次声刺激后大鼠下丘神经型一氧化氮合成酶阳性神经元FOS蛋白的表达
作者：邢晓辉 陈景藻
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院康复理疗科
关键词：次声；FOS；神经型一氧化氮合成酶；下丘
中华劳动卫生职业病杂志/990407 摘要 目的 研究次声对下丘的作用机制。 方法 用抗FOS蛋白和抗神经型一氧化氮合成酶(n-cNOS)免疫组织化学方法，将大鼠暴露于8 Hz、120 dB的次声中，持续 2小时，观察下丘FOS蛋白的表达情况及其与n-cNOS阳性神经元的关系。 结果 在下丘出现大量FOS样及散在的n-cNOS样免疫反应阳性神经元，且部分n-cNOS阳性神经元的胞核同时呈FOS染色阳性，这种FOS/n-cNOS双标记神经元约占FOS阳性神经元总数的10%。 结论 部分n-cNOS神经元参与对次声刺激的反应。
FOS expression in n-cNOS neurons of inferior colliculus following infrasonic
, 百拇医药
stimulation in rats
Xing Xiaohui,Chen Jingzao.Department of Physiotherapy,Xi Jing
Hospital,Xian 710032
Abstract Objective To determine the effect of infrasound on inferior colliculus. Methods FOS expression and the relationship with neural constitutive NOS(n-cNOS) immunoreactive neurons were studied by immunohistochemistry method in rats exposed to infrasound(8 Hz,120 dB) for 2 hours. Results FOS was strongly induced in the inferior colliculus,and about 10% of n-cNOS immunoreactive neurons were FOS positive.Conclusion Some n-cNOS immunoreactive neurons of the inferior colliculus are involved in the response to infrasound.
, 百拇医药
Key words Infrasound FOS n-cNOS Inferior colliculus
次声是频率为0.000 1～20 Hz的弹性波，是生产噪声和公共噪声的重要组成部分，作为环境污染因素的次声愈来愈受到关注[1]。文献报道不同频率、声压级的次声在不同作用时间下，可引起听觉系统形态、功能的改变[2-5]。有学者认为次声与可听声的作用机制是不同的，它可直接作用于中枢听觉系统引起共振，从而产生生物效应[6]。我们用抗FOS和神经型一氧化氮合成酶(neural cNOS,n-cNOS)双重免疫组织化学(ABC)法，观察次声刺激后下丘内神经元是否有FOS蛋白表达以及与n-cNOS神经元的关系。
材料与方法
成年健康雄性SD大鼠9只，体重250～300 g。实验前1周将动物领回喂养，置于安静、室温为18 ℃、自然光照的环境中，避免刺激，动物随机分为实验组(5只)和对照组(4只),对照组又分为空白对照(2只)和免疫组化染色对照(2只)。
, http://www.100md.com
一、次声压力仓系统及动物模型
1.我校的次声压力仓系统采用电激励方式产生次声，该系统包括仓体、次声源及检测系统三部分，能产生频率0～20 Hz、声压90～129 dB稳定的次声。
2.动物模型的制作：将实验组5只动物置于次声压力仓内，暴露于8 Hz、120 dB的次声环境中，持续2小时，然后置于与实验前相同的环境中存活2小时。
二、切片制备和免疫组化反应
1.切片制备：动物均用1%戊巴比妥钠腹腔深度麻醉，开胸经升主动脉插管，100 ml生理盐水冲洗，继而灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)500 ml，持续1.5小时，取下丘置于20%蔗糖磷酸缓冲液过夜(4 ℃)，冰冻连续冠状切片，片厚30 μm，置于PBS内。
, 百拇医药 2.FOS免疫组化反应(ABC法)：(1)切片放入含0.3%H2O2-甲醇液(80%的甲醇配制)中，室温下30分钟，以封闭内源性的过氧化物酶；(2)用含0.3%Triton X-100的0.01 mol/L PBS(pH=7.4)浸泡30分钟；(3)加入兔抗FOS血清(1∶1 000，北京中山公司)，4 ℃48小时；(4)加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温4小时；(5)加入卵白素-生物素结合的HRP(ABC 1∶500，Sigma)，室温4小时。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS漂洗10分钟×3；最后葡萄糖-DAB-硫酸镍铵法显色，室温下反应10～15分钟。反应后切片继续进行n-cNOS免疫组化反应。
