转染细胞所表达的热应激蛋白23的特性变化分析
作者：邬堂春 张永幸 陈胜 贺涵贞 Robert M.Tanguay 张国高
单位：
关键词：热应激；果蝇HSP23；大分子复合物；蔗糖密度梯度
中华劳动卫生职业病杂志980205 【摘要】 目的 了解热应激蛋白23(HSP23)的特性和热应激后它与其它蛋白质间的可能相互作用。方法 采用基因转染、蔗糖密度梯度离心和免疫印迹等技术和方法，分析果蝇细胞和转染果蝇HSP23基因的猴子细胞在不同热应激条件下所表达的HSP23的变化。结果 转染果蝇HSP23基因后，猴子细胞所表达的蛋白质与热应激、热应激恢复期的果蝇细胞所表达的HSP23相比，在密度梯度离心中所显示的特性和可能的蛋白质间相互作用是相似的；与热应激期间HSP23相比，在恢复期间，果蝇细胞和转染后的猴子细胞HSP23的沉降增快。结论 用转染细胞研究HSP23功能的可行性和热应激后HSP23与胞内其它蛋白质形成大分子复合物的可能性。
, 百拇医药
The analysis on the property changes of HSP23 expressed by CV-l cells after transfection with Drosophila HSP23 gene Wu Tangchun,Zhang Yongxing,Chen Sheng,et al.Institute of Occupational Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030
Abstract In order to understand the property of HSP23 expressed by monkey CV-l cells after transfection with Drosophila HSP23 gene and the interaction among HSP23 and other proteins under heat stressed condition,analysis was performed by using gene transfection,sucrose density gradient centrifugation and Western blot etc.The results indicated that in comparion between HSP23 expressed by transfected CV-l cells and HSP23 expressed by Drosophila, there were similarities in the property of HSP23 and the possible interaction among proteins during the period of heat stress and recovery.As compared with HSP23 expressed in the period of heat stress,the sedimentation rate of HSP23 of both Drosophila cells and transfected CV-1 cells increased faster in the period of recovery.These results suggested the availability of study on the functions of HSP23 and the possibility of formation of macromolecular complexes by HSP23 and other intracellular proteins after heat stress.
, 百拇医药
Key words Heat stress Drosophila HSP23 Macromolecular complexes Sucrose density gradient
当高温或某些化学物(重金属、砷化物等)作用于机体时，均可导致机体产生一系列被称为热应激蛋白或热休克蛋白(heat stress or heat shock proteins,HSPs)的蛋白质。主要的热休克蛋白家族为HSP27、HSP70和HSP90[1，2]。许多文献也提示了HSP70在保护生物免遭其它应激因素的损害中起重要作用，如：Hotchkis
本项目受武汉市科委晨光计划、国家自然科学基金和加拿大医学理事会资助等[3]发现HSP70的诱导合成能保护大鼠免遭内毒素的致死效应；Currie和Tanguay等[4]研究表明由高热处理家兔心脏所致HSP70的表达有助于减少家兔冠状动脉结扎和再灌注后的组织坏死和加速从缺血中恢复。HSPs作为“分子伴侣”促进细胞内蛋白的合成、折叠、装配和变性蛋白的清除等[5]。然而，其准确机制和功能仍不清楚。转基因的细胞和动物是研究这些机制和功能的重要手段之一，转染细胞所表达的蛋白质特性和它与其它分子相互关联是决定这种技术可行性的重要因素。为此，我们用基因转染、密度梯度离心和免疫印迹等技术，来分析转染果蝇HSP23基因的细胞在热应激和恢复期HSP23的特性和蛋白质之间相互作用的变化。
, 百拇医药
材料与方法
1.基因表达载体的构建：本实验的基因表达载体是由果蝇唾液腺HSP23基因[6]与pRC/CMV哺乳类载体通过Ecol RI-XbaI双酶切后，由T4DNA连接酶联接而成。
