几种化合物对石棉诱发人胚肺细胞非程序DNA合成的影响
作者：樊晶光 王起恩 刘世杰
单位：100083 北京医科大学劳动卫生学教研室(樊晶光现在劳动部劳动保护科学研究所工作)
关键词：温石棉；人胚肺细胞；非程序DNA合成
中华劳动卫生职业病杂志980507 【摘要】 目的 探讨几种化合物对温石棉诱发人胚肺(HEL)细胞非程序DNA合成(UDS)的影响。 方法 用不同浓度的柠檬酸铝、混合稀土或亚硒酸钠溶液浸泡温石棉1小时后，再将其与HEL细胞共同孵育，通过3H-TdR掺入法，测定了HEL细胞的UDS。 结果 温石棉可使HEL细胞的UDS显著增高，并呈明显的剂量-反应关系。与未处理温石棉组相比，经三种化合物处理的温石棉所致UDS量均明显下降。 结论 采用适当化合物溶液浸泡温石棉，有可能减轻温石棉对人类的致癌危害性。
Effects of several chemicals on the induction of UDS by chrysotile in human embryo lung cells Fan Jingguang,Wang Qien,Liu Shijie.Department of Labor Health,Beijing Medical University,Beijing 100083
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To explore the effects of several chemicals on the induction of unscheduled DNA synthesis(UDS) by chrysotile in human embryo lung(HEL) cells.Methods HEL cells were incubated with chrysotile which was pretreated by soaking in aluminium citrate,mixed rare earths or sodium selenite solutions at different concentrations for 1 hour.Then, the UDS of HEL cells were determined by3H-TdR incorporation assay.Results The untreated chrysotile caused dose-dependent increases of UDS of HEL cells,but the pretreated chrysotile induced less UDS.Conclusion The carcinogenicity of chrysotile may be reduced by soaking chrysotile in proper compounds.
, http://www.100md.com
【Key words】 Chrysotile Human embryo lung cells Unscheduled DNA synthesis
根据流行病学调查和动物实验结果，石棉已被证实为人类确定致癌物，但其致癌机制目前尚不清楚。有研究报道：将细胞和石棉在体外共同孵育，可使细胞的非程序DNA合成(UDS)明显增加[1]，提示石棉对细胞的DNA有损伤作用。本研究通过3H-TdR掺入法，测定了温石棉染毒后人胚肺(HEL)细胞的UDS，并观察了不同浓度的柠檬酸铝、混合稀土或亚硒酸钠对温石棉诱导HEL细胞产生UDS的影响，现将结果报告如下。
材料与方法
1.实验用细胞株：HEL细胞由军事医学科学院赵修南同志惠赠。用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化传代，用含10%小牛血清和双抗的MEM培养液于37℃、5%CO2的条件下培养，3天传代1次。
, http://www.100md.com
2.石棉样品的制备：选用青海茫崖产温石棉，用冰冻切片机(刻度调至5 μm处)切割后，置60℃烤箱中烘干备用(经电镜检测，其分散度为：<5 μm者占9%、5～ μm者占46%、10～ μm者占34%、≥20 μm者占11%，直径<0.2 μm者占95%)。临用前将温石棉加入双蒸水中，超声10分钟，并用混悬器振荡2分钟，配成一定浓度均匀的混悬液。
3.石棉纤维的预处理：将一定量的温石棉悬液与不同浓度的混合稀土、柠檬酸铝(含Al3+93%)或亚硒酸钠溶液相混后，分别在室温下作用1小时，2 000 转/分离心10分钟，弃去上清液后，再用PBS将下部沉淀配成一定浓度的混悬液。
4.UDS测定：将HEL细胞接种于24孔板(5×104个细胞/孔)，待细胞生长至对数生长期时，加入终浓度为5mmol/L的羟基脲作用24小时，然后加入终浓度为2.5 μCi/ml的3H-TdR和不同浓度的温石棉悬液或经浸泡过的温石棉悬液，或者在加入温石棉悬液的同时，加入过氧化氢酶(CAT)和二甲基亚砜(DMSO)。24小时后用胰酶消化，将细胞收集到玻璃纤维滤膜上，80℃烘干，置于内含5 ml闪烁液的液闪瓶中，用LS-6500型液体闪烁计数仪(Beckman)测定CPM值(即为UDS量)。
, 百拇医药
化合物对温石棉所致UDS的抑制率的计算:抑制率=(未处理石棉组所测值-处理后石棉组所测值)÷(未处理石棉组所测值-对照组所测值)。
5.统计学处理：采用Primer软件中的t检验和相关分析程序对数据进行统计处理。
结 果
