四氯偶氮苯在大鼠胆汁中的分泌和代谢
作者：王涤新 UA Pillai GI Sipes
单位：100020 北京市劳动卫生职业病防治研究所(王涤新)；Center for Toxicology,Department of Pharmacology and Toxicology,University of Arizona(UA Pillai、GI Sipes)
关键词：
四氯偶氮苯在大鼠胆汁中的分泌和代谢 四氯偶氮苯(3,3',4,4'-tetrachloroazobenzene,TCAB)和四氯氧化偶氮苯(3,3',4,4'-tetrachloroazoxybenzene,TCAOB)是在合成氯代或二氯代苯胺类除草剂时生成的污染废弃物。此类除草剂经细菌降解或光化作用也可在土壤和水中生成TCAB和TCAOB。TCAB对人体的潜在毒作用已引起重视[1]。本研究测定了14C标记的TCAB和TCAOB在雄性F-344大鼠胆汁中的分泌，并对其中的代谢产物进行了初步分析。
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一、材料与方法
试剂：14C-TCAB(26.3×1010Bq)、14C-TCAOB(26.3×1010Bq)纯度为98.5%、99.3%，溶剂用乳化剂emulphor∶乙醇∶双蒸水(3∶3∶4)。β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase,type B1)、硫酸酯酶(sulfatase,type H1)。磷酸钾缓冲液0.1mol/L，pH 7.6。乙酰乙酸、氨基乙酸、甲醇均用分析纯。
动物：健康F-344大鼠，雄性，体重175～250g，在标准条件下饲养1周后用于实验。静脉给药及胆汁收集：大鼠经腹腔注射50%乌拉坦1g/kg，麻醉后用PE-50和PE-10塑胶管分别行颈静脉及胆总管插管。经颈静脉给予14C-TCAB(3.2 mg/kg)或14C-TCOAB(3.4 mg/kg)。将胆汁收集到置冰浴内的小试管中，每管收集30分钟，直至给药后6小时。用同位素液体闪烁记数仪测定胆汁的放射剂量。
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胆汁样品萃取及代谢产物测定：100ml胆汁加入1ml磷酸钾缓冲液、2ml乙酰乙酸，超声振荡数分钟，吸出有机相并在氮气中干燥，1ml甲醇再溶解，用高压液相色谱(HPLC)初步分析。萃取物还分别与β-葡萄糖醛酸酶(2 000U/ml)和硫酸酯酶(100U/ml)孵育(37℃,60min)，再用HPLC分析。分离柱用250mm×4.6mm，C18，5μm，双梯度流动相，30分钟内氨基乙酸与甲醇的梯度比由100∶0到0∶100，流速0.5ml/min。UV/vis检测器在波长254nm测定峰面积。β-RAM放射监测器显示放射核素的排出峰。胆汁样品还经Bakerbond SPE C18浸出柱过滤并用甲醇洗脱，干燥和再溶解后用液相—质谱(LC/MS)法进一步测定代谢产物，LC/MS检测系统配有Finnigan TSQ 7000测定仪和1050型HPLC，UV/vis检测器和APCI发射源。色谱分离柱和双梯度流动相同前。
二、结果
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经静脉给予14C-TCAB、14C-TCAOB后，胆汁中TCAB的分泌高峰在给药后1～3小时，而TCAOB在给药后1～6小时内呈较为缓慢而均衡的分泌，6小时内它们累计分泌的总量分别为总给药量的33%、26%。
胆汁经乙酰乙酸萃取和HPLC测定显示单一极化峰，当样品与β-葡萄糖醛酸酶孵育后，此极化峰完全消失，而出现单一的新波峰，并与TCAB和TCAOB原出峰时间相同(36.4 min或32.0 min)。而样品与硫酸酯酶孵育后，原极化峰部分消失，出现数个较小的新波峰，各峰保留时间与β-葡萄糖醛酸酶孵育结果相似，显示两酶作用相似，但酶反应强弱有别(图1)。
a:5 μmol/LTCAB标准样品；b:胆汁样品；
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c:胆汁与葡萄糖醛酸孵育后；d:胆汁与硫酸酯酶孵育后
图1 大鼠胆汁中代谢产物的HPLC测定结果(静脉给予TCAB后30分钟)
经LC/APCI/MS分析，质谱在标记m/z 320出现〔M-H〕-加强峰，在标记m/z 336出现一弱峰，两者均含35Cl/37Cl同位素离子，组成四氯结构的化合物。还测到标记m/z 320的离子质谱与TCAB标样〔M+H〕-的离子质谱相同。
