耐热保健饮料对机体热应激蛋白诱导合成影响的研究
作者：何骁生 邬堂春 陈胜 王瑞波 贺涵贞 张国高
单位：
关键词：耐热饮料；热应激蛋白；热耐受性
中华劳动卫生职业病杂志980209 【摘要】 目的 进一步研究热应激蛋白(HSPs)的诱导合成情况。 方法 从动物实验、人体模拟实验和现场劳动卫生学三方面，研究了耐热保健饮料对小鼠HSPs的表达、蓄积和定位分布及模拟实验人体、高温作业人群淋巴细胞HSPs的水平。 结果 饮料组与对照组相比，小鼠HSP27、HSP70的合成量增加，且在不同时相蓄积量多于对照组，耐力试验平均衰竭时间延长，减少了体内血乳酸的蓄积；模拟高温作业受试者和现场高温作业工人HSPs水平均高于对照组。 结论 此耐热保健饮料能诱导体内HSPs的合成，减轻疲劳，提高机体的免疫功能，使机体能更好地获得热耐受性。
A study of the effect of health care drink for thermotolerance on the induction of HSPs synthesis in vivo He Xiaosheng,Wu Tangchun,Chen Sheng,et al.Institute of Occupational Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030
, 百拇医药
Abstract In order to have further study on the induction of heat stress proteins(HSPs) synthesis,the effects of the drink for health care and thermotolerence on the expression,accumulation,localization and distribution of HSP27 and HSP70 in mice,and the level of HSP27,HSP70 in lymphocyte of subjects or workers exposed to high temperature were investigated.In animal experiments,the results showed that,compared with control,the level of HSPs increased,the average exhaustive time prolonged,and the concentration of lactic acid in blood decreased.In artificial hot chamber and field study,the level of HSPs in the lymphocyte of the subjects or workers in drink group was higher than that of the control.It is suggested that this type of drink could induce the synthysis of HSPs in vivo,play an important role in protecting the organism from heat injury,and improve the resistance of the body to high temperature.
, 百拇医药
Key words The healthy drink for heat resistance Heat shock protein(HSPs) Heat resistance
近年来研究表明：各种生物在热应激等条件下可诱导合成一组特异的蛋白质——热应激蛋白(heat stress proteins,HSPs)，它们对于生物体耐热性的形成、免疫功能的发挥均具有重要的作用。本课题从动物实验、人体模拟试验和现场劳动卫生学调查三方面对本耐热保健饮料对机体耐热性及免疫功能的效应进行了研究。
材料与方法
1.耐热保健饮料：本饮料中除了能补充人体所必需的无机盐、维生素外，还含有一些必需氨基酸及药膳同源的中草药。
2.饮料对热应激小鼠HSP70水平、肝脏HSP70、HSP27定位及分布的影响：昆明种雄性健康小鼠40只，体重32.2±4.3 g，随机分为对照组(0.15%生理盐水)和饮料组(按人体需要剂量折算，每天灌胃0.025 ml/g体重)。于人工气候室内受热(气温39.0±0.5℃，相对湿度40%，单向热辐射强度2.1 J*cm-2*min-1)2小时，连续观察7天，第8天后进行下列两项实验。(1)恢复动力学试验：每组随机各取8只小鼠置致死性温度受热1小时，前后测肛温变化，分别于2、4、8、16小时处死小鼠，取血和肝脏，测定血乳酸含量，肝脏每组2只合并匀浆测定HSP70的水平。(2)游泳试验：将剩余小鼠每组12只置清水槽进行游泳试验，记录每只小鼠衰竭时间，并立即处死，取血和肝脏，测定血乳酸、HSPs水平；取肝脏用免疫组织化学方法，观察小鼠肝脏HSP27、HSP70的蓄积和分布。
, 百拇医药
3.饮料对模拟高温作业者HSPs合成的影响：对6名健康男性采用自身对照的方法，在人工气候室内受热(气温39.0±0.5℃，相对湿度40%，单向热辐射强度2.1 J*cm-2*min-1)，每天2小时，从事中等强度活动10分钟，休息20分钟后重复进行，先饮0.15%盐水1 400 ml，作为对照组，为期1周，为避免热适应，休息1周脱热适应后再饮饮料1 400 ml作为饮料组，为期1周。测定血HSP70、HSP27的含量。
