丙酮氰醇亚急性染毒对大鼠生物膜毒性效应
作者：李大川 许发茂 邓丽霞 郑履康
单位：510089 广州，中山医科大学劳动卫生学教研室
关键词：丙酮氰醇；生物膜毒性；脂质过氧化
丙酮氰醇亚急性染毒对大鼠生物膜毒性效应 【摘要】 目的 探索丙酮氰醇中毒机制。 方法 SD大鼠亚急性吸入不同浓度的丙酮氰醇(5.43±0.90或43.89±6.12 mg/m3)45或90天，观察其生物膜损伤情况。 结果 大鼠脑匀浆脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量明显升高(P<0.05)；心、肝组织匀浆MDA含量无明显变化。高剂量组微粒体膜MDA含量有显著升高(P<0.05)；脑细胞线粒体膜MDA含量无明显变化。丙酮氰醇对线粒体膜的Na+,K+-ATP酶、细胞色素氧化酶活力及荧光偏振度(P)均有显著影响(P<0.05)。红细胞膜MDA无明显变化，但膜流动性显著降低，Na+,K+-ATP酶活力也显著受抑制(P<0.05)。 结论 丙酮氰醇对染毒动物细胞和细胞器膜均有不同程度的毒效应。
, http://www.100md.com
The toxic effect of acetone cyanohydrin on the biomembrane of rats after subacute exposure Li Dachuan,Xu Famao,Deng Lixia,et al.Department of Occupational Medicine.Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089
【Abstract】 Objective To study the mechanisms of acetone cyanohydrin intoxication.Methods 42 SD rats(21 male,21 female) were used and randomly divided into three groups,2 experimental groups and 1 control group.The experimental groups inhaled acetone cyanohydrin with different concentrations(5.43±0.90 and 43.89±6.12 mg/m3) for 45 and 90 days,then the injury of biomembrane were observed.Results The products of lipid peroxidation(MDA) of brain homogenate increased obviously(P<0.05)，while that of heart and liver had no obvious change.MDA in the mitochondrial membrane of brain cells was not increased,while there was obvious MDA increase in microsome membrane of high dose group(P<0.05).Acetone cyanohydrin also induced changes in Na+,K+-ATPase,cytochrome oxidase and fluidity of mitochondrial membrane(P<0.05).MDA in erythrocyte membrane was not increased whereas the fluidity of it was obviously decreased and Na+,K+-ATPase was inhibited as well (P<0.05).Conclusion Acetone cyanohydrin may have different extent of toxic effect on cellular membrane and organelle membrane.
, 百拇医药
【Key words】 Acetone cyanohydrin Biomembrane toxicity Lipid peroxidation
丙酮氰醇对细胞及细胞器膜毒性研究较少。为了探索该化合物的中毒机制，为防治中毒提供依据,我们用膜毒理学方法对该化合物对细胞及细胞器膜的损伤作了初步研究。
材料与方法
1.动物与试剂：由广东省医用动物场提供的健康SD大鼠42只，雌雄各半，体重80～120 g。丙酮氰醇由北京防化所化工厂生产，纯度99.5%，批号94.47。
2.方法：42只SD大鼠随机分为3组(每组14只)，1组为对照组，另2组为实验组。两个实验组用同济医科大学设计的动式染毒装置(KTQ-3RB)，每天染毒4小时，每周染毒6天，丙酮氰醇染毒浓度分别为5.43±0.90、43.89±6.12 mg/m3(用色谱法和化学法监测丙酮氰醇浓度)。染毒至45天处死1/2大鼠，90天时处死剩下的1/2。线粒体及微粒体的制备按Snell“不连续测定法”[1]。组织匀浆、红细胞膜和线粒体膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)按周浔等[2]的方法测定。红细胞膜的制备参照Pearson方法[3]。红细胞及线粒体膜荧光偏振度(P)的测定参照林克椿方法[4]。红细胞膜及线粒体膜Na+,K+-ATP酶活力的测定按照Pearson方法[3]。蛋白质测定按贵阳等医学院生化教研室编的微量凯氏定氮法、考马斯亮蓝染色法[5]。
, http://www.100md.com
3.实验数据采用方差分析进行处理。
结 果
1.丙酮氰醇亚急性染毒对大鼠各组织细胞膜脂质过氧化的影响：丙酮氰醇引起脑匀浆MDA含量升高，两剂量组均高于对照组，差异有显著性(P<0.05)，且有剂量-效应关系；心、肝组织匀浆的MDA含量差异无显著性(表1)。
2.丙酮氰醇对大鼠脑细胞线粒体和微粒体膜脂质过氧化的影响：高剂量组微粒体膜MDA含量与对照组的差异有显著性(P<0.05)；而线粒体未发现MDA明显增加(表1)。
3.丙酮氰醇对大鼠红细胞膜的作用：红细胞膜的MDA含量各剂量组与对照组均无明显差异；高剂量组荧光偏振度和Na+,K+-ATP酶活力升高，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)(表2)，说明膜流动性降低。
, 百拇医药
4.丙酮氰醇对大鼠脑细胞线粒体膜的损伤：丙酮氰醇不同剂量和不同时间染毒的大鼠脑细胞线粒体膜上的Na+,K+-ATP酶和细胞色素氧化酶活力降低及荧光偏振度升高，与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)，且呈剂量-效应关系(表2)。
表1 丙酮氰醇亚急性染毒大鼠不同组织和生物膜MDA的含量(
±s,n=6)
Table 1 The content of MDA in different tissue and membrane of mitochondria and microsome
of rats after subacute exposure to acetone cyanohydrin(±s,n=6)
, 百拇医药
组 别
Group
MDA(μmol/mg prot.)
