癌性肌病和线粒体脑肌病肌肉接头处的电镜研究
作者：宋东林 石进 吕强 张宏 谢仁厚 陈晋文 李恭
单位：100036 北京，中国人民解放军空军总医院神经内科(宋东林、石进、吕强、张宏、谢仁厚、陈晋文)；吉林医学院附属医院神经科(李恭)
关键词：线粒体脑肌病；神经肌肉接头；突触膜
中华医学杂志980711 【摘要】 目的 观察癌性肌病(LEMS)和线粒体脑肌病(MEMS)患者的神经肌肉接头处(NMJ)超微结构变化及临床意义。方法 应用HRP-α-BuTx标记经计算机图形扫描、医学图像与分析软件测量电镜照片中NMJ的各项指标并与对照组比较分析。结果 MEMS组与对照组除神经末端与突触后膜面积之比小外(P<0.05)，其它指标差异无显著意义。LEMS组的突触后膜长度和突触后膜与前膜长度之比大于对照组(P<0.01，P<0.001)，而神经末端与突触后膜面积之比小于对照组(P<0.05)。结论 MEMS时由于NMJ神经末端内线粒体损害致其面积变小，LEMS时NMJ的突触后膜延长、AchR增加。
, 百拇医药
Ultrastructural study on neuromuscular junction of patients with lambert-Eaton myasthenia syndrome or mitochondrial encephalomyopathy Song Donglin, Shi Jin, Lü Qiang, et al. Department of Neurology, Air Force General Hospital, Beijing 100036
【Abstract 】 Objective To study the ultrastructural changes of neuromuscular junction (NMJ) in patients with lambert-Eaton myasthenia syndrome (LEMS) and mitochondrial encephalomyopathy (MEMS). Methods The NMJ of internal intercostal muscles from patients with LEMS, MEMS or cardiac disease (control group) was labelled by HRP-BuTx and was quantitatively studied using image analysis system on electron microscopic photo. Results The ratio of nerve terminal area with postsynaptic memberane of NMJ was less in the MEMS group than controls. Both the length of presynaptic memberane and the ratio of the length of postsynaptic memberane to presynaptic memberane was larger in the LEMS group than in the MEMS group and controls, but the ratio of nerve terminal area with postsynaptic memberane area was less in the LEMS patients than in the MEMS group and controls. Conclusion The areas of nerve terminal in the MEMS patients shrink because of mitochondrial damage. In LEMS patients however, the major change is the elongation of postsynaptic memberane and increasing of Ach receptors.
, 百拇医药
【Key words 】 Mitochondrial encephalo-myopathies Neuromuscular junction Synaptic membranes
(Natl Med J China, 1998, 78:512-514)
在肌病时神经肌肉接头处(NMJ)变化十分重要，以往对癌性肌病(lambert-Eaton myasthenia syndrome, LEMS)和线粒体肌病或脑肌病(mitochondrial encephalo-myopathy, MEMS)时NMJ的报道较少。为此，我们将这两种疾病时NMJ的超微结构与对照组(Conl)进行比较观察，以探讨其发生机制。
对象与方法
一、对象
1.LEMS组：4例，男3例，女1例；年龄31～58岁。临床表现咳嗽、咳血、呼吸困难，四肢无力4～14个月，以近端为主，肌电图为肌源性改变。神经重复试验始发电位波幅0.7～0.9 mv，3 c/s刺激3秒时波幅下降10%～15%，20 c/s刺激10秒时波幅上升230%～600%。斯的明试验症状略有改善，血清AchRab(抗乙酰胆碱受体抗体)水平正常。经影像学、支气管镜检查确诊为肺癌并发LEMS。肺叶切除手术证实鳞癌1例，小细胞癌3例。
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2.MEMS组：1例，男，6岁，足月顺产。周岁时不能站立，2岁时扶持下行走，智能低下，说简单音节语言，3周岁起常无诱因四肢抽搐，口吐白沫，伴意识丧失1～3分钟。无家族史。发育欠佳，肌萎缩不明显。右侧肢体肌张力高，腱反射活跃，左侧肢体肌张力低下，两侧病理征阳性，共济运动检查不合作。肌电图呈神经元性改变。头颅CT扫描：大脑半球有多处低密度灶，血清低密度脂蛋白(LDL)340 mmol/L。临床考虑为线粒体脑肌病MELAS型。后因突然抽搐死亡。
3.对照组：4例，男女各2例，年龄8～21岁。其中先天性心脏病3例，风湿性二尖瓣膜病变1例，行心脏间隔修补或换瓣手术。
二、方法