1.温石棉所致HEL细胞UDS：由表1可见，温石棉可使HEL细胞的UDS显著增高，并呈剂量-反应关系(r=0.958，P<0.05)。表明温石棉可诱导HEL细胞的UDS。
2.三种化合物对温石棉致HEL细胞UDS的影响：由表2～表4可见，与未处理温石棉组相比，经三种化合物处理的温石棉所致UDS量均明显下降，但不同剂量之间的抑制效应差别不大，即其抑制率并不随化合物浓度的升高而呈等比增加。
3.抗氧化剂对温石棉致HEL细胞UDS的影响：由表5可见，在培养液中加入CAT或DMSO，均可使温石棉诱导HEL细胞产生的UDS减少，其中DMSO可使温石棉诱导HEL细胞产生的UDS明显降低。
, 百拇医药
表1 不同剂量温石棉所致HEL细胞UDS量
Table 1 Induction of UDS by chrysotile at different
concentrations in HEL cells 温石棉
Chrysotile(μg/ml)
样本数
n
CPM value
(
±s)
0.0
, http://www.100md.com
4
122.3±3.1
2.5
4
121.0±2.0
5.0
4
148.7±15.5*
10.0
4
171.0±3.6**
与0.0组比，*P<0.05,** P<0.01
, 百拇医药
*P<0.05,** P<0.01 vs. 0.0 group表2 柠檬酸铝对温石棉致HEL细胞UDS的影响
Table 2 Effect of aluminium citrate on the induction of UDS by chrysotile in HEL cells 温石棉
Chrysotile(μg/ml)
柠檬酸铝
Aluminium citrate(μg/ml)
样本数
n
CPM value
, 百拇医药
(±s)
抑制率(%)
Percent of inhibition
10
0.0
4
171.0±3.6
10
2.5
4
144.0±8.7**
, 百拇医药
55.45
10
5.0
4
144.3±7.1**
54.83
10
10.0
4
132.5±10.9**
79.06
与未处理温石棉组相比,** P<0.01 ** P<0.01 vs. untreated chrysotile group表3 混合稀土对温石棉致HEL细胞UDS的影响
, 百拇医药
Table 3 Effect of mixed rare earths on the induction of UDS by chrysotile in HEL cells 温石棉
Chrysotile(μg/ml)
混合稀土
Mixed rare earths(μg/ml)
样本数
n
CPM value
(±s)
抑制率(%)
, 百拇医药
Percent of inhibition
10
0.0
4
171.0±3.6
10
2.5
4
137.7±30.2
68.38
10
5.0
4
, 百拇医药
132.3±9.5**
79.47
10
10.0
4
115.0±11.3**
114.98
与未处理温石棉组相比,** P<0.01 ** P<0.01 vs. untreated chrysotile group表4 亚硒酸钠对温石棉致HEL细胞UDS的影响
Table 4 Effect of sodium selenite on the induction of UDS by chrysotile in HEL cells 温石棉
, http://www.100md.com
Chrysotile(μg/ml)
亚硒酸钠
Sodium selenite(μg/ml)
样本数
n
CPM value
(±s)
抑制率(%)
Percent of inhibition
10
0.0
, http://www.100md.com
4
171.0±3.6
10
2.5
4
132.3±26.0*
79.47
10
5.0
4
123.0±19.1**
98.57
, http://www.100md.com
10
10.0
4
124.7±20.7**
95.08
与未处理温石棉组相比,*P<0.05,** P<0.01 *P<0.05,** P<0.01 vs. untreated chrysotile group表5 过氧化氢酶(CAT)和二甲基亚砜(DMSO)
对温石棉致HEL细胞UDS的影响
Table 5 Effect of CAT and DMSO on the induction
, 百拇医药
of UDS by chrysotile in HEL cells 温石棉
Chrysotile(μg/ml)
抗氧化剂
Antioxidants
样本数
n
CPM value
(±s)
0
4
122.3±3.1
, 百拇医药
10
4
171.0±3.6
10
CAT
4
152.3±23.2
10
DMSO
4
129.0±22.2*
CAT:100 U/ml;DMSO:50 mmol/L;
, 百拇医药
与未处理温石棉组相比,*P<0.05
*P<0.05 vs. untreated chrysotile group讨 论