2.细胞培养、转染和热应激处理：果蝇S3细胞在23℃生长于含10%胎牛血清的果蝇培养液中。猴子CV-1细胞在37℃生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640悬浮培养液中。其CV-1细胞转染采用磷酸钙和40 μg质粒DNA共沉淀的方法进行[7]。S3细胞和CV-1细胞均采用循环水浴进行热处理。约3.6×107个果蝇S3细胞分为3组：对照组(23℃)、热应激组(35℃1小时)和恢复组(35℃1小时后，23℃恢复2小时)。约1.8×107个转染后CV-1细胞也分为3组：对照组(37℃)、热应激组(42℃1小时)和恢复组(42℃1小时后，于37℃恢复2小时)。热应激温度35℃、42℃分别是果蝇细胞、哺乳细胞的最佳热应激条件[1，8]。
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3.蔗糖梯度离心和免疫印迹：将悬浮培养的细胞于500 r/min离心5分钟，收集的细胞沉淀加入0.5 ml溶解缓冲液(30 mmol NaCl，10 mmol CaCl2，pH 7.2的100 mmol Tris，0.5% NP-40和1 mmol PMSF)。在4℃以最大速度在振荡器上振荡7分钟，并在显微镜下观察细胞的溶解情况，直到细胞完全破碎。在1 000×g离心10分钟，收集胞浆用于密度梯度离心。本实验采用10%～40%(w/w)的蔗糖梯度，离心速度为38 800 r/min，离心时间为23小时。每个样本由管底向上分为27个管份，每管约0.5 ml。然后每一管份分别加入110 μl 100%三氯乙酸在冰上沉淀30分钟，13 000 r/min离心15分钟，用丙酮洗去酸后，真空干燥，每管加入20 μl 1倍蛋白样品缓冲液，用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维薄膜上，其抗体为鼠抗果蝇HSP23、HSP26和HSP27抗体(稀释度1∶100)和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(稀释度1∶5 000)，用ECL试剂盒显示其蛋白质的存在[9]。
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4.图像分析：显影后的X线光片用分子动态计算光密度计(300A型)分别测定每一条带的整合光密度值，并绘成曲线[10]。
结 果
正常生长的果蝇S3细胞，几乎没有检测到任何小分子热应激蛋白(结果未显示)。在35℃热应激1小时后，在S3细胞检测出HSP23、HSP26和HSP27(依次从下向上)，在热应激S3细胞，HSP23出现两个峰，分别在管份10和23～25上(图1A)，经过2小时恢复后，HSP23峰移到管份1～3，11和23上(图1B)。在正常的CV-1细胞，也未检测出任何果蝇HSPs(结果未显示)，转染果蝇HSP23基因后热应激1小时的CV-1细胞，其明显的峰值在管份22～24上(图1C)。在经过2小时的恢复期后，其明显的峰在管底的几个组份中，另一弱峰在管份22和23上(图1D)。图2相应地显示各个条件下HSP23带的整合光密度值。
讨 论
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生物在接触亚致死性温度时，均诱导一组HSPs的合成，而抑制他们的正常蛋白合成。HSPs不仅可以被热休克所诱导，而且也可以被一系列体内应激因素所诱导，如缺血、高热、病毒感染、乙醇、铅、芳香类化合物、一氧化碳等[9，10]。热应激蛋白分为三大家族：(1)分子量为10～30 kD小分子家族，其主要成员有HSP10、HSP23、HSP26和HSP27等；(2)分子量为60～80 kD的中分子量家族，其主要成员有HSP60、HSP65、HSP70、HSP71、糖调节蛋白GRP75和GRP78等；(3)分子量为80～110 kD的大分子量家族，其主要成员有HSP83、HSP90、HSP104等[1，2]。
现在，许多研究提示了HSPs在保护生物免遭不良因素的损害中起重要作用，如参与热耐受的形成、保护大鼠免遭内毒素的致死效应和提高缺血后再灌注的恢复能力等[3，4]，但是，其准确机制和功能仍不清楚。近年研究表明:HSPs的作用和功能可能与它们作为“分子伴侣”参与细胞内蛋白的合成、折叠、装配和变性蛋白质的清除有关[5]。为进一步探讨HSPs的功能和作用，我们以果蝇HSP23为代表，采用基因转染、梯度离心、免疫印迹等技术和方法，来分析转染后基因表达产物的特性和它与其它蛋白质相互作用的可能性。
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图1 不同细胞浆经10%～40%蔗糖梯度离心后各管份HSP23的变化
1～27为管顺序(从管底到管顶);A：35℃热应激1 h后果蝇S3细胞；B：35℃热应激1 h，恢复2 h后果蝇S3细胞；C：用果蝇HSP23基因转染，42℃热应激1 h后CV-1细胞；D：用果蝇HSP23基因转染，42℃热应激1 h，恢复2 h后CV-1细胞
Fig 1 The changes of HSP23 in each cytoplasm fraction of different cells after centrifugation with 10%～40% sucrose gradient
1～27 is the number of collected tubes (1 to 27 is collected from the buttom to top of tubes).A:Drosophila S3 cells heated at 35℃ for one hour.B:Drosophila S3 cells heated at 35℃ for one hour and recovered at 23℃ for two hours.C:CV-1 cells transfected with Drosophila HSP23 gene,then heated at 42℃ for one hour.D:CV-1 cells transfected with Drosophila HSP23,then heated at 42℃ for one hour and recovered at 37℃ for two hours