4.饮料对炼焦工、采煤工人HSPs合成的影响：将50名炼焦工人及劳动强度、作业面环境状况相近的采煤工人30名，年龄20～46岁，工龄3～22年，随机分为饮料组(给予保健饮料)和对照组(给予安慰饮料)，两组之间环境条件差异无显著性，且均属于高温作业。每天饮1 400 ml，于受试前1天和观察第6天后，分别取外周血淋巴细胞检测HSP70、HSP27的含量。
5.血乳酸的测定：对羟基联苯法[1]。
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6.小鼠肝匀浆HSP70、淋巴细胞HSP27、HSP60、HSP70的检测：Dot blot法[2]。取10 μl组织匀浆或淋巴细胞裂解液，用微量Lowry法测定蛋白质含量，将蛋白质的浓度调一致。按每样品20 μg总蛋白点膜(已处理好的NC膜)，经脱脂奶粉封闭后用含0.05% Tween20的PBS(pH 7.0)反复漂洗，用兔抗人HSPs抗体的封闭液浸泡，经再次漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的IgG(加拿大产，稀释度为1∶10 000，稀释液为封闭液)，37℃保温振荡，反复漂洗后用DBA、CoCl2、H2O2配成的显色液显色、照相，用图像分析仪(日本产岛津双波段色分析仪CS-930)，波长460 nm进行扫描检测。
7.热应激小鼠肝脏HSP27、HSP70的组织化学研究[3]：主要试剂有兔抗人HSP27、HSP70抗体(由加拿大拉瓦尔大学发育与分子遗传学研究所与本实验室共同研制)，使用的每种一抗均首先作预备试验，测定其最适反应浓度。染色方法均为SABC法。即用型SABC试剂盒为博士德公司产品。SABC法与传统的ABC.PAP法比较，具有染色时间短、特异性强、背景更清晰、节省抗体、成本低等优点。染色步骤、观察标准和结果判定：“-”为没有着色细胞；“±”为可见浅褐色，但×400放大5个视野内见不到颗粒；“+”为1个/5×400视野可见到稀疏颗粒；“++”为2～4个以上视野可见到颗粒；“+++”为每个视野均可见到弥漫性颗粒。为更客观评价染色结果，均用富士彩色翻转片拍成幻灯片，两人共同评价。“±”亦视为阴性，“+、++、+++”均为阳性。
, 百拇医药
统计方法：采用t检验。
结 果
1.气象条件：(1)两组作业地点干球温度、湿球温度、相对湿度、风速(表1、表2)均属高温作业，且两组气象条件比较差异无显著性。
表1 炼焦工作业地点环境条件
Table 1 The work place environmental condition of coking furnace workers 组别Group
干球温度
Td
(℃)
湿球温度
, 百拇医药
Tw
(℃)
相对湿度
Rh
(%)
黑球温度
Tg
(℃)
风速
V
(m/s)
饮料组
Drink
, 百拇医药
40.32±3.03
30.47±4.35
54.91±9.96
60.52±6.53
1.03±0.38
对照组
Control
40.78±5.74
29.84±3.64
51.56±9.44
59.76±6.72
0.93±0.37
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Td:Dry ball temperature;Tw:Wet ball temperature;Rh:Relative humidity；Tg:Globe temperature；V:Wind velocity
表2 采煤工作业地点环境条件
Table 2 The work place environmental condition of
koal mining workers 组别
Group
干球温度
Td
(℃)
湿球温度
, 百拇医药
Tw
(℃)
相对湿度
Rh
(%)
风速
V
(m/s)
饮料组
Drink
31.2±1.13
30.3±0.99
95.5±2.12
, http://www.100md.com
0.50～0.90
对照组
Control
31.1±0.81
29.5±1.50
90.8±3.30
0.13～0.73
Td:Dry ball temperature;Tw:Wet ball temperature;Rh:Relative humidity；Tg:Globe temperature；V:Wind velocity
2.恢复动力学试验：两组间血乳酸、HSP70的恢复情况，见图1、图2。
, 百拇医药
A.S:积分光密度
A.S:The integral optical density
图1 小鼠肝脏HSP70恢复情况
Fig 1 The recovery of HSP70 in mice liver
图2 小鼠血乳酸恢复情况
Fig 2 The recovery of lactic acid in mice blood
3.游泳实验中小鼠游泳半数衰竭时间、平均衰竭时间的比较：由表3可见饮料组均较对照组游泳时间延长。
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表3 小鼠游泳半数衰竭时间、平均衰竭时间(±s)
Table 3 Half exhaustion and average exhaustion time
of mice during swimming(±s)
组别
Group
动物(只)
Animals(No.)
