测定： 采用比浊法[4] 。
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1.3 统计学分析
各项数据用
±s表示， 采用t检验分析组间差异的显著性。1.4 CEC鉴定和观察
将少许CEC混悬液置于玻片上， 干后用95%甲醇固定5 min， 流水冲洗后， 再用PBS缓冲液 漂洗3次。 干后滴加兔抗人ⅧR∶Ag抗血清(将原液1∶100稀释)， 37℃孵育30 min， 再用P BS缓冲液漂洗3次， 干后滴加羊抗兔FITC-IgG荧光抗体(将原液1∶4稀释)， 37℃再孵育30 min， 再用PBS缓冲液漂洗3次。 干后滴加缓冲甘油， 置于Olympus-BH型荧光显微镜下观 察。 本实验排除了血小板等血细胞的影响， 镜下所见的免疫荧光细胞即CEC(见附图)。
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附图 荧光显微镜下的循环内皮细胞×400
2 结 果
大剂量肾上腺素加冰泳刺激后， 大鼠血中CEC数量较正常对照组明显增多(P<0.001 )， 表明模型组大鼠VEC损伤严重， 脱落增多； 同时VEC内分泌功能也发生变化， 表现为 t-PA活性明显降低(P<0.01)， PAI活性明显升高(P<0.01)， 6-Keto-P GF1α含量降低(P<0.05)， PAgTmax显著升高(P<0.01)， 结 果见附表。
附表 正常对照组及模型组大鼠各 项检测指标之比较(n均=17，
±s) 组 别CEC计数
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t-PA
(IU/ml)
PAI
(AU/ml)
6-Keto-PGF1α
(pg/ml)
PA gTmax
(%)
正 常
对照组
0.73±
, http://www.100md.com
0.16
4.49±
1.27
8.04±
2.2
115.95±
23.56
44.42±
11.45
模型组
2.36±
0.831)
, http://www.100md.com 2.11±
1.422)
17.33±
6.442)
79.41±
17.933)
68.13±
9.202)
注： 与正常对照组比较： 1) P<0.001， 2) P<0.01， 3) P<0.05
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VEC是衬附于血管腔内面的细胞， 它不仅具有屏障及转运功能， 而且还参与机体的凝血、 免疫、 生物活性物质的释放和血管舒缩功能的调节等生命重要过程。 广大的表面积是VEC 实现其复杂生理功能的基础， 同时也是VEC易于遭受损害的重要因素[1，5]。 现 已证实： CEC(circulating endothelial cellsf)即损伤脱落于血液循环中的VEC。 Ma rin[6]建立了从形态学上判断VEC损伤的标准， 确定VEC的缺失与脱落是VEC损伤最 重要的改变之一。 因此CEC数量的变化可以反映VEC损伤脱落的程度， 而且是活体内唯一直 接反映VEC损伤的特异性指标[7]。
目前国内外尚无成熟的VEC损伤动物模型。 我们依据有关报道： VEC是高血压损害的重要靶 器官， 急性血压升高时产生的机械性损害， 可导致VEC通透性增加， 形态和数量异常等血 管壁损伤， 血中新鲜脱落的CEC增多[8]。 据此， 我们根据肾上腺素具有强烈的 缩血管作用， 且冰泳刺激既可造成血管收缩， 又可作为一种不良刺激引起机体的应激反应 ， 使内源性性肾腺素分泌增多， 三方面的作用迭加均可使血管痉挛加重， 血管内压力升 高， 应能造成大鼠VEC损伤。
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我们选用反映VEC损伤程度的指标CEC计数及VEC产生、 释放的与凝血有关的生物活性物质t -PA、 PAI、 6-Keto-PGF1α(PGI2的代谢产物)及血小板聚集功能的变化加以佐 证。 结果显示： 模型组大鼠不仅VEC损伤脱落增多， 使CEC计数明显增加， 而且VEC内分 泌功能也发生变化， 出现抗栓作用降低(t-PA活性降低、 6-Keto-PGF1α含量降 低)， 促栓作用增强(PAI活性升高)， 由于VEC形态和功能受损， 使抗栓表面变成了致栓表 面， 将使机体易于发生血栓性疾病， 因而模型组大鼠血小板最大聚集率升高。 上述二方 面的变化充分证明： 大剂量肾上腺素加冰泳刺激确能造成大鼠VEC损伤。
本实验首次应用SD大鼠活体复制VEC损伤模型， 而且具有成功率高、 简便等特点。 该模型 的研制， 为从VEC角度完善血栓性疾病的病理生理机制、 阐明临床药理学原理、 寻找新型 血管保护剂、 预防血栓形成， 开辟了新的研究途径， 具有重要的临床实用价值。
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山东省教委资助课题(J96K19)
本文作者简介：赵建宏(1958～)， 男， 汉族， 副教授
参考文献
1，杨映波， 王正国. 循环内皮细胞研究进展. 生理科学进展， 1993， 24(1)：70 ～72.
2，陈云波， 王奇， 赖世隆. 从血管内皮细胞功能改变看血瘀证实质及活血化瘀机 理. 中国中医基础医学杂志， 1996， 2(1)：37～38.
3，Hladovec J, Rossman P. Circulating endothelial cells isolated together with platelet and the experimental modificatin of their counts in rats, Thromb Res, 1973, 3:665～764.
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4，王鸿利， 包承鑫， 阮长耿， 等主编. 血栓与止血检验技术. 上海： 上海科学 技术出版社， 1992.24.
5，杨映波， 王正国， 朱佩芳， 等. 化学和机械损伤对血管内皮细胞的影响. 中 国病理生理杂志， 1996， 9(6)：727～29.
6，Marin ML. Immunomodulation of vascular endothelium. l. Uitrostructural changes following ultraviolett B irradiation of periheral veins. J Surg Res, 19 90, 48:134.
7，Takahashi H, Harker LA. Measurement of human endothelial cells in whol e blood. Thromb Res, 1983, 31:1～12.
8，祝之明， 杨成明， 宋克群， 等. 高血压病患者血液中血管内皮细胞的变化及 临床意义. 中华心血管杂志， 1991， 19(4)：15～19.
本文1999-11-19收到, 2000-04-24接受, 百拇医药