1.标本的制作：肌组织均取自肋间内肌，固定于高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛液中。部份肌肉速冻制成10 nm切片，行HE、Gomoritrichrome染色(GT)、细胞色素丙氧化酶染色(CCO)、琥珀酸脱氢酶染色(NADH)等染色，显微镜观察。另一部份肌肉切成0.5 mm×0.5 mm×1.5 mm大小块，置于HRP-α-银环蛇毒素(HRP-α-BuTx)(日本岐阜药科大学提供)250倍稀释液中2小时，再以二氨基联苯胺(DBA)，H2O2显色。在光镜下选择NMJ多的组织后固定、脱水，包埋制成6 nm切片，双重染色，电镜下观察。
, 百拇医药
2.图象处理：电镜照片中NMJ清晰、结构完整的共134个，其中对照组51个，MEMS组32个，LEMS组51个。经图形处理仪扫描，用CMZAS医学图像分析系统测量突触后膜长度(mpos)、突触前膜长度(mpre)、神经末端面积(sn)、突触后膜面积(spos)(图1)。
3.数据处理及统计学方法：计算NMJ的mpos/mpre值、sn/spos值。应用SPLM线性拟合模型统计软件比较各组间的均值(方差分析)。行逐步判别分析(Bayer公式法)得出反应疾病的最佳指标。列出矩阵、求出各组判别的假阳性率和假阴性率[1]。根据C=(Conl组mpos-疾病组mpos)/Conl组mpos×100%，计算出突触后膜上AchR减少程度[2]。
, 百拇医药
结果
一、光镜观察
1.免疫组织化学染色：对照组肌纤维排列整齐，细胞核大小基本一致。LEMS组：肌纤维排列整齐，间质及血管轻度增生。MEMS组：肌纤维大小不等，GT染色中见有破碎红纤维(RRF)，占16%，其他染色中均有RRF样纤维[3]。
2.HRP-α-BuTx结合后，DBA.H2O2显色的NMJ清晰可见，3组差别无显著意义。
二、电镜下观察
对照组：肌纤维排列整齐，NMJ的结构完整(图1)。LEMS组：肌纤维糖原颗粒聚积，NMJ突触后膜皱折增多、延长(图2)。MEMS组：肌纤维膜下大小不等的线粒体内见结晶样包涵体，神经末端内的线粒体大小不等，数目减少(图3)。
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图1 对照组NMJ各部分结构完整、清晰 ×6 000
图2 LEMS组突触后膜皱折增多、延长 ×12 000
图3 MEMS组NMJ结构完整，神经末端内线粒体
大小、数目减少 ×1 600
三、3组mpos、mpre/mpre、mpre，sn、sn/spos、spos变化(见表1)
, http://www.100md.com 四、逐步判别分析
将4项测定值及两项比值作多变量逐步判别，设门坎值F=2，得知判别函数式为：
1. YConl=+3.7322E+00mpos/mpre+2.7070
表1 各组指标测定值(
±s) 组别
标本数
mpos(μm)
mpos/mpre
mpre(μm)
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sn(μm2)
sn/Spos
spos(μm2)
对照组
51
27.2±10.1
3.6±1.0
7.8±3.0
9.8±5.5
2.8±1.5
3.8±2.1
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癌性肌病组
51
31.2±12.3*
4.7±1.2**
6.8±2.4
7.3±4.6△
2.0±0.9△
3.7±2.3
线粒体脑肌病组
32
25.5±14.2
, 百拇医药
3.2±0.6
8.0±4.3
9.2±9.7△
2.4±1.3△
3.6±2.5
注：与对照组比较* P<0.01，**P<0.001，△ P<0.05
00sn/Spos-1.1270E+01；YLEMS=+4.5106E-00mpos/mpre+2.3285E+00sn/spos-1.3587E+01。判别函数假设检验，P<0.001。从方程式得出反映LEMS的NMJ变化最佳指标为mpos/mpre、sn/spos。将两组数据及比值回代列判别矩阵(表2)。
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表2 LEMS组与对照组判别矩阵(标本数) 判别分类
原始分类
对照组
肌无力综合征
合计
对照组
48
2
50
肌无力综合征
3
49
52
, 百拇医药
合计
51
51
102
注：假阳性率为5.88%，假阴性率1.96%
2.YConl=+5.4640E+00mpos/mpre+2.3323E+00sn/spos-1.3877E+01；YMEMS=+4.8224E+00mpos/mpre+1.9954E+00sn/spos-1.0810E+01。判别函数假设检验，P<0.001。从方程式中得出反映MEMS的NMJ变化最佳指标为mpos/mpre、sn/spos。将两组数据及比值回代列判别矩阵(表3)。
, 百拇医药
表3 MEMS与对照组判别矩阵(标本数) 判别分类
原始分类
对照组
线粒体肌病
合计
对照组
49
1
50
线粒体肌病
2
31
33
, 百拇医药
合计
51
32
83
注：假阳性率为3.92%，假阴性率3.12%
五、突触后膜上AchR减少指数
LEMS组与MEMS组突触后膜上AchR减少指数(C)分别为：CLEMS=(27.178-31.174)÷27.178×100%=-14.703%；CMEMS=(27.178-25.525)÷27.178×100%=6.082%
讨论
MEMS中的MELAS型发病年龄小，肌肉及中枢神经损害，血清LDH增高，肌活检见RRF和异常的线粒体。本病例符合上述改变。该病例NMJ的突触后膜、前膜长度，后、前膜长度之比，神经末端、突触后膜面积及后膜AchR变化与对照组比较差异均无显著意义，可见本病时NMJ改变不明显。其神经末端面积与突触后膜面积之比小于对照组，可能与神经末端内线粒体损害有关。
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LEMS是恶性肿瘤引起神经肌肉接头处非转移性病变而出现的肌无力综合征，以小细胞肺癌者中多见。有人曾用45Ca测定运动终板上有Ca2+通道抗体产生，神经末端囊泡内的Ach量子释放受阻，Ach产生也减少；若将患者血清注射给小鼠，动物则发生LEMS，突触前膜的Ca2+活动电位降低。因此认为，本病是自家免疫导致NMJ突触的Ca2+通道抗体产生，造成Ach释放和产生受阻所致[4]。病变的主要部位在NMJ的突触前膜和神经末端。