半数衰竭时间
Half exhaustive
time(min)
, 百拇医药
平均衰竭时间
Average exhaustive
time(min)
饮料组
Drink
12
5.83
6.73±1.92
对照组
Control
12
7.83*
, 百拇医药
8.00±3.88
与对照组比较，* P<0.05
* P<0.05 compared with the control group
4.饮料对热应激小鼠肝组织HSP70、HSP27定位及分布的影响：研究发现,饮料组HSP27在2、4小时胞浆染色呈弱阳性(±)，8、16小时呈阳性(+)，阳性率分别为20%、40%；对照组4 小时时呈阳性(+)，主要位于核内。饮料组HSP70在2小时呈弱阳性(±)，位于胞浆中，4 小时时HSP70在肝细胞中呈阴性(-)，8小时HSP70呈核内强阳性(++)，阳性率为60%(3/5)，而胞浆HSP70呈弱阳性(±)，16 小时HSP70大量散在分布核内，为20%、40%；对照组4小时呈阳性(+)，主要位于核内。
饮料组HSP70在2小时呈弱阳性(±)分布于胞浆中，4小时HSP70在肝细胞中呈阴性分布(-)，8小时HSP70呈核内强阳性(++)分布，阳性率为60%(3/5)，而胞浆HSP70呈弱阳性(±)，16小时HSP70大量散在分布核内，其阳性强度为(+++)，胞浆阳性强度为(+)；对照组2、4、8小时主要定位于胞浆。
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5.不同实验期间HSPs水平的比较：(1)游泳试验肝匀浆HSP70(积分光密度)对照组358.9±320.6、饮料组415.5±124.3。(2)高温作业者外周血淋巴细胞HSP70、HSP27的水平见表4。(3)用HSP70、HSP27单抗检测两组工人淋巴细胞HSP70、HSP27的水平。饮料组HSP70、HSP27的合成量增加且与对照组相比，差异有显著性(P<0.05)，见表5。(4)采煤工人中饮料组和对照组外周血淋巴细胞HSP70班后较班前均有所增加，但差异无显著性。
表4 焦炉工人淋巴细胞HSP70、HSP27的水平
Table 4 The level of HSP70,HSP27 expression
in coking workers lymphocytes
组别
, 百拇医药
Group
HSP70
(A.S)
HSP27
(A.S)
饮料组
Drink
6253.7±3397.2*
114.2±406.14*
对照组
Control
4472.5±2972.5
, 百拇医药
872.2±1014.2
与对照组比较，* P<0.05；A.S：积分光密度
* P<0.05 compared with the control group；A.S:The integral optical density
讨 论
人们在热环境下工作或生活一段时间后，产生对高温的适应能力即热适应，又称热习服。其生理功能主要表现在体温调节、出汗功能、水盐代谢、心血管系统和神经内分泌等的改变[4]。
表5 受试者淋巴细胞HSPs的变化
Table 5 Changes of HSP70,HSP27 in the lymphocytes of subjects 组别Group
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试验前
Preexperiment
试验后
After experiment
HSP70(A.S)
HSP27(A.S)
HSP70(A.S)
HSP27(A.S)
饮料组
Drink
15293.7±3462.3
3982.3±545.4
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24442.5±2791.5
4706.9±867.2
对照组
Control
15450.0±699.3
4682.5±1665.6
A.S：积分光密度 A.S:The integral optical density