三、讨论
TCAB和TCAOB是二口 恶口 英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)的同系物。近年来TCDD被认为是潜在性环境致癌物。TCAB类因结构上与TCDD相似，它们都可与肝内芳香烃受体(Ah receptor)结合，具有某些相同的毒性，如引起氯痤疮、激活肝内芳香烃水解酶、降低机体免疫功能等。但TCAB和TCAOB具有偶氮键，其体内代谢与TCDD不尽相同。TCDD在体内代谢分解极慢，多以原形积存。大鼠经静脉和经口给予TCDD，其生物半寿期达12～24天，静脉给药后5小时，胆汁中TCDD的分泌总量仅8%[2]。本研究显示：静脉给TCAB和TCAOB后6小时，胆汁中分泌总量分别达33%和26%，均明显高于TCDD。我们先前的研究表明：大鼠经静脉给予TCAB和TCAOB后，两者生物半寿期仅分别为3.9和4.3小时[3]。同样显示两者的清除排泄明显快于TCDD。
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TCAB的尿中代谢产物是偶氮键(-N=N-)完全断裂生成的一氯或二氯苯胺，部分还进一步乙酰化或磺酸化[3]。苯胺的毒性是引起变性血红蛋白血症和溶血性贫血，较代谢前的化合物有更强的毒性。本研究观察到胆汁中的代谢产物与尿中的氯代苯胺类衍生物不同。偶氮化合物分泌到胆汁中生成极化性很强的产物。而用LC/MS分析鉴定，此放射性标记物仍是TCAB类基团构型。Hsia等[4]用SD大鼠的肝微粒体与TCAB体外反应有相似的报告。作者认为：偶氮键的部分水解和羟化可解释这一现象，如生成3,3',4,4'-tetrachl-orohydrazobenzene(TCHAB)和N-OH-tetrachlorohydrobenzene(TCHB)，这些代谢物在溶液中缺乏离子化基团，因此，在用LC/MS测定时仍显示四氯偶氮化合物的离子质谱。在生物体内的偶氮化合物部分水解后，很容易与肝内葡萄糖醛酸酯和硫酸酯结合，这类复合大分子化合物很快从胆汁中分泌出，并在葡萄糖醛酸酯酶作用下，脱去葡萄糖醛酸酯和水分子，复原成TCAB和TCAOB。这一代谢形式促进了偶氮化合物从消化道的消除，减少了它们在体内的积存和生成终末有毒代谢产物。
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(本课题为美国亚利桑那大学毒理学中心研究项目，得到美国环境卫生研究所NIEH支持)
参 考 文 献
[1] United States Environmental Protection Agency.Environmental Criteria and Assessment Office.Health and Environmental Effects Profile for TCAB,TCAOB and TCHB.Cincinatti Ohio,1985.
[2] Kedderis LB,Diliberto JJ,Linko P,et al.Disposition,2,3,7,8-tetrabromdibenzo-p-dioxin and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in the rat:biliary excretion and induction of cytochromes CYPIA1 and CYPIA2.Toxicol Appl Pharmacol,1991,111:165-172.
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[3] Pillai UA,Ziegler TL,Wang DX,et al.3,3',4,4'-Tetra-chloroazobenzene absorption,disposition and metabolism in male Fischer 344 rats.Drug Metab Distrib,1995,24:238-244.
[4] Hsia MTS,Kreamer BL.Metabolism studies of 3,3',4,4'-Tetrachloroazobenzene,in vitro metabolic pathway with rat liver microsomes.Chem Biol Interact,1981,34:19-29.