当LEMS出现在原发癌变之前，与其他疾病如慢性感染性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力、MEMS等鉴别困难时，NMJ检查就十分必要[5]。本组4例肺癌并发LEMS患者肌肉NMJ的突触后膜长度明显长于对照组。神经末端与突触后膜面积之比小于对照组，这些与Engel报道一致[6]。其原因可能是突触前膜Ach量子释放减少，为能更多地利用Ach以满足机体需要，突触后膜表现一种潜在代偿功能；也可能是突触后膜具有生长能力的表现。LEMS组的神经末端面积变小，可能与神经末端内部分Ach囊泡退行性变有关。综上所述，突触后膜的延长，突触后膜与前膜长度之比增大，后膜上AchR增多是LEMS有别于其他肌病的重要指标。
, 百拇医药
参考文献
1 郭祖超主编.医用数理统计方法.北京：人民卫生出版社，1988.458-465.
2 宋东林，吕强，石进，等.实验性重症肌无力大鼠神经肌肉接头处超微结构研究.中华神经精神科杂志，1994，27：135-137.
3 宋东林，吕强，石进，等.线粒体肌病和脑肌病PGA标记法免疫电镜研究.中华神经精神科杂志，1996，29：271-274.
4 Akihiro I. Neuroimmunological diseases. Tokyo: University of Tokyo, 1989. 353-362.
5 平山惠造.临床神经内科学.第2版.东京：南山堂出版社，1992. 466-475.
6 Engel AG, Santa T. Histometric analysis of the ultrastructure of the neuromuscular junction in myasthenia gravis and in the myasthenic syndrome. Ann N Y Acad Sci, 1971, 183:46-63.
(收稿：1998-02-23 修回：1998-03-30), 百拇医药
单位：100036 北京，中国人民解放军空军总医院神经内科(宋东林、石进、吕强、张宏、谢仁厚、陈晋文)；吉林医学院附属医院神经科(李恭)
关键词：线粒体脑肌病；神经肌肉接头；突触膜
中华医学杂志980711 【摘要】 目的 观察癌性肌病(LEMS)和线粒体脑肌病(MEMS)患者的神经肌肉接头处(NMJ)超微结构变化及临床意义。方法 应用HRP-α-BuTx标记经计算机图形扫描、医学图像与分析软件测量电镜照片中NMJ的各项指标并与对照组比较分析。结果 MEMS组与对照组除神经末端与突触后膜面积之比小外(P<0.05)，其它指标差异无显著意义。LEMS组的突触后膜长度和突触后膜与前膜长度之比大于对照组(P<0.01，P<0.001)，而神经末端与突触后膜面积之比小于对照组(P<0.05)。结论 MEMS时由于NMJ神经末端内线粒体损害致其面积变小，LEMS时NMJ的突触后膜延长、AchR增加。
, 百拇医药
Ultrastructural study on neuromuscular junction of patients with lambert-Eaton myasthenia syndrome or mitochondrial encephalomyopathy Song Donglin, Shi Jin, Lü Qiang, et al. Department of Neurology, Air Force General Hospital, Beijing 100036
【Abstract 】 Objective To study the ultrastructural changes of neuromuscular junction (NMJ) in patients with lambert-Eaton myasthenia syndrome (LEMS) and mitochondrial encephalomyopathy (MEMS). Methods The NMJ of internal intercostal muscles from patients with LEMS, MEMS or cardiac disease (control group) was labelled by HRP-BuTx and was quantitatively studied using image analysis system on electron microscopic photo. Results The ratio of nerve terminal area with postsynaptic memberane of NMJ was less in the MEMS group than controls. Both the length of presynaptic memberane and the ratio of the length of postsynaptic memberane to presynaptic memberane was larger in the LEMS group than in the MEMS group and controls, but the ratio of nerve terminal area with postsynaptic memberane area was less in the LEMS patients than in the MEMS group and controls. Conclusion The areas of nerve terminal in the MEMS patients shrink because of mitochondrial damage. In LEMS patients however, the major change is the elongation of postsynaptic memberane and increasing of Ach receptors.