对多种肿瘤的研究证实:致癌是一多阶段过程。首先是启动阶段，即致癌物在细胞中诱发遗传物质损伤。早已证实UDS试验是检测致癌物对DNA操作的有效手段。Renier等[1]发现：温石棉和青石棉在体外均可引起大鼠胸膜间皮(RPM)细胞的UDS，并呈明显的剂量-反应关系。为了研究暴露于温石棉纤维的RPM细胞DNA的修复，Dong等[2]测定了温石棉染毒细胞的ADP-核糖聚合酶(PARP)活力，结果显示：温石棉和青石棉均可诱导PARP的活力，呈明显的剂量-反应关系，而且温石棉和青石棉均可诱导RPM细胞的UDS增加，提示DNA链断裂是温石棉引起RPM细胞损伤的一种。本研究结果显示：温石棉可使HEL细胞的UDS显著增高，并呈明显的剂量-反应关系，提示温石棉也可致HEL细胞DNA损伤。
, http://www.100md.com
Dong等[3]报道：在加入温石棉的同时加入抗氧化酶，则可抑制温石棉诱导间皮细胞UDS的产生。因此认为温石棉的致DNA损伤效应与活性氧有关。本研究在温石棉染毒的同时，加入CAT或DMSO，发现二者均可使温石棉诱导HEL细胞产生的UDS减少，其中DMSO可使UDS量显著降低，证实了上述观点。
本研究结果还发现：与未处理温石棉组相比，经柠檬酸铝、混合稀土或亚硒酸钠溶液处理的温石棉所致HEL细胞UDS量明显下降，表明用三种化合物溶液浸泡处理温石棉后，均可减轻温石棉对HEL细胞DNA的损伤作用,其机制可能与三种化合物处理后温石棉诱导细胞产生的活性氧浓度下降有关,但三种化合物均表现出不同剂量之间的抑制效应差别不大。提示：在实际应用时，以较小剂量的三种化合物溶液浸泡处理温石棉，即可减轻温石棉对HEL细胞DNA的损伤作用。
参考文献
1 Renier A,Levy F,Pilliere F,et al.Unscheduled DNA synthesis in rat pleural mesothelial cells treated with mineral fibers.Mutat Res,1990,241:361～367.
, http://www.100md.com
2 Dong HY,Buard A,Levy F,et al.Synthesis of poly(ADP-ribose) in asbestos treated rat pleural mesothelial cells in culture.Mutat Res,1995,331:197～204.
3 Dong HY,Buard A,Renier A,et al.Role of oxygen derivatives in the cytotoxicity and DNA damage produced by asbestos on rat pleural mesothelial cells in vitro.Carcinogenesis,1994,15:1251～1255.
(收稿：1997-12-10 修回：1998-03-02)
(本文编辑：杨捷), http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学劳动卫生学教研室(樊晶光现在劳动部劳动保护科学研究所工作)
关键词：温石棉；人胚肺细胞；非程序DNA合成
中华劳动卫生职业病杂志980507 【摘要】 目的 探讨几种化合物对温石棉诱发人胚肺(HEL)细胞非程序DNA合成(UDS)的影响。 方法 用不同浓度的柠檬酸铝、混合稀土或亚硒酸钠溶液浸泡温石棉1小时后，再将其与HEL细胞共同孵育，通过3H-TdR掺入法，测定了HEL细胞的UDS。 结果 温石棉可使HEL细胞的UDS显著增高，并呈明显的剂量-反应关系。与未处理温石棉组相比，经三种化合物处理的温石棉所致UDS量均明显下降。 结论 采用适当化合物溶液浸泡温石棉，有可能减轻温石棉对人类的致癌危害性。
Effects of several chemicals on the induction of UDS by chrysotile in human embryo lung cells Fan Jingguang,Wang Qien,Liu Shijie.Department of Labor Health,Beijing Medical University,Beijing 100083
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To explore the effects of several chemicals on the induction of unscheduled DNA synthesis(UDS) by chrysotile in human embryo lung(HEL) cells.Methods HEL cells were incubated with chrysotile which was pretreated by soaking in aluminium citrate,mixed rare earths or sodium selenite solutions at different concentrations for 1 hour.Then, the UDS of HEL cells were determined by3H-TdR incorporation assay.Results The untreated chrysotile caused dose-dependent increases of UDS of HEL cells,but the pretreated chrysotile induced less UDS.Conclusion The carcinogenicity of chrysotile may be reduced by soaking chrysotile in proper compounds.