(收稿：1997-09-22 修回：1997-12-20), 百拇医药
单位：100020 北京市劳动卫生职业病防治研究所(王涤新)；Center for Toxicology,Department of Pharmacology and Toxicology,University of Arizona(UA Pillai、GI Sipes)
关键词：
四氯偶氮苯在大鼠胆汁中的分泌和代谢 四氯偶氮苯(3,3',4,4'-tetrachloroazobenzene,TCAB)和四氯氧化偶氮苯(3,3',4,4'-tetrachloroazoxybenzene,TCAOB)是在合成氯代或二氯代苯胺类除草剂时生成的污染废弃物。此类除草剂经细菌降解或光化作用也可在土壤和水中生成TCAB和TCAOB。TCAB对人体的潜在毒作用已引起重视[1]。本研究测定了14C标记的TCAB和TCAOB在雄性F-344大鼠胆汁中的分泌，并对其中的代谢产物进行了初步分析。
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一、材料与方法
试剂：14C-TCAB(26.3×1010Bq)、14C-TCAOB(26.3×1010Bq)纯度为98.5%、99.3%，溶剂用乳化剂emulphor∶乙醇∶双蒸水(3∶3∶4)。β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase,type B1)、硫酸酯酶(sulfatase,type H1)。磷酸钾缓冲液0.1mol/L，pH 7.6。乙酰乙酸、氨基乙酸、甲醇均用分析纯。
动物：健康F-344大鼠，雄性，体重175～250g，在标准条件下饲养1周后用于实验。静脉给药及胆汁收集：大鼠经腹腔注射50%乌拉坦1g/kg，麻醉后用PE-50和PE-10塑胶管分别行颈静脉及胆总管插管。经颈静脉给予14C-TCAB(3.2 mg/kg)或14C-TCOAB(3.4 mg/kg)。将胆汁收集到置冰浴内的小试管中，每管收集30分钟，直至给药后6小时。用同位素液体闪烁记数仪测定胆汁的放射剂量。
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胆汁样品萃取及代谢产物测定：100ml胆汁加入1ml磷酸钾缓冲液、2ml乙酰乙酸，超声振荡数分钟，吸出有机相并在氮气中干燥，1ml甲醇再溶解，用高压液相色谱(HPLC)初步分析。萃取物还分别与β-葡萄糖醛酸酶(2 000U/ml)和硫酸酯酶(100U/ml)孵育(37℃,60min)，再用HPLC分析。分离柱用250mm×4.6mm，C18，5μm，双梯度流动相，30分钟内氨基乙酸与甲醇的梯度比由100∶0到0∶100，流速0.5ml/min。UV/vis检测器在波长254nm测定峰面积。β-RAM放射监测器显示放射核素的排出峰。胆汁样品还经Bakerbond SPE C18浸出柱过滤并用甲醇洗脱，干燥和再溶解后用液相—质谱(LC/MS)法进一步测定代谢产物，LC/MS检测系统配有Finnigan TSQ 7000测定仪和1050型HPLC，UV/vis检测器和APCI发射源。色谱分离柱和双梯度流动相同前。
二、结果
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经静脉给予14C-TCAB、14C-TCAOB后，胆汁中TCAB的分泌高峰在给药后1～3小时，而TCAOB在给药后1～6小时内呈较为缓慢而均衡的分泌，6小时内它们累计分泌的总量分别为总给药量的33%、26%。
胆汁经乙酰乙酸萃取和HPLC测定显示单一极化峰，当样品与β-葡萄糖醛酸酶孵育后，此极化峰完全消失，而出现单一的新波峰，并与TCAB和TCAOB原出峰时间相同(36.4 min或32.0 min)。而样品与硫酸酯酶孵育后，原极化峰部分消失，出现数个较小的新波峰，各峰保留时间与β-葡萄糖醛酸酶孵育结果相似，显示两酶作用相似，但酶反应强弱有别(图1)。
a:5 μmol/LTCAB标准样品；b:胆汁样品；
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c:胆汁与葡萄糖醛酸孵育后；d:胆汁与硫酸酯酶孵育后
图1 大鼠胆汁中代谢产物的HPLC测定结果(静脉给予TCAB后30分钟)
经LC/APCI/MS分析，质谱在标记m/z 320出现〔M-H〕-加强峰，在标记m/z 336出现一弱峰，两者均含35Cl/37Cl同位素离子，组成四氯结构的化合物。还测到标记m/z 320的离子质谱与TCAB标样〔M+H〕-的离子质谱相同。