, 百拇医药
【Key words 】 Mitochondrial encephalo-myopathies Neuromuscular junction Synaptic membranes
(Natl Med J China, 1998, 78:512-514)
在肌病时神经肌肉接头处(NMJ)变化十分重要，以往对癌性肌病(lambert-Eaton myasthenia syndrome, LEMS)和线粒体肌病或脑肌病(mitochondrial encephalo-myopathy, MEMS)时NMJ的报道较少。为此，我们将这两种疾病时NMJ的超微结构与对照组(Conl)进行比较观察，以探讨其发生机制。
对象与方法
一、对象
1.LEMS组：4例，男3例，女1例；年龄31～58岁。临床表现咳嗽、咳血、呼吸困难，四肢无力4～14个月，以近端为主，肌电图为肌源性改变。神经重复试验始发电位波幅0.7～0.9 mv，3 c/s刺激3秒时波幅下降10%～15%，20 c/s刺激10秒时波幅上升230%～600%。斯的明试验症状略有改善，血清AchRab(抗乙酰胆碱受体抗体)水平正常。经影像学、支气管镜检查确诊为肺癌并发LEMS。肺叶切除手术证实鳞癌1例，小细胞癌3例。
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2.MEMS组：1例，男，6岁，足月顺产。周岁时不能站立，2岁时扶持下行走，智能低下，说简单音节语言，3周岁起常无诱因四肢抽搐，口吐白沫，伴意识丧失1～3分钟。无家族史。发育欠佳，肌萎缩不明显。右侧肢体肌张力高，腱反射活跃，左侧肢体肌张力低下，两侧病理征阳性，共济运动检查不合作。肌电图呈神经元性改变。头颅CT扫描：大脑半球有多处低密度灶，血清低密度脂蛋白(LDL)340 mmol/L。临床考虑为线粒体脑肌病MELAS型。后因突然抽搐死亡。
3.对照组：4例，男女各2例，年龄8～21岁。其中先天性心脏病3例，风湿性二尖瓣膜病变1例，行心脏间隔修补或换瓣手术。
二、方法
1.标本的制作：肌组织均取自肋间内肌，固定于高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛液中。部份肌肉速冻制成10 nm切片，行HE、Gomoritrichrome染色(GT)、细胞色素丙氧化酶染色(CCO)、琥珀酸脱氢酶染色(NADH)等染色，显微镜观察。另一部份肌肉切成0.5 mm×0.5 mm×1.5 mm大小块，置于HRP-α-银环蛇毒素(HRP-α-BuTx)(日本岐阜药科大学提供)250倍稀释液中2小时，再以二氨基联苯胺(DBA)，H2O2显色。在光镜下选择NMJ多的组织后固定、脱水，包埋制成6 nm切片，双重染色，电镜下观察。
, 百拇医药
2.图象处理：电镜照片中NMJ清晰、结构完整的共134个，其中对照组51个，MEMS组32个，LEMS组51个。经图形处理仪扫描，用CMZAS医学图像分析系统测量突触后膜长度(mpos)、突触前膜长度(mpre)、神经末端面积(sn)、突触后膜面积(spos)(图1)。
3.数据处理及统计学方法：计算NMJ的mpos/mpre值、sn/spos值。应用SPLM线性拟合模型统计软件比较各组间的均值(方差分析)。行逐步判别分析(Bayer公式法)得出反应疾病的最佳指标。列出矩阵、求出各组判别的假阳性率和假阴性率[1]。根据C=(Conl组mpos-疾病组mpos)/Conl组mpos×100%，计算出突触后膜上AchR减少程度[2]。
, 百拇医药
结果
一、光镜观察
1.免疫组织化学染色：对照组肌纤维排列整齐，细胞核大小基本一致。LEMS组：肌纤维排列整齐，间质及血管轻度增生。MEMS组：肌纤维大小不等，GT染色中见有破碎红纤维(RRF)，占16%，其他染色中均有RRF样纤维[3]。
2.HRP-α-BuTx结合后，DBA.H2O2显色的NMJ清晰可见，3组差别无显著意义。
二、电镜下观察
对照组：肌纤维排列整齐，NMJ的结构完整(图1)。LEMS组：肌纤维糖原颗粒