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图2 图1相应HSP23带的定量整合值曲线
1～27为管顺序(从管底到管顶);A：35℃热应激1 h后果蝇S3细胞；B：35℃热应激1 h，恢复2 h后果蝇S3细胞；C：用果蝇HSP23基因转染，42℃热应激1 h后CV-1细胞；D：用果蝇HSP23基因转染，42℃热应激1 h，恢复2 h后CV-1细胞
Fig 2 The curves of quantitative integrated value of each HSP23 band corresponding to fig 1
1～27 is the number of collected tubes (1 to 27 is collected from the buttom to top of tubes).A:Drosophila S3 cells heated at 35℃ for one hour.B:Drosophila S3 cells heated at 35℃ for one hour and recovered at 23℃ for two hours.C:CV-1 cells transfected with Drosopyhila HSP23 gene,then heated at 42℃ for one hour.D:CV-1 cells transfected with Drosophila HSP23,then heated at 42℃ for one hour and recovered at 37℃ for two hours
, 百拇医药
我们的实验结果显示：与果蝇S3细胞热应激、热应激恢复后HSP23的特性相比，用果蝇HSP23转染CV-1细胞所表达HSP23在蔗糖密度梯度离心后，其特性是非常相似的，说明这种研究模型在研究单基因的作用和功能方面是可行的。热应激期间HSP23与热应激恢复期相比，其峰值明显向管底下移，说明其沉降系数增大。同一种蛋白质，在同一离心条件下，其沉降系数明显不同，其原因，可能是这种蛋白质与其它蛋白质相互作用，形成了共价化合物，而这些化合物经梯度离心后，在加入样品缓冲液的95℃热处理5分钟，破坏了这种共价结合，又进一步经SDS-PAGE分离的结果。这就提示HSP23这小分子蛋白质，可能作为分子伴侣，参与蛋白质之间的相互作用和热应激所致变性蛋白质的清除。关于它与何种蛋白质相互作用和清除哪种蛋白质，还有待于进一步证明。
参 考 文 献
1 Lindquist S,Craig EA.The heat shock proteins.Annu Rev Genet，1988,22:631～677.
, http://www.100md.com
2 Lindquist S.The heat shock response.Annu Rev Genet,1986,55:1151～1191.
3 Hotchkiss R,Numnally I,Lindquist S,et al.Hyperthermia protects mice against the lethal effects of endotoxin.Am J Physi,1993,265:1447～1457.
4 Currie RW,Tanguay RM,Kingma JJG.Heat shock response and limitation of tissue necrosis during occlusion reperfusion in rabbit heart.Circulation,1993,87:963～971.
5 Gething MJ,Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature,1992,355:33～45.
, 百拇医药
6 Ingolia TD ,Craig EA.Primary sequence of the 5" flanking regions of the Drosophila heat shock genes in chrommosome subdivision 67B.Nucleic Acids Res,1981,9:1627～1642.
7 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis.Molecular cloning:a laboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbour Laboratory Press,1989.
8 Kloetzel KW,Bautz EKF.Heat shock proteins are associated with hnRNA in Drosophila melanogaster tissue culture cells.EMBO,1983,2:705～710.
, http://www.100md.com
9 White CN,Hightower LE,Schultz.Variation in heat-shock proteins among species of desert fishes.Mol Biol Evol,1994,11:106～118.