3.n-cNOS免疫组化反应(ABC法)：(1)切片经PBS洗涤后，加入兔抗n-cNOS血清(1∶2 000，Sigma)，4 ℃，48小时；(2)加入生物素化羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温4小时；(3)加入卵白素-生物素结合的HRP(ABC 1∶500，Sigma)，室温4小时(4)用葡萄糖-DAB法显色，裱片、晾干、脱水、透明、封固。 空白对照组大鼠置于次声压力仓内2小时，不启动次声声源，从次声仓内取出后存活2小时，然后直接灌注、固定、取材，行FOS免疫组化反应。免疫组化染色对照组动物的下丘切片分别用正常兔血清和PBS代替抗FOS抗体作孵育，其余步骤与实验组的动物一致。
, 百拇医药
结果与讨论
空白对照未见到FOS阳性神经元，说明在正常状态下丘内无FOS表达；免疫组化染色对照亦无FOS阳性神经元，说明免疫组化反应具有特异性。
光镜下在下丘的切片上观察到3种神经元：FOS阳性神经元、n-cNOS阳性神经元及FOS/n-cNOS双标记神经元。FOS阳性神经元胞核呈黑色，胞浆不着色，密集分布于下丘各部；n-cNOS阳性神经元胞核不着色，胞浆呈棕色，散在分布于下丘各部；此外,在下丘还可见到大量的n-cNOS阳性神经纤维；
FOS/n-cNOS双标记神经元胞核呈黑色，胞浆呈棕色，其主要分布于下丘的下丘臂核和中央外核。计数显示这种双标记细胞约占n-cNOS阳性神经元总数的10%。
c-fos原癌基因是脑内最主要的快反应原癌基因之一，它合成的FOS蛋白可作为传递神经元信息的第三信使，许多病理、生理性的刺激均可诱导FOS蛋白表达[7]。
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8 Hz、120 dB的次声作用2小时后，在下丘有大量FOS蛋白表达，提示：虽然在一般情况下次声是听不到的，但下丘对次声的作用仍很敏感。次声作用后出现FOS蛋白表达，神经元功能被激活，从而将次声刺激的信息传递到细胞内，最终与远期效应相偶联。
光镜下观察到FOS/n-cNOS双标记神经元，说明有部分n-cNOS神经元参与了对次声刺激的反应，并可能参与了次声诱导的下丘内FOS蛋白表达。存在于脑神经元细胞的n-cNOS是原生型NOS(constitutive NOS,cNOS)的一种，NOS催化L-精氨酸生成NO，NO作为一种重要的神经信息物质而倍受重视[8]。有作者认为：在受到外周刺激后，NOS阳性神经元释放NO，NO可以从神经元树突或轴突扩散到邻近神经元，激活鸟苷酸环化酶，进而激活cGMP通路，最终诱导周围神经元产生c-fos[9]；但也有相反的观点认为FOS表达在NOS表达之前[10]。次声作用下FOS与NOS表达的先后关系需进一步研究。
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同时本实验结果还可以看到：被激活的n-cNOS神经元仅占FOS阳性神经元较少的一部分(10%)，说明有其它神经元在次声的刺激下被激活，参与对次声作用反应和调节的因素是复杂的而不是单一的。
参考文献
[1] 陈景藻.次声的产生及生物学效应.医学卫生科学技术进展.北京：军事医学科学出版社，1997.194-197.
[2] Okamoto K.The influence of infrasound upon human body.Sangyo Ika Daigaku Zasshi,1986,8(Suppl):135-139.
[3] 赵乃坤.次声对动物生物学效应的研究.中华劳动卫生职业病杂志，1993，11：338-340.
[4] Nekhoroshev AS.Mechanism of the effect of infrasound on labyrinthine receptors.Kosm Bio Aviakosm Med,1990,24(6):39-43.
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[5] Takigawa H.Effects of infrasound on vestibular function.J Low Freq Noise Vib,1991,151:455-460.
[6] Нехорошев АС.Патологическое из менение в
слуховойзон-
екоры головного мозга вызыванное инфравуком.
Гиг и Сан，1992，(7-8)：62-65.
[7] Bullit E.Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat.J Comp Neurol,1990,296:517-530.
, 百拇医药
[8] Horald HHW.NO at work.Cell,1994,78:915-925.
[9] Lee JH,Drice RH,William FG,et al.Nitric oxide synthase is found in some spinothalamic neurons and in neuronal processes that appose spinal neurons that express FOS induced by noxious stimulation.Brain Res,1993,608:324-333.
[10] Eizirik DL,Bjorklund A,Welsh N.Interleukin-l-induced expression of nitric oxide synthase in insulin-producing cells is preceded by c-fos induction and depends on gene transcription and protein synthesis.FEBA Lett,1993,317(1-2):62-66.