乳酸是糖酵解的产物，与疲劳出现有关[5]。从不同恢复时间血乳酸水平的趋势(图2)可看出，饮料组较对照组的升高值有不同程度的降低，说明该饮料具有一定的缓解疲劳的作用。
应激蛋白的合成增加被认为是一种自身保护性的反应。细胞内HSP70合成增加，在蛋白质的折叠、聚集，器官的生物合成及细胞的调控方面起作用[6，7]，同时可清除细胞内所形成的异常变性的蛋白，以保护细胞对抗有害因素。HSP70是人体内主要的应激蛋白之一，当人体在高温以及各种有害因素(如缺氧、缺血、致癌物等)作用下，HSP70合成明显增加，以提高机体的耐热和抗毒能力，其广泛的生理和病理作用已成为当今生命科学的研究热点[8]。关于HSP27及其它小分子的HSP在热耐受上亦有着十分重要的意义[9]，应用免疫细胞化学技术对其亚细胞定位进行了研究，认为HSP27的细胞内定位决定于应激反应的类型及强度。例如热应激后的蛋白质主要定位于核内，而没有应激的细胞主要在核周，而且靠近高尔基体。
, 百拇医药
由图2可以看出：不同恢复时间上，饮料组HSP70较对照组的升高值有不同程度的降低，饮料组在恢复2、4、8小时3个时间HSP70水平显著高于对照组。游泳试验饮料组与对照组相比，小鼠2小时死亡率降低15.5%，平均衰竭时间延长14.4分钟，HSP70，HSP27含量升高。免疫组化方法发现：HSP70主要位于胞浆，热应激后核内HSP70明显增加，在恢复期间尽管HSP70不断积累，但在胞浆中HSP70增加明显。当再次热应激时，又见核内HSP70明显增加，且出现两个特征，一是严格的热依赖性，二是十分迅速，HSP70的重新分布对热耐受的产生起到了极重要的作用。可以看出：此耐热保健饮料促进了HSP70、HSP27合成，使其合成量增加，并使其蓄积、分布的时间延长，提高了细胞的保护功能。
目前，关于HSPs功能的了解仍不够深入，但是HSPs的细胞保护功能已基本被确认，尤其是关于HSPs对热耐受关系的研究。
本研究发现：人体模拟试验和现场劳动卫生学调查中，饮料组热休克蛋白与对照组比较，虽差异无显著性，但较对照组为高，采煤工HSP60对照组与饮料组比较增加不明显，但是HSP70班后较班前及两组之间比较都有一定的增加，且有显著性意义。免疫组织化学的结果可以看出:此耐热保健饮料促进了HSPs的合成，使其合成量增加，并使其蓄积、分布的时间延长，提高了细胞的保护功能。许多研究表明，与热耐受形成，保护细胞免遭热损伤的主要为HSP70。由此表明：饮用该饮料后使机体HSP70增加，提高了耐热能力。
, 百拇医药
总之，无论从恢复动力学还是从耐力实验均初步可以得出这样的结论:此耐热保健饮料能诱导体内HSPs的合成，提高机体的免疫功能和热耐受性，减轻疲劳，为高温作业工人推出了一种具有耐热生物效应的保健饮料，对于生活或工作在高温环境中的人们有着广泛的实用价值。
参 考 文 献
1 张国高主编.高温生理与卫生.上海：上海科学技术出版社，1989.130～147.
2 George M,William J.Clinical Implication of the Stress Response.J Clin Invest,1995,95:3～8.
3 杨奎生，王世平.用0.02毫升全血测定血乳酸和血糖的超微量方法.中国运动医学杂志，1983，2(2)：40～42.
, http://www.100md.com 4 何骁生，潘秋萍，邬堂春,等.用Western斑点印迹法检测主要热应激蛋白.中华劳动卫生职业病杂志，1996，14：376～378.
5 倪灿荣主编，免疫组化实验新技术及应用.北京:北京科学技术出版社，1993.2563～2565.
6 贺涵贞，张裕曾，张伟,等.高温作业工人血乳酸的变化.同济医大学报，1988，1：73～75.
7 Gloria C,Johnson Y.Induction of heat shock protein synthesis in murine tumors during the development of thermotolerance.Cancer Research,1985,45:3816～3824.