10Wu TC,Tanguay RM,He HZ,et al.The combined effects of high temperature and carbon monoxide on the heat stress response.J Tongji Med Uni,1995,14:178～183.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药
单位：
关键词：热应激；果蝇HSP23；大分子复合物；蔗糖密度梯度
中华劳动卫生职业病杂志980205 【摘要】 目的 了解热应激蛋白23(HSP23)的特性和热应激后它与其它蛋白质间的可能相互作用。方法 采用基因转染、蔗糖密度梯度离心和免疫印迹等技术和方法，分析果蝇细胞和转染果蝇HSP23基因的猴子细胞在不同热应激条件下所表达的HSP23的变化。结果 转染果蝇HSP23基因后，猴子细胞所表达的蛋白质与热应激、热应激恢复期的果蝇细胞所表达的HSP23相比，在密度梯度离心中所显示的特性和可能的蛋白质间相互作用是相似的；与热应激期间HSP23相比，在恢复期间，果蝇细胞和转染后的猴子细胞HSP23的沉降增快。结论 用转染细胞研究HSP23功能的可行性和热应激后HSP23与胞内其它蛋白质形成大分子复合物的可能性。
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The analysis on the property changes of HSP23 expressed by CV-l cells after transfection with Drosophila HSP23 gene Wu Tangchun,Zhang Yongxing,Chen Sheng,et al.Institute of Occupational Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030
Abstract In order to understand the property of HSP23 expressed by monkey CV-l cells after transfection with Drosophila HSP23 gene and the interaction among HSP23 and other proteins under heat stressed condition,analysis was performed by using gene transfection,sucrose density gradient centrifugation and Western blot etc.The results indicated that in comparion between HSP23 expressed by transfected CV-l cells and HSP23 expressed by Drosophila, there were similarities in the property of HSP23 and the possible interaction among proteins during the period of heat stress and recovery.As compared with HSP23 expressed in the period of heat stress,the sedimentation rate of HSP23 of both Drosophila cells and transfected CV-1 cells increased faster in the period of recovery.These results suggested the availability of study on the functions of HSP23 and the possibility of formation of macromolecular complexes by HSP23 and other intracellular proteins after heat stress.
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Key words Heat stress Drosophila HSP23 Macromolecular complexes Sucrose density gradient
当高温或某些化学物(重金属、砷化物等)作用于机体时，均可导致机体产生一系列被称为热应激蛋白或热休克蛋白(heat stress or heat shock proteins,HSPs)的蛋白质。主要的热休克蛋白家族为HSP27、HSP70和HSP90[1，2]。许多文献也提示了HSP70在保护生物免遭其它应激因素的损害中起重要作用，如：Hotchkis
本项目受武汉市科委晨光计划、国家自然科学基金和加拿大医学理事会资助等[3]发现HSP70的诱导合成能保护大鼠免遭内毒素的致死效应；Currie和Tanguay等[4]研究表明由高热处理家兔心脏所致HSP70的表达有助于减少家兔冠状动脉结扎和再灌注后的组织坏死和加速从缺血中恢复。HSPs作为“分子伴侣”促进细胞内蛋白的合成、折叠、装配和变性蛋白的清除等[5]。然而，其准确机制和功能仍不清楚。转基因的细胞和动物是研究这些机制和功能的重要手段之一，转染细胞所表达的蛋白质特性和它与其它分子相互关联是决定这种技术可行性的重要因素。为此，我们用基因转染、密度梯度离心和免疫印迹等技术，来分析转染果蝇HSP23基因的细胞在热应激和恢复期HSP23的特性和蛋白质之间相互作用的变化。
, 百拇医药
材料与方法
1.基因表达载体的构建：本实验的基因表达载体是由果蝇唾液腺HSP23基因[6]与pRC/CMV哺乳类载体通过Ecol RI-XbaI双酶切后，由T4DNA连接酶联接而成。