红细胞膜
Membrane of
erythrocyte
心肌组织匀浆
Homogenate of
heart tissue
肝组织匀浆
Homogenate of
liver tissue
, 百拇医药
脑组织匀浆
Homogenate of
brain tissue
脑线粒体膜
Brain mitochondria
membrane
脑微粒体膜
Brain microsome
membrane
染毒组
Exposed
(mg/m3)
, 百拇医药
5.43
0.48±0.09
1.84±0.13
5.18±0.94
11.35±1.29*
2.24±0.11
6.06±0.38
43.89
0.33±0.07
2.24±0.11
5.48±1.31
15.23±1.43*
, 百拇医药
2.13±0.17
8.42±1.22*
对照组
Control
0.38±0.06
2.09±0.09
5.04±0.45
7.01±1.14
2.99±0.69
5.08±0.15
与对照组比较，*P<0.05 *P<0.05 vs. control 表2 丙酮氰醇亚急性染毒大鼠红细胞膜和脑线粒体膜的Na+,K+-ATP酶、细胞色素氧化酶活力及荧光偏振度
, 百拇医药
Table 2 The activity of Na+,K+-ATPase and cytochrome oxidase,fluorescent polarization
of erythrocyte membrane and mitochondrial membrane of brain cells in rats
after subacute exposure to acetone cyanohydrin(±s,n=6)
组别
Group
, 百拇医药
红细胞膜
Membrane of erythrocyte
脑细胞线粒体 Mitochondria of brain
Na+,K+-ATPase
(Pi μmol/mg prot.)
荧光偏振度(P)
Fluorescent
polarization(P)
Na+,K+-ATPase
, 百拇医药 (Pi μmol/mg prot.)
细胞色素氧化酶
Cytochrome oxidase
(μmol*mg prot.-1*min-1)
荧光偏振度(P)
Fluorescent
polarization(P)
45 d
90 d
45 d
90 d
, 百拇医药
45 d
90 d
染毒组
Exposed
(mg/m3)
5.43
0.69±0.02
0.288±0.023
2.77±0.64*
3.11±0.44*
258.1±44.5*
, 百拇医药
252.1±25.5*
0.177±0.005*
0.182±0.006*
43.89
0.72±0.03*
0.404±0.044*
2.59±0.89*
2.46±0.66*
84.9±5.7*
, http://www.100md.com 100.4±14.7*
0.185±0.005*
0.177±0.003*
对照组
Control
0.59±0.05
0.275±0.013
6.52±0.61
7.92±0.89
301.7±41.2
292.0±19.6
, http://www.100md.com
0.151±0.002
0.156±0.002
与对照组比较，*P<0.05 *P<0.05 vs. control 讨 论
1.有研究表明：在机体的细胞色素氧化酶受丙酮氰醇抑制的同时，伴随有神经细胞膜完整性的改变[6]。丙酮氰醇对神经细胞膜造成的损伤与脂质过氧化有关。本次实验发现脑匀浆的MDA含量明显升高，而肝、心组织匀浆未见明显变化。丙酮氰醇并非在所有组织都引起细胞膜脂质过氧化。Way[7]认为:在肝脏组织中含有丰富的硫氰酸酶对抗氰化物的攻击。Bondy[8]认为:神经组织对脂质过氧化最敏感，其原因是神经组织脂质含量丰富和神经细胞内缺乏分解自由基的酶。
2.Na+,K+-ATP酶与ATP的分解和细胞内外钠、钾离子的转运密切相关。本实验观察到线粒体膜上Na+,K+-ATP酶活力不同染毒时期各剂量组均显著低于对照组，但其膜MDA含量无明显改变。Na+,K+-ATP酶活力的降低很可能是膜流动性改变所致，也可能是毒物直接作用的结果。
, 百拇医药
3.膜正常的流动性是维持膜的各种功能的极重要的条件。Dobretsov[9]发现:膜脂质过氧化后，导致微粘度升高，使膜流动性降低。本研究发现：线粒体尽管未发生脂质过氧化，但荧光偏振度同样升高，且随染毒剂量的增加而增加。可以认为丙酮氰醇引起膜流动性下降,除脂质过氧化外，还可能存在其它影响途径。