8 Linquist S,Craig EA.The heat shock proteins.Annu Rev Genet,1988,22:631～637.
9 Lee Y,Hou Z,Curtty L,et al.Expression,synthesis and phosphorylation of HSP28 family during development and decay of thermotolerance in CHO plateu-phase cells.J Cell Physiol,1992,150:441～446.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药
单位：
关键词：耐热饮料；热应激蛋白；热耐受性
中华劳动卫生职业病杂志980209 【摘要】 目的 进一步研究热应激蛋白(HSPs)的诱导合成情况。 方法 从动物实验、人体模拟实验和现场劳动卫生学三方面，研究了耐热保健饮料对小鼠HSPs的表达、蓄积和定位分布及模拟实验人体、高温作业人群淋巴细胞HSPs的水平。 结果 饮料组与对照组相比，小鼠HSP27、HSP70的合成量增加，且在不同时相蓄积量多于对照组，耐力试验平均衰竭时间延长，减少了体内血乳酸的蓄积；模拟高温作业受试者和现场高温作业工人HSPs水平均高于对照组。 结论 此耐热保健饮料能诱导体内HSPs的合成，减轻疲劳，提高机体的免疫功能，使机体能更好地获得热耐受性。
A study of the effect of health care drink for thermotolerance on the induction of HSPs synthesis in vivo He Xiaosheng,Wu Tangchun,Chen Sheng,et al.Institute of Occupational Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030
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Abstract In order to have further study on the induction of heat stress proteins(HSPs) synthesis,the effects of the drink for health care and thermotolerence on the expression,accumulation,localization and distribution of HSP27 and HSP70 in mice,and the level of HSP27,HSP70 in lymphocyte of subjects or workers exposed to high temperature were investigated.In animal experiments,the results showed that,compared with control,the level of HSPs increased,the average exhaustive time prolonged,and the concentration of lactic acid in blood decreased.In artificial hot chamber and field study,the level of HSPs in the lymphocyte of the subjects or workers in drink group was higher than that of the control.It is suggested that this type of drink could induce the synthysis of HSPs in vivo,play an important role in protecting the organism from heat injury,and improve the resistance of the body to high temperature.
, 百拇医药
Key words The healthy drink for heat resistance Heat shock protein(HSPs) Heat resistance
近年来研究表明：各种生物在热应激等条件下可诱导合成一组特异的蛋白质——热应激蛋白(heat stress proteins,HSPs)，它们对于生物体耐热性的形成、免疫功能的发挥均具有重要的作用。本课题从动物实验、人体模拟试验和现场劳动卫生学调查三方面对本耐热保健饮料对机体耐热性及免疫功能的效应进行了研究。
材料与方法
1.耐热保健饮料：本饮料中除了能补充人体所必需的无机盐、维生素外，还含有一些必需氨基酸及药膳同源的中草药。
2.饮料对热应激小鼠HSP70水平、肝脏HSP70、HSP27定位及分布的影响：昆明种雄性健康小鼠40只，体重32.2±4.3 g，随机分为对照组(0.15%生理盐水)和饮料组(按人体需要剂量折算，每天灌胃0.025 ml/g体重)。于人工气候室内受热(气温39.0±0.5℃，相对湿度40%，单向热辐射强度2.1 J*cm-2*min-1)2小时，连续观察7天，第8天后进行下列两项实验。(1)恢复动力学试验：每组随机各取8只小鼠置致死性温度受热1小时，前后测肛温变化，分别于2、4、8、16小时处死小鼠，取血和肝脏，测定血乳酸含量，肝脏每组2只合并匀浆测定HSP70的水平。(2)游泳试验：将剩余小鼠每组12只置清水槽进行游泳试验，记录每只小鼠衰竭时间，并立即处死，取血和肝脏，测定血乳酸、HSPs水平；取肝脏用免疫组织化学方法，观察小鼠肝脏HSP27、HSP70的蓄积和分布。