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【Key words】 Chrysotile Human embryo lung cells Unscheduled DNA synthesis
根据流行病学调查和动物实验结果，石棉已被证实为人类确定致癌物，但其致癌机制目前尚不清楚。有研究报道：将细胞和石棉在体外共同孵育，可使细胞的非程序DNA合成(UDS)明显增加[1]，提示石棉对细胞的DNA有损伤作用。本研究通过3H-TdR掺入法，测定了温石棉染毒后人胚肺(HEL)细胞的UDS，并观察了不同浓度的柠檬酸铝、混合稀土或亚硒酸钠对温石棉诱导HEL细胞产生UDS的影响，现将结果报告如下。
材料与方法
1.实验用细胞株：HEL细胞由军事医学科学院赵修南同志惠赠。用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化传代，用含10%小牛血清和双抗的MEM培养液于37℃、5%CO2的条件下培养，3天传代1次。
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2.石棉样品的制备：选用青海茫崖产温石棉，用冰冻切片机(刻度调至5 μm处)切割后，置60℃烤箱中烘干备用(经电镜检测，其分散度为：<5 μm者占9%、5～ μm者占46%、10～ μm者占34%、≥20 μm者占11%，直径<0.2 μm者占95%)。临用前将温石棉加入双蒸水中，超声10分钟，并用混悬器振荡2分钟，配成一定浓度均匀的混悬液。
3.石棉纤维的预处理：将一定量的温石棉悬液与不同浓度的混合稀土、柠檬酸铝(含Al3+93%)或亚硒酸钠溶液相混后，分别在室温下作用1小时，2 000 转/分离心10分钟，弃去上清液后，再用PBS将下部沉淀配成一定浓度的混悬液。
4.UDS测定：将HEL细胞接种于24孔板(5×104个细胞/孔)，待细胞生长至对数生长期时，加入终浓度为5mmol/L的羟基脲作用24小时，然后加入终浓度为2.5 μCi/ml的3H-TdR和不同浓度的温石棉悬液或经浸泡过的温石棉悬液，或者在加入温石棉悬液的同时，加入过氧化氢酶(CAT)和二甲基亚砜(DMSO)。24小时后用胰酶消化，将细胞收集到玻璃纤维滤膜上，80℃烘干，置于内含5 ml闪烁液的液闪瓶中，用LS-6500型液体闪烁计数仪(Beckman)测定CPM值(即为UDS量)。
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化合物对温石棉所致UDS的抑制率的计算:抑制率=(未处理石棉组所测值-处理后石棉组所测值)÷(未处理石棉组所测值-对照组所测值)。
5.统计学处理：采用Primer软件中的t检验和相关分析程序对数据进行统计处理。
结 果
1.温石棉所致HEL细胞UDS：由表1可见，温石棉可使HEL细胞的UDS显著增高，并呈剂量-反应关系(r=0.958，P<0.05)。表明温石棉可诱导HEL细胞的UDS。
2.三种化合物对温石棉致HEL细胞UDS的影响：由表2～表4可见，与未处理温石棉组相比，经三种化合物处理的温石棉所致UDS量均明显下降，但不同剂量之间的抑制效应差别不大，即其抑制率并不随化合物浓度的升高而呈等比增加。
3.抗氧化剂对温石棉致HEL细胞UDS的影响：由表5可见，在培养液中加入CAT或DMSO，均可使温石棉诱导HEL细胞产生的UDS减少，其中DMSO可使温石棉诱导HEL细胞产生的UDS明显降低。
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表1 不同剂量温石棉所致HEL细胞UDS量
Table 1 Induction of UDS by chrysotile at different
concentrations in HEL cells 温石棉
Chrysotile(μg/ml)
样本数
n
CPM value
(
±s)0.0
, http://www.100md.com
4
122.3±3.1
2.5
4
121.0±2.0
5.0
4
148.7±15.5*
10.0
4
171.0±3.6**
与0.0组比，*P<0.05,** P<0.01
, 百拇医药
*P<0.05,** P<0.01 vs. 0.0 group表2 柠檬酸铝对温石棉致HEL细胞UDS的影响
Table 2 Effect of aluminium citrate on the induction of UDS by chrysotile in HEL cells 温石棉
Chrysotile(μg/ml)
柠檬酸铝
Aluminium citrate(μg/ml)
样本数
n
CPM value
, 百拇医药
(
±s)抑制率(%)
Percent of inhibition
10
0.0
4
171.0±3.6
10
2.5
4
144.0±8.7**
, 百拇医药
55.45
10
5.0
4
144.3±7.1**
54.83
10
10.0
4
132.5±10.9**
79.06
与未处理温石棉组相比,** P<0.01 ** P<0.01 vs. untreated chrysotile group表3 混合稀土对温石棉致HEL细胞UDS的影响
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Table 3 Effect of mixed rare earths on the induction of UDS by chrysotile in HEL cells 温石棉
Chrysotile(μg/ml)
混合稀土
Mixed rare earths(μg/ml)
样本数
n
CPM value
(
±s)抑制率(%)
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Percent of inhibition