2.细胞培养、转染和热应激处理：果蝇S3细胞在23℃生长于含10%胎牛血清的果蝇培养液中。猴子CV-1细胞在37℃生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640悬浮培养液中。其CV-1细胞转染采用磷酸钙和40 μg质粒DNA共沉淀的方法进行[7]。S3细胞和CV-1细胞均采用循环水浴进行热处理。约3.6×107个果蝇S3细胞分为3组：对照组(23℃)、热应激组(35℃1小时)和恢复组(35℃1小时后，23℃恢复2小时)。约1.8×107个转染后CV-1细胞也分为3组：对照组(37℃)、热应激组(42℃1小时)和恢复组(42℃1小时后，于37℃恢复2小时)。热应激温度35℃、42℃分别是果蝇细胞、哺乳细胞的最佳热应激条件[1，8]。
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3.蔗糖梯度离心和免疫印迹：将悬浮培养的细胞于500 r/min离心5分钟，收集的细胞沉淀加入0.5 ml溶解缓冲液(30 mmol NaCl，10 mmol CaCl2，pH 7.2的100 mmol Tris，0.5% NP-40和1 mmol PMSF)。在4℃以最大速度在振荡器上振荡7分钟，并在显微镜下观察细胞的溶解情况，直到细胞完全破碎。在1 000×g离心10分钟，收集胞浆用于密度梯度离心。本实验采用10%～40%(w/w)的蔗糖梯度，离心速度为38 800 r/min，离心时间为23小时。每个样本由管底向上分为27个管份，每管约0.5 ml。然后每一管份分别加入110 μl 100%三氯乙酸在冰上沉淀30分钟，13 000 r/min离心15分钟，用丙酮洗去酸后，真空干燥，每管加入20 μl 1倍蛋白样品缓冲液，用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维薄膜上，其抗体为鼠抗果蝇HSP23、HSP26和HSP27抗体(稀释度1∶100)和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(稀释度1∶5 000)，用ECL试剂盒显示其蛋白质的存在[9]。
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4.图像分析：显影后的X线光片用分子动态计算光密度计(300A型)分别测定每一条带的整合光密度值，并绘成曲线[10]。
结 果
正常生长的果蝇S3细胞，几乎没有检测到任何小分子热应激蛋白(结果未显示)。在35℃热应激1小时后，在S3细胞检测出HSP23、HSP26和HSP27(依次从下向上)，在热应激S3细胞，HSP23出现两个峰，分别在管份10和23～25上(图1A)，经过2小时恢复后，HSP23峰移到管份1～3，11和23上(图1B)。在正常的CV-1细胞，也未检测出任何果蝇HSPs(结果未显示)，转染果蝇HSP23基因后热应激1小时的CV-1细胞，其明显的峰值在管份22～24上(图1C)。在经过2小时的恢复期后，其明显的峰在管底的几个组份中，另一弱峰在管份22和23上(图1D)。图2相应地显示各个条件下HSP23带的整合光密度值。
讨 论
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生物在接触亚致死性温度时，均诱导一组HSPs的合成，而抑制他们的正常蛋白合成。HSPs不仅可以被热休克所诱导，而且也可以被一系列体内应激因素所诱导，如缺血、高热、病毒感染、乙醇、铅、芳香类化合物、一氧化碳等[9，10]。热应激蛋白分为三大家族：(1)分子量为10～30 kD小分子家族，其主要成员有HSP10、HSP23、HSP26和HSP27等；(2)分子量为60～80 kD的中分子量家族，其主要成员有HSP60、HSP65、HSP70、HSP71、糖调节蛋白GRP75和GRP78等；(3)分子量为80～110 kD的大分子量家族，其主要成员有HSP83、HSP90、HSP104等[1，2]。
现在，许多研究提示了HSPs在保护生物免遭不良因素的损害中起重要作用，如参与热耐受的形成、保护大鼠免遭内毒素的致死效应和提高缺血后再灌注的恢复能力等[3，4]，但是，其准确机制和功能仍不清楚。近年研究表明:HSPs的作用和功能可能与它们作为“分子伴侣”参与细胞内蛋白的合成、折叠、装配和变性蛋白质的清除有关[5]。为进一步探讨HSPs的功能和作用，我们以果蝇HSP23为代表，采用基因转染、梯度离心、免疫印迹等技术和方法，来分析转染后基因表达产物的特性和它与其它蛋白质相互作用的可能性。
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图1 不同细胞浆经10%～40%蔗糖梯度离心后各管份HSP23的变化
1～27为管顺序(从管底到管顶);A：35℃热应激1 h后果蝇S3细胞；B：35℃热应激1 h，恢复2 h后果蝇S3细胞；C：用果蝇HSP23基因转染，42℃热应激1 h后CV-1细胞；D：用果蝇HSP23基因转染，42℃热应激1 h，恢复2 h后CV-1细胞
Fig 1 The changes of HSP23 in each cytoplasm fraction of different cells after centrifugation with 10%～40% sucrose gradient
1～27 is the number of collected tubes (1 to 27 is collected from the buttom to top of tubes).A:Drosophila S3 cells heated at 35℃ for one hour.B:Drosophila S3 cells heated at 35℃ for one hour and recovered at 23℃ for two hours.C:CV-1 cells transfected with Drosophila HSP23 gene,then heated at 42℃ for one hour.D:CV-1 cells transfected with Drosophila HSP23,then heated at 42℃ for one hour and recovered at 37℃ for two hours