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3.饮料对模拟高温作业者HSPs合成的影响：对6名健康男性采用自身对照的方法，在人工气候室内受热(气温39.0±0.5℃，相对湿度40%，单向热辐射强度2.1 J*cm-2*min-1)，每天2小时，从事中等强度活动10分钟，休息20分钟后重复进行，先饮0.15%盐水1 400 ml，作为对照组，为期1周，为避免热适应，休息1周脱热适应后再饮饮料1 400 ml作为饮料组，为期1周。测定血HSP70、HSP27的含量。
4.饮料对炼焦工、采煤工人HSPs合成的影响：将50名炼焦工人及劳动强度、作业面环境状况相近的采煤工人30名，年龄20～46岁，工龄3～22年，随机分为饮料组(给予保健饮料)和对照组(给予安慰饮料)，两组之间环境条件差异无显著性，且均属于高温作业。每天饮1 400 ml，于受试前1天和观察第6天后，分别取外周血淋巴细胞检测HSP70、HSP27的含量。
5.血乳酸的测定：对羟基联苯法[1]。
, 百拇医药
6.小鼠肝匀浆HSP70、淋巴细胞HSP27、HSP60、HSP70的检测：Dot blot法[2]。取10 μl组织匀浆或淋巴细胞裂解液，用微量Lowry法测定蛋白质含量，将蛋白质的浓度调一致。按每样品20 μg总蛋白点膜(已处理好的NC膜)，经脱脂奶粉封闭后用含0.05% Tween20的PBS(pH 7.0)反复漂洗，用兔抗人HSPs抗体的封闭液浸泡，经再次漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的IgG(加拿大产，稀释度为1∶10 000，稀释液为封闭液)，37℃保温振荡，反复漂洗后用DBA、CoCl2、H2O2配成的显色液显色、照相，用图像分析仪(日本产岛津双波段色分析仪CS-930)，波长460 nm进行扫描检测。
7.热应激小鼠肝脏HSP27、HSP70的组织化学研究[3]：主要试剂有兔抗人HSP27、HSP70抗体(由加拿大拉瓦尔大学发育与分子遗传学研究所与本实验室共同研制)，使用的每种一抗均首先作预备试验，测定其最适反应浓度。染色方法均为SABC法。即用型SABC试剂盒为博士德公司产品。SABC法与传统的ABC.PAP法比较，具有染色时间短、特异性强、背景更清晰、节省抗体、成本低等优点。染色步骤、观察标准和结果判定：“-”为没有着色细胞；“±”为可见浅褐色，但×400放大5个视野内见不到颗粒；“+”为1个/5×400视野可见到稀疏颗粒；“++”为2～4个以上视野可见到颗粒；“+++”为每个视野均可见到弥漫性颗粒。为更客观评价染色结果，均用富士彩色翻转片拍成幻灯片，两人共同评价。“±”亦视为阴性，“+、++、+++”均为阳性。
, 百拇医药
统计方法：采用t检验。
结 果
1.气象条件：(1)两组作业地点干球温度、湿球温度、相对湿度、风速(表1、表2)均属高温作业，且两组气象条件比较差异无显著性。
表1 炼焦工作业地点环境条件
Table 1 The work place environmental condition of coking furnace workers 组别Group
干球温度
Td
(℃)
湿球温度
, 百拇医药
Tw
(℃)
相对湿度
Rh
(%)
黑球温度
Tg
(℃)
风速
V
(m/s)
饮料组
Drink
, 百拇医药
40.32±3.03
30.47±4.35
54.91±9.96
60.52±6.53
1.03±0.38
对照组
Control
40.78±5.74
29.84±3.64
51.56±9.44
59.76±6.72
0.93±0.37
, http://www.100md.com
Td:Dry ball temperature;Tw:Wet ball temperature;Rh:Relative humidity；Tg:Globe temperature；V:Wind velocity
表2 采煤工作业地点环境条件
Table 2 The work place environmental condition of
koal mining workers 组别
Group
干球温度
Td
(℃)
湿球温度
, 百拇医药
Tw
(℃)
相对湿度
Rh
(%)
风速
V
(m/s)
饮料组
Drink
31.2±1.13
30.3±0.99
95.5±2.12
, http://www.100md.com
0.50～0.90
对照组
Control
31.1±0.81
29.5±1.50
90.8±3.30
0.13～0.73
Td:Dry ball temperature;Tw:Wet ball temperature;Rh:Relative humidity；Tg:Globe temperature；V:Wind velocity
2.恢复动力学试验：两组间血乳酸、HSP70的恢复情况，见图1、图2。
, 百拇医药
A.S:积分光密度
A.S:The integral optical density
图1 小鼠肝脏HSP70恢复情况
Fig 1 The recovery of HSP70 in mice liver
图2 小鼠血乳酸恢复情况
Fig 2 The recovery of lactic acid in mice blood
3.游泳实验中小鼠游泳半数衰竭时间、平均衰竭时间的比较：由表3可见饮料组均较对照组游泳时间延长。
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表3 小鼠游泳半数衰竭时间、平均衰竭时间(±s)
Table 3 Half exhaustion and average exhaustion time
of mice during swimming(±s)
组别
Group
动物(只)
Animals(No.)