(收稿：1998-04-28), 百拇医药
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院康复理疗科
关键词：次声；FOS；神经型一氧化氮合成酶；下丘
中华劳动卫生职业病杂志/990407 摘要 目的 研究次声对下丘的作用机制。 方法 用抗FOS蛋白和抗神经型一氧化氮合成酶(n-cNOS)免疫组织化学方法，将大鼠暴露于8 Hz、120 dB的次声中，持续 2小时，观察下丘FOS蛋白的表达情况及其与n-cNOS阳性神经元的关系。 结果 在下丘出现大量FOS样及散在的n-cNOS样免疫反应阳性神经元，且部分n-cNOS阳性神经元的胞核同时呈FOS染色阳性，这种FOS/n-cNOS双标记神经元约占FOS阳性神经元总数的10%。 结论 部分n-cNOS神经元参与对次声刺激的反应。
FOS expression in n-cNOS neurons of inferior colliculus following infrasonic
, 百拇医药
stimulation in rats
Xing Xiaohui,Chen Jingzao.Department of Physiotherapy,Xi Jing
Hospital,Xian 710032
Abstract Objective To determine the effect of infrasound on inferior colliculus. Methods FOS expression and the relationship with neural constitutive NOS(n-cNOS) immunoreactive neurons were studied by immunohistochemistry method in rats exposed to infrasound(8 Hz,120 dB) for 2 hours. Results FOS was strongly induced in the inferior colliculus,and about 10% of n-cNOS immunoreactive neurons were FOS positive.Conclusion Some n-cNOS immunoreactive neurons of the inferior colliculus are involved in the response to infrasound.
, 百拇医药
Key words Infrasound FOS n-cNOS Inferior colliculus
次声是频率为0.000 1～20 Hz的弹性波，是生产噪声和公共噪声的重要组成部分，作为环境污染因素的次声愈来愈受到关注[1]。文献报道不同频率、声压级的次声在不同作用时间下，可引起听觉系统形态、功能的改变[2-5]。有学者认为次声与可听声的作用机制是不同的，它可直接作用于中枢听觉系统引起共振，从而产生生物效应[6]。我们用抗FOS和神经型一氧化氮合成酶(neural cNOS,n-cNOS)双重免疫组织化学(ABC)法，观察次声刺激后下丘内神经元是否有FOS蛋白表达以及与n-cNOS神经元的关系。
材料与方法
成年健康雄性SD大鼠9只，体重250～300 g。实验前1周将动物领回喂养，置于安静、室温为18 ℃、自然光照的环境中，避免刺激，动物随机分为实验组(5只)和对照组(4只),对照组又分为空白对照(2只)和免疫组化染色对照(2只)。
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一、次声压力仓系统及动物模型
1.我校的次声压力仓系统采用电激励方式产生次声，该系统包括仓体、次声源及检测系统三部分，能产生频率0～20 Hz、声压90～129 dB稳定的次声。
2.动物模型的制作：将实验组5只动物置于次声压力仓内，暴露于8 Hz、120 dB的次声环境中，持续2小时，然后置于与实验前相同的环境中存活2小时。
二、切片制备和免疫组化反应
1.切片制备：动物均用1%戊巴比妥钠腹腔深度麻醉，开胸经升主动脉插管，100 ml生理盐水冲洗，继而灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)500 ml，持续1.5小时，取下丘置于20%蔗糖磷酸缓冲液过夜(4 ℃)，冰冻连续冠状切片，片厚30 μm，置于PBS内。
, 百拇医药 2.FOS免疫组化反应(ABC法)：(1)切片放入含0.3%H2O2-甲醇液(80%的甲醇配制)中，室温下30分钟，以封闭内源性的过氧化物酶；(2)用含0.3%Triton X-100的0.01 mol/L PBS(pH=7.4)浸泡30分钟；(3)加入兔抗FOS血清(1∶1 000，北京中山公司)，4 ℃48小时；(4)加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温4小时；(5)加入卵白素-生物素结合的HRP(ABC 1∶500，Sigma)，室温4小时。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS漂洗10分钟×3；最后葡萄糖-DAB-硫酸镍铵法显色，室温下反应10～15分钟。反应后切片继续进行n-cNOS免疫组化反应。