10
0.0
4
171.0±3.6
10
2.5
4
137.7±30.2
68.38
10
5.0
4
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132.3±9.5**
79.47
10
10.0
4
115.0±11.3**
114.98
与未处理温石棉组相比,** P<0.01 ** P<0.01 vs. untreated chrysotile group表4 亚硒酸钠对温石棉致HEL细胞UDS的影响
Table 4 Effect of sodium selenite on the induction of UDS by chrysotile in HEL cells 温石棉
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Chrysotile(μg/ml)
亚硒酸钠
Sodium selenite(μg/ml)
样本数
n
CPM value
(
±s)抑制率(%)
Percent of inhibition
10
0.0
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171.0±3.6
10
2.5
4
132.3±26.0*
79.47
10
5.0
4
123.0±19.1**
98.57
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10.0
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124.7±20.7**
95.08
与未处理温石棉组相比,*P<0.05,** P<0.01 *P<0.05,** P<0.01 vs. untreated chrysotile group表5 过氧化氢酶(CAT)和二甲基亚砜(DMSO)
对温石棉致HEL细胞UDS的影响
Table 5 Effect of CAT and DMSO on the induction
, 百拇医药
of UDS by chrysotile in HEL cells 温石棉
Chrysotile(μg/ml)
抗氧化剂
Antioxidants
样本数
n
CPM value
(
±s)0
4
122.3±3.1
, 百拇医药
10
4
171.0±3.6
10
CAT
4
152.3±23.2
10
DMSO
4
129.0±22.2*
CAT:100 U/ml;DMSO:50 mmol/L;
, 百拇医药
与未处理温石棉组相比,*P<0.05
*P<0.05 vs. untreated chrysotile group讨 论
对多种肿瘤的研究证实:致癌是一多阶段过程。首先是启动阶段，即致癌物在细胞中诱发遗传物质损伤。早已证实UDS试验是检测致癌物对DNA操作的有效手段。Renier等[1]发现：温石棉和青石棉在体外均可引起大鼠胸膜间皮(RPM)细胞的UDS，并呈明显的剂量-反应关系。为了研究暴露于温石棉纤维的RPM细胞DNA的修复，Dong等[2]测定了温石棉染毒细胞的ADP-核糖聚合酶(PARP)活力，结果显示：温石棉和青石棉均可诱导PARP的活力，呈明显的剂量-反应关系，而且温石棉和青石棉均可诱导RPM细胞的UDS增加，提示DNA链断裂是温石棉引起RPM细胞损伤的一种。本研究结果显示：温石棉可使HEL细胞的UDS显著增高，并呈明显的剂量-反应关系，提示温石棉也可致HEL细胞DNA损伤。
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Dong等[3]报道：在加入温石棉的同时加入抗氧化酶，则可抑制温石棉诱导间皮细胞UDS的产生。因此认为温石棉的致DNA损伤效应与活性氧有关。本研究在温石棉染毒的同时，加入CAT或DMSO，发现二者均可使温石棉诱导HEL细胞产生的UDS减少，其中DMSO可使UDS量显著降低，证实了上述观点。
本研究结果还发现：与未处理温石棉组相比，经柠檬酸铝、混合稀土或亚硒酸钠溶液处理的温石棉所致HEL细胞UDS量明显下降，表明用三种化合物溶液浸泡处理温石棉后，均可减轻温石棉对HEL细胞DNA的损伤作用,其机制可能与三种化合物处理后温石棉诱导细胞产生的活性氧浓度下降有关,但三种化合物均表现出不同剂量之间的抑制效应差别不大。提示：在实际应用时，以较小剂量的三种化合物溶液浸泡处理温石棉，即可减轻温石棉对HEL细胞DNA的损伤作用。
参考文献
1 Renier A,Levy F,Pilliere F,et al.Unscheduled DNA synthesis in rat pleural mesothelial cells treated with mineral fibers.Mutat Res,1990,241:361～367.
, http://www.100md.com
2 Dong HY,Buard A,Levy F,et al.Synthesis of poly(ADP-ribose) in asbestos treated rat pleural mesothelial cells in culture.Mutat Res,1995,331:197～204.
3 Dong HY,Buard A,Renier A,et al.Role of oxygen derivatives in the cytotoxicity and DNA damage produced by asbestos on rat pleural mesothelial cells in vitro.Carcinogenesis,1994,15:1251～1255.
(收稿：1997-12-10 修回：1998-03-02)
(本文编辑：杨捷), http://www.100md.com