三、讨论
TCAB和TCAOB是二口 恶口 英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)的同系物。近年来TCDD被认为是潜在性环境致癌物。TCAB类因结构上与TCDD相似，它们都可与肝内芳香烃受体(Ah receptor)结合，具有某些相同的毒性，如引起氯痤疮、激活肝内芳香烃水解酶、降低机体免疫功能等。但TCAB和TCAOB具有偶氮键，其体内代谢与TCDD不尽相同。TCDD在体内代谢分解极慢，多以原形积存。大鼠经静脉和经口给予TCDD，其生物半寿期达12～24天，静脉给药后5小时，胆汁中TCDD的分泌总量仅8%[2]。本研究显示：静脉给TCAB和TCAOB后6小时，胆汁中分泌总量分别达33%和26%，均明显高于TCDD。我们先前的研究表明：大鼠经静脉给予TCAB和TCAOB后，两者生物半寿期仅分别为3.9和4.3小时[3]。同样显示两者的清除排泄明显快于TCDD。
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TCAB的尿中代谢产物是偶氮键(-N=N-)完全断裂生成的一氯或二氯苯胺，部分还进一步乙酰化或磺酸化[3]。苯胺的毒性是引起变性血红蛋白血症和溶血性贫血，较代谢前的化合物有更强的毒性。本研究观察到胆汁中的代谢产物与尿中的氯代苯胺类衍生物不同。偶氮化合物分泌到胆汁中生成极化性很强的产物。而用LC/MS分析鉴定，此放射性标记物仍是TCAB类基团构型。Hsia等[4]用SD大鼠的肝微粒体与TCAB体外反应有相似的报告。作者认为：偶氮键的部分水解和羟化可解释这一现象，如生成3,3',4,4'-tetrachl-orohydrazobenzene(TCHAB)和N-OH-tetrachlorohydrobenzene(TCHB)，这些代谢物在溶液中缺乏离子化基团，因此，在用LC/MS测定时仍显示四氯偶氮化合物的离子质谱。在生物体内的偶氮化合物部分水解后，很容易与肝内葡萄糖醛酸酯和硫酸酯结合，这类复合大分子化合物很快从胆汁中分泌出，并在葡萄糖醛酸酯酶作用下，脱去葡萄糖醛酸酯和水分子，复原成TCAB和TCAOB。这一代谢形式促进了偶氮化合物从消化道的消除，减少了它们在体内的积存和生成终末有毒代谢产物。
, 百拇医药
(本课题为美国亚利桑那大学毒理学中心研究项目，得到美国环境卫生研究所NIEH支持)
参 考 文 献
[1] United States Environmental Protection Agency.Environmental Criteria and Assessment Office.Health and Environmental Effects Profile for TCAB,TCAOB and TCHB.Cincinatti Ohio,1985.
[2] Kedderis LB,Diliberto JJ,Linko P,et al.Disposition,2,3,7,8-tetrabromdibenzo-p-dioxin and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in the rat:biliary excretion and induction of cytochromes CYPIA1 and CYPIA2.Toxicol Appl Pharmacol,1991,111:165-172.
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[3] Pillai UA,Ziegler TL,Wang DX,et al.3,3',4,4'-Tetra-chloroazobenzene absorption,disposition and metabolism in male Fischer 344 rats.Drug Metab Distrib,1995,24:238-244.
[4] Hsia MTS,Kreamer BL.Metabolism studies of 3,3',4,4'-Tetrachloroazobenzene,in vitro metabolic pathway with rat liver microsomes.Chem Biol Interact,1981,34:19-29.
(收稿：1997-09-22 修回：1997-12-20), 百拇医药