3.n-cNOS免疫组化反应(ABC法)：(1)切片经PBS洗涤后，加入兔抗n-cNOS血清(1∶2 000，Sigma)，4 ℃，48小时；(2)加入生物素化羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温4小时；(3)加入卵白素-生物素结合的HRP(ABC 1∶500，Sigma)，室温4小时(4)用葡萄糖-DAB法显色，裱片、晾干、脱水、透明、封固。 空白对照组大鼠置于次声压力仓内2小时，不启动次声声源，从次声仓内取出后存活2小时，然后直接灌注、固定、取材，行FOS免疫组化反应。免疫组化染色对照组动物的下丘切片分别用正常兔血清和PBS代替抗FOS抗体作孵育，其余步骤与实验组的动物一致。
, 百拇医药
结果与讨论
空白对照未见到FOS阳性神经元，说明在正常状态下丘内无FOS表达；免疫组化染色对照亦无FOS阳性神经元，说明免疫组化反应具有特异性。
光镜下在下丘的切片上观察到3种神经元：FOS阳性神经元、n-cNOS阳性神经元及FOS/n-cNOS双标记神经元。FOS阳性神经元胞核呈黑色，胞浆不着色，密集分布于下丘各部；n-cNOS阳性神经元胞核不着色，胞浆呈棕色，散在分布于下丘各部；此外,在下丘还可见到大量的n-cNOS阳性神经纤维；
FOS/n-cNOS双标记神经元胞核呈黑色，胞浆呈棕色，其主要分布于下丘的下丘臂核和中央外核。计数显示这种双标记细胞约占n-cNOS阳性神经元总数的10%。
c-fos原癌基因是脑内最主要的快反应原癌基因之一，它合成的FOS蛋白可作为传递神经元信息的第三信使，许多病理、生理性的刺激均可诱导FOS蛋白表达[7]。
, http://www.100md.com
8 Hz、120 dB的次声作用2小时后，在下丘有大量FOS蛋白表达，提示：虽然在一般情况下次声是听不到的，但下丘对次声的作用仍很敏感。次声作用后出现FOS蛋白表达，神经元功能被激活，从而将次声刺激的信息传递到细胞内，最终与远期效应相偶联。
光镜下观察到FOS/n-cNOS双标记神经元，说明有部分n-cNOS神经元参与了对次声刺激的反应，并可能参与了次声诱导的下丘内FOS蛋白表达。存在于脑神经元细胞的n-cNOS是原生型NOS(constitutive NOS,cNOS)的一种，NOS催化L-精氨酸生成NO，NO作为一种重要的神经信息物质而倍受重视[8]。有作者认为：在受到外周刺激后，NOS阳性神经元释放NO，NO可以从神经元树突或轴突扩散到邻近神经元，激活鸟苷酸环化酶，进而激活cGMP通路，最终诱导周围神经元产生c-fos[9]；但也有相反的观点认为FOS表达在NOS表达之前[10]。次声作用下FOS与NOS表达的先后关系需进一步研究。
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同时本实验结果还可以看到：被激活的n-cNOS神经元仅占FOS阳性神经元较少的一部分(10%)，说明有其它神经元在次声的刺激下被激活，参与对次声作用反应和调节的因素是复杂的而不是单一的。
参考文献
[1] 陈景藻.次声的产生及生物学效应.医学卫生科学技术进展.北京：军事医学科学出版社，1997.194-197.
[2] Okamoto K.The influence of infrasound upon human body.Sangyo Ika Daigaku Zasshi,1986,8(Suppl):135-139.
[3] 赵乃坤.次声对动物生物学效应的研究.中华劳动卫生职业病杂志，1993，11：338-340.
[4] Nekhoroshev AS.Mechanism of the effect of infrasound on labyrinthine receptors.Kosm Bio Aviakosm Med,1990,24(6):39-43.
, http://www.100md.com
[5] Takigawa H.Effects of infrasound on vestibular function.J Low Freq Noise Vib,1991,151:455-460.
[6] Нехорошев АС.Патологическое из менение в
слуховойзон-
екоры головного мозга вызыванное инфравуком.
Гиг и Сан，1992，(7-8)：62-65.
[7] Bullit E.Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat.J Comp Neurol,1990,296:517-530.
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[9] Lee JH,Drice RH,William FG,et al.Nitric oxide synthase is found in some spinothalamic neurons and in neuronal processes that appose spinal neurons that express FOS induced by noxious stimulation.Brain Res,1993,608:324-333.
[10] Eizirik DL,Bjorklund A,Welsh N.Interleukin-l-induced expression of nitric oxide synthase in insulin-producing cells is preceded by c-fos induction and depends on gene transcription and protein synthesis.FEBA Lett,1993,317(1-2):62-66.
(收稿：1998-04-28), 百拇医药