4.丙酮氰醇急性中毒抑制细胞色素氧化酶活力。本次在亚急性实验条件下，发现丙酮氰醇明显抑制细胞色素氧化酶的活力，提示对氰化物亚慢性毒作用应给予更多的关注。
本课题受中国预防医学科学院资助
参考文献
1 Snell K,Mullock B.Biochemical toxicology.UK:IRL Press Limited，1987.183～253.
, 百拇医药
2 周浔，方允中.人血清和动物组织中脂质过氧化值变化与衰老的关系.解放军医学杂志，1985，10：417～418.
3 Pearson TW.Na+,K+-ATPase of Duchenne muscular dystrophy erythrocyte ghosts.Life Sci,1978,22:127～132.
4 林克椿，聂松青.细胞膜的流动性.生理科学进展，1985，22：83～89.
5 贵州、衡阳、广州等医学院生物化学教研室合编.生物化学实验.贵阳：贵州人民出版社，1987.45～53.
6 Jerry DJ,Williamg GC,Gary EI.Alteration of cytosolic calcium levels in PC12 cell by potassium cyanide.Toxicol Appl Pharmacol,1987,88:217～224.
, 百拇医药
7 Way JL.Cyanide intoxication and its mechanism of antagonism.Annu Rev Pharmacol Toxicol,1984,24:451～481.
8 Bondy SC.Reactive oxygen species:relation to aging and neurotoxic damage.Neurotoxicol,1992,13:87～100.
9 Dobretsov GE,Borschevsjaya TA,Petrov VA,et al.The increase of phospholipid bilayer rigidity after lipid peroxidation.FEBS Lett,1977,84:125～128.
(收稿：1997-07-11 修回：1998-03-16), 百拇医药
单位：510089 广州，中山医科大学劳动卫生学教研室
关键词：丙酮氰醇；生物膜毒性；脂质过氧化
丙酮氰醇亚急性染毒对大鼠生物膜毒性效应 【摘要】 目的 探索丙酮氰醇中毒机制。 方法 SD大鼠亚急性吸入不同浓度的丙酮氰醇(5.43±0.90或43.89±6.12 mg/m3)45或90天，观察其生物膜损伤情况。 结果 大鼠脑匀浆脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量明显升高(P<0.05)；心、肝组织匀浆MDA含量无明显变化。高剂量组微粒体膜MDA含量有显著升高(P<0.05)；脑细胞线粒体膜MDA含量无明显变化。丙酮氰醇对线粒体膜的Na+,K+-ATP酶、细胞色素氧化酶活力及荧光偏振度(P)均有显著影响(P<0.05)。红细胞膜MDA无明显变化，但膜流动性显著降低，Na+,K+-ATP酶活力也显著受抑制(P<0.05)。 结论 丙酮氰醇对染毒动物细胞和细胞器膜均有不同程度的毒效应。
, http://www.100md.com
The toxic effect of acetone cyanohydrin on the biomembrane of rats after subacute exposure Li Dachuan,Xu Famao,Deng Lixia,et al.Department of Occupational Medicine.Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089
【Abstract】 Objective To study the mechanisms of acetone cyanohydrin intoxication.Methods 42 SD rats(21 male,21 female) were used and randomly divided into three groups,2 experimental groups and 1 control group.The experimental groups inhaled acetone cyanohydrin with different concentrations(5.43±0.90 and 43.89±6.12 mg/m3) for 45 and 90 days,then the injury of biomembrane were observed.Results The products of lipid peroxidation(MDA) of brain homogenate increased obviously(P<0.05)，while that of heart and liver had no obvious change.MDA in the mitochondrial membrane of brain cells was not increased,while there was obvious MDA increase in microsome membrane of high dose group(P<0.05).Acetone cyanohydrin also induced changes in Na+,K+-ATPase,cytochrome oxidase and fluidity of mitochondrial membrane(P<0.05).MDA in erythrocyte membrane was not increased whereas the fluidity of it was obviously decreased and Na+,K+-ATPase was inhibited as well (P<0.05).Conclusion Acetone cyanohydrin may have different extent of toxic effect on cellular membrane and organelle membrane.