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图2 图1相应HSP23带的定量整合值曲线
1～27为管顺序(从管底到管顶);A：35℃热应激1 h后果蝇S3细胞；B：35℃热应激1 h，恢复2 h后果蝇S3细胞；C：用果蝇HSP23基因转染，42℃热应激1 h后CV-1细胞；D：用果蝇HSP23基因转染，42℃热应激1 h，恢复2 h后CV-1细胞
Fig 2 The curves of quantitative integrated value of each HSP23 band corresponding to fig 1
1～27 is the number of collected tubes (1 to 27 is collected from the buttom to top of tubes).A:Drosophila S3 cells heated at 35℃ for one hour.B:Drosophila S3 cells heated at 35℃ for one hour and recovered at 23℃ for two hours.C:CV-1 cells transfected with Drosopyhila HSP23 gene,then heated at 42℃ for one hour.D:CV-1 cells transfected with Drosophila HSP23,then heated at 42℃ for one hour and recovered at 37℃ for two hours
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我们的实验结果显示：与果蝇S3细胞热应激、热应激恢复后HSP23的特性相比，用果蝇HSP23转染CV-1细胞所表达HSP23在蔗糖密度梯度离心后，其特性是非常相似的，说明这种研究模型在研究单基因的作用和功能方面是可行的。热应激期间HSP23与热应激恢复期相比，其峰值明显向管底下移，说明其沉降系数增大。同一种蛋白质，在同一离心条件下，其沉降系数明显不同，其原因，可能是这种蛋白质与其它蛋白质相互作用，形成了共价化合物，而这些化合物经梯度离心后，在加入样品缓冲液的95℃热处理5分钟，破坏了这种共价结合，又进一步经SDS-PAGE分离的结果。这就提示HSP23这小分子蛋白质，可能作为分子伴侣，参与蛋白质之间的相互作用和热应激所致变性蛋白质的清除。关于它与何种蛋白质相互作用和清除哪种蛋白质，还有待于进一步证明。
参 考 文 献
1 Lindquist S,Craig EA.The heat shock proteins.Annu Rev Genet，1988,22:631～677.
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2 Lindquist S.The heat shock response.Annu Rev Genet,1986,55:1151～1191.
3 Hotchkiss R,Numnally I,Lindquist S,et al.Hyperthermia protects mice against the lethal effects of endotoxin.Am J Physi,1993,265:1447～1457.
4 Currie RW,Tanguay RM,Kingma JJG.Heat shock response and limitation of tissue necrosis during occlusion reperfusion in rabbit heart.Circulation,1993,87:963～971.
5 Gething MJ,Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature,1992,355:33～45.
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6 Ingolia TD ,Craig EA.Primary sequence of the 5" flanking regions of the Drosophila heat shock genes in chrommosome subdivision 67B.Nucleic Acids Res,1981,9:1627～1642.
7 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis.Molecular cloning:a laboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbour Laboratory Press,1989.
8 Kloetzel KW,Bautz EKF.Heat shock proteins are associated with hnRNA in Drosophila melanogaster tissue culture cells.EMBO,1983,2:705～710.
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9 White CN,Hightower LE,Schultz.Variation in heat-shock proteins among species of desert fishes.Mol Biol Evol,1994,11:106～118.
10Wu TC,Tanguay RM,He HZ,et al.The combined effects of high temperature and carbon monoxide on the heat stress response.J Tongji Med Uni,1995,14:178～183.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药