半数衰竭时间
Half exhaustive
time(min)
, 百拇医药
平均衰竭时间
Average exhaustive
time(min)
饮料组
Drink
12
5.83
6.73±1.92
对照组
Control
12
7.83*
, 百拇医药
8.00±3.88
与对照组比较，* P<0.05
* P<0.05 compared with the control group
4.饮料对热应激小鼠肝组织HSP70、HSP27定位及分布的影响：研究发现,饮料组HSP27在2、4小时胞浆染色呈弱阳性(±)，8、16小时呈阳性(+)，阳性率分别为20%、40%；对照组4 小时时呈阳性(+)，主要位于核内。饮料组HSP70在2小时呈弱阳性(±)，位于胞浆中，4 小时时HSP70在肝细胞中呈阴性(-)，8小时HSP70呈核内强阳性(++)，阳性率为60%(3/5)，而胞浆HSP70呈弱阳性(±)，16 小时HSP70大量散在分布核内，为20%、40%；对照组4小时呈阳性(+)，主要位于核内。
饮料组HSP70在2小时呈弱阳性(±)分布于胞浆中，4小时HSP70在肝细胞中呈阴性分布(-)，8小时HSP70呈核内强阳性(++)分布，阳性率为60%(3/5)，而胞浆HSP70呈弱阳性(±)，16小时HSP70大量散在分布核内，其阳性强度为(+++)，胞浆阳性强度为(+)；对照组2、4、8小时主要定位于胞浆。
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5.不同实验期间HSPs水平的比较：(1)游泳试验肝匀浆HSP70(积分光密度)对照组358.9±320.6、饮料组415.5±124.3。(2)高温作业者外周血淋巴细胞HSP70、HSP27的水平见表4。(3)用HSP70、HSP27单抗检测两组工人淋巴细胞HSP70、HSP27的水平。饮料组HSP70、HSP27的合成量增加且与对照组相比，差异有显著性(P<0.05)，见表5。(4)采煤工人中饮料组和对照组外周血淋巴细胞HSP70班后较班前均有所增加，但差异无显著性。
表4 焦炉工人淋巴细胞HSP70、HSP27的水平
Table 4 The level of HSP70,HSP27 expression
in coking workers lymphocytes
组别
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Group
HSP70
(A.S)
HSP27
(A.S)
饮料组
Drink
6253.7±3397.2*
114.2±406.14*
对照组
Control
4472.5±2972.5
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872.2±1014.2
与对照组比较，* P<0.05；A.S：积分光密度
* P<0.05 compared with the control group；A.S:The integral optical density
讨 论
人们在热环境下工作或生活一段时间后，产生对高温的适应能力即热适应，又称热习服。其生理功能主要表现在体温调节、出汗功能、水盐代谢、心血管系统和神经内分泌等的改变[4]。
表5 受试者淋巴细胞HSPs的变化
Table 5 Changes of HSP70,HSP27 in the lymphocytes of subjects 组别Group
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试验前
Preexperiment
试验后
After experiment
HSP70(A.S)
HSP27(A.S)
HSP70(A.S)
HSP27(A.S)
饮料组
Drink
15293.7±3462.3
3982.3±545.4
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24442.5±2791.5
4706.9±867.2
对照组
Control
15450.0±699.3
4682.5±1665.6
A.S：积分光密度 A.S:The integral optical density
乳酸是糖酵解的产物，与疲劳出现有关[5]。从不同恢复时间血乳酸水平的趋势(图2)可看出，饮料组较对照组的升高值有不同程度的降低，说明该饮料具有一定的缓解疲劳的作用。
应激蛋白的合成增加被认为是一种自身保护性的反应。细胞内HSP70合成增加，在蛋白质的折叠、聚集，器官的生物合成及细胞的调控方面起作用[6，7]，同时可清除细胞内所形成的异常变性的蛋白，以保护细胞对抗有害因素。HSP70是人体内主要的应激蛋白之一，当人体在高温以及各种有害因素(如缺氧、缺血、致癌物等)作用下，HSP70合成明显增加，以提高机体的耐热和抗毒能力，其广泛的生理和病理作用已成为当今生命科学的研究热点[8]。关于HSP27及其它小分子的HSP在热耐受上亦有着十分重要的意义[9]，应用免疫细胞化学技术对其亚细胞定位进行了研究，认为HSP27的细胞内定位决定于应激反应的类型及强度。例如热应激后的蛋白质主要定位于核内，而没有应激的细胞主要在核周，而且靠近高尔基体。
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由图2可以看出：不同恢复时间上，饮料组HSP70较对照组的升高值有不同程度的降低，饮料组在恢复2、4、8小时3个时间HSP70水平显著高于对照组。游泳试验饮料组与对照组相比，小鼠2小时死亡率降低15.5%，平均衰竭时间延长14.4分钟，HSP70，HSP27含量升高。免疫组化方法发现：HSP70主要位于胞浆，热应激后核内HSP70明显增加，在恢复期间尽管HSP70不断积累，但在胞浆中HSP70增加明显。当再次热应激时，又见核内HSP70明显增加，且出现两个特征，一是严格的热依赖性，二是十分迅速，HSP70的重新分布对热耐受的产生起到了极重要的作用。可以看出：此耐热保健饮料促进了HSP70、HSP27合成，使其合成量增加，并使其蓄积、分布的时间延长，提高了细胞的保护功能。
目前，关于HSPs功能的了解仍不够深入，但是HSPs的细胞保护功能已基本被确认，尤其是关于HSPs对热耐受关系的研究。
本研究发现：人体模拟试验和现场劳动卫生学调查中，饮料组热休克蛋白与对照组比较，虽差异无显著性，但较对照组为高，采煤工HSP60对照组与饮料组比较增加不明显，但是HSP70班后较班前及两组之间比较都有一定的增加，且有显著性意义。免疫组织化学的结果可以看出:此耐热保健饮料促进了HSPs的合成，使其合成量增加，并使其蓄积、分布的时间延长，提高了细胞的保护功能。许多研究表明，与热耐受形成，保护细胞免遭热损伤的主要为HSP70。由此表明：饮用该饮料后使机体HSP70增加，提高了耐热能力。
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总之，无论从恢复动力学还是从耐力实验均初步可以得出这样的结论:此耐热保健饮料能诱导体内HSPs的合成，提高机体的免疫功能和热耐受性，减轻疲劳，为高温作业工人推出了一种具有耐热生物效应的保健饮料，对于生活或工作在高温环境中的人们有着广泛的实用价值。
参 考 文 献
1 张国高主编.高温生理与卫生.上海：上海科学技术出版社，1989.130～147.
2 George M,William J.Clinical Implication of the Stress Response.J Clin Invest,1995,95:3～8.
3 杨奎生，王世平.用0.02毫升全血测定血乳酸和血糖的超微量方法.中国运动医学杂志，1983，2(2)：40～42.
, http://www.100md.com 4 何骁生，潘秋萍，邬堂春,等.用Western斑点印迹法检测主要热应激蛋白.中华劳动卫生职业病杂志，1996，14：376～378.
5 倪灿荣主编，免疫组化实验新技术及应用.北京:北京科学技术出版社，1993.2563～2565.
6 贺涵贞，张裕曾，张伟,等.高温作业工人血乳酸的变化.同济医大学报，1988，1：73～75.
7 Gloria C,Johnson Y.Induction of heat shock protein synthesis in murine tumors during the development of thermotolerance.Cancer Research,1985,45:3816～3824.
8 Linquist S,Craig EA.The heat shock proteins.Annu Rev Genet,1988,22:631～637.
9 Lee Y,Hou Z,Curtty L,et al.Expression,synthesis and phosphorylation of HSP28 family during development and decay of thermotolerance in CHO plateu-phase cells.J Cell Physiol,1992,150:441～446.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药