, 百拇医药
【Key words】 Acetone cyanohydrin Biomembrane toxicity Lipid peroxidation
丙酮氰醇对细胞及细胞器膜毒性研究较少。为了探索该化合物的中毒机制，为防治中毒提供依据,我们用膜毒理学方法对该化合物对细胞及细胞器膜的损伤作了初步研究。
材料与方法
1.动物与试剂：由广东省医用动物场提供的健康SD大鼠42只，雌雄各半，体重80～120 g。丙酮氰醇由北京防化所化工厂生产，纯度99.5%，批号94.47。
2.方法：42只SD大鼠随机分为3组(每组14只)，1组为对照组，另2组为实验组。两个实验组用同济医科大学设计的动式染毒装置(KTQ-3RB)，每天染毒4小时，每周染毒6天，丙酮氰醇染毒浓度分别为5.43±0.90、43.89±6.12 mg/m3(用色谱法和化学法监测丙酮氰醇浓度)。染毒至45天处死1/2大鼠，90天时处死剩下的1/2。线粒体及微粒体的制备按Snell“不连续测定法”[1]。组织匀浆、红细胞膜和线粒体膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)按周浔等[2]的方法测定。红细胞膜的制备参照Pearson方法[3]。红细胞及线粒体膜荧光偏振度(P)的测定参照林克椿方法[4]。红细胞膜及线粒体膜Na+,K+-ATP酶活力的测定按照Pearson方法[3]。蛋白质测定按贵阳等医学院生化教研室编的微量凯氏定氮法、考马斯亮蓝染色法[5]。
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3.实验数据采用方差分析进行处理。
结 果
1.丙酮氰醇亚急性染毒对大鼠各组织细胞膜脂质过氧化的影响：丙酮氰醇引起脑匀浆MDA含量升高，两剂量组均高于对照组，差异有显著性(P<0.05)，且有剂量-效应关系；心、肝组织匀浆的MDA含量差异无显著性(表1)。
2.丙酮氰醇对大鼠脑细胞线粒体和微粒体膜脂质过氧化的影响：高剂量组微粒体膜MDA含量与对照组的差异有显著性(P<0.05)；而线粒体未发现MDA明显增加(表1)。
3.丙酮氰醇对大鼠红细胞膜的作用：红细胞膜的MDA含量各剂量组与对照组均无明显差异；高剂量组荧光偏振度和Na+,K+-ATP酶活力升高，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)(表2)，说明膜流动性降低。
, 百拇医药
4.丙酮氰醇对大鼠脑细胞线粒体膜的损伤：丙酮氰醇不同剂量和不同时间染毒的大鼠脑细胞线粒体膜上的Na+,K+-ATP酶和细胞色素氧化酶活力降低及荧光偏振度升高，与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)，且呈剂量-效应关系(表2)。
表1 丙酮氰醇亚急性染毒大鼠不同组织和生物膜MDA的含量(
±s,n=6)Table 1 The content of MDA in different tissue and membrane of mitochondria and microsome
of rats after subacute exposure to acetone cyanohydrin(
±s,n=6), 百拇医药
组 别
Group
MDA(μmol/mg prot.)
红细胞膜
Membrane of
erythrocyte
心肌组织匀浆
Homogenate of
heart tissue
肝组织匀浆
Homogenate of
liver tissue
, 百拇医药
脑组织匀浆
Homogenate of
brain tissue
脑线粒体膜
Brain mitochondria
membrane
脑微粒体膜
Brain microsome
membrane
染毒组
Exposed
(mg/m3)
, 百拇医药
5.43
0.48±0.09
1.84±0.13
5.18±0.94
11.35±1.29*
2.24±0.11
6.06±0.38
43.89
0.33±0.07
2.24±0.11
5.48±1.31
15.23±1.43*
, 百拇医药
2.13±0.17
8.42±1.22*
对照组
Control
0.38±0.06
2.09±0.09
5.04±0.45
7.01±1.14
2.99±0.69
5.08±0.15
与对照组比较，*P<0.05 *P<0.05 vs. control 表2 丙酮氰醇亚急性染毒大鼠红细胞膜和脑线粒体膜的Na+,K+-ATP酶、细胞色素氧化酶活力及荧光偏振度
, 百拇医药
Table 2 The activity of Na+,K+-ATPase and cytochrome oxidase,fluorescent polarization
of erythrocyte membrane and mitochondrial membrane of brain cells in rats
after subacute exposure to acetone cyanohydrin(
±s,n=6)组别
Group
, 百拇医药
红细胞膜
Membrane of erythrocyte
脑细胞线粒体 Mitochondria of brain
Na+,K+-ATPase
(Pi μmol/mg prot.)
荧光偏振度(P)
Fluorescent
polarization(P)
Na+,K+-ATPase
, 百拇医药 (Pi μmol/mg prot.)
细胞色素氧化酶
Cytochrome oxidase
(μmol*mg prot.-1*min-1)
荧光偏振度(P)
Fluorescent
polarization(P)
45 d
90 d
45 d
90 d
, 百拇医药
45 d
90 d
染毒组
Exposed
(mg/m3)
5.43
0.69±0.02
0.288±0.023
2.77±0.64*
3.11±0.44*
258.1±44.5*
, 百拇医药
252.1±25.5*
0.177±0.005*
0.182±0.006*
43.89
0.72±0.03*
0.404±0.044*
2.59±0.89*
2.46±0.66*
84.9±5.7*
, http://www.100md.com 100.4±14.7*
0.185±0.005*
0.177±0.003*
对照组
Control
0.59±0.05
0.275±0.013
6.52±0.61
7.92±0.89
301.7±41.2
292.0±19.6
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0.151±0.002
0.156±0.002
与对照组比较，*P<0.05 *P<0.05 vs. control 讨 论
1.有研究表明：在机体的细胞色素氧化酶受丙酮氰醇抑制的同时，伴随有神经细胞膜完整性的改变[6]。丙酮氰醇对神经细胞膜造成的损伤与脂质过氧化有关。本次实验发现脑匀浆的MDA含量明显升高，而肝、心组织匀浆未见明显变化。丙酮氰醇并非在所有组织都引起细胞膜脂质过氧化。Way[7]认为:在肝脏组织中含有丰富的硫氰酸酶对抗氰化物的攻击。Bondy[8]认为:神经组织对脂质过氧化最敏感，其原因是神经组织脂质含量丰富和神经细胞内缺乏分解自由基的酶。
2.Na+,K+-ATP酶与ATP的分解和细胞内外钠、钾离子的转运密切相关。本实验观察到线粒体膜上Na+,K+-ATP酶活力不同染毒时期各剂量组均显著低于对照组，但其膜MDA含量无明显改变。Na+,K+-ATP酶活力的降低很可能是膜流动性改变所致，也可能是毒物直接作用的结果。
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3.膜正常的流动性是维持膜的各种功能的极重要的条件。Dobretsov[9]发现:膜脂质过氧化后，导致微粘度升高，使膜流动性降低。本研究发现：线粒体尽管未发生脂质过氧化，但荧光偏振度同样升高，且随染毒剂量的增加而增加。可以认为丙酮氰醇引起膜流动性下降,除脂质过氧化外，还可能存在其它影响途径。
4.丙酮氰醇急性中毒抑制细胞色素氧化酶活力。本次在亚急性实验条件下，发现丙酮氰醇明显抑制细胞色素氧化酶的活力，提示对氰化物亚慢性毒作用应给予更多的关注。
本课题受中国预防医学科学院资助
参考文献
1 Snell K,Mullock B.Biochemical toxicology.UK:IRL Press Limited，1987.183～253.
, 百拇医药
2 周浔，方允中.人血清和动物组织中脂质过氧化值变化与衰老的关系.解放军医学杂志，1985，10：417～418.
3 Pearson TW.Na+,K+-ATPase of Duchenne muscular dystrophy erythrocyte ghosts.Life Sci,1978,22:127～132.
4 林克椿，聂松青.细胞膜的流动性.生理科学进展，1985，22：83～89.
5 贵州、衡阳、广州等医学院生物化学教研室合编.生物化学实验.贵阳：贵州人民出版社，1987.45～53.
6 Jerry DJ,Williamg GC,Gary EI.Alteration of cytosolic calcium levels in PC12 cell by potassium cyanide.Toxicol Appl Pharmacol,1987,88:217～224.
, 百拇医药
7 Way JL.Cyanide intoxication and its mechanism of antagonism.Annu Rev Pharmacol Toxicol,1984,24:451～481.
8 Bondy SC.Reactive oxygen species:relation to aging and neurotoxic damage.Neurotoxicol,1992,13:87～100.
9 Dobretsov GE,Borschevsjaya TA,Petrov VA,et al.The increase of phospholipid bilayer rigidity after lipid peroxidation.FEBS Lett,1977,84:125～128.
(收稿：1997-07-11 修回：1998-03-16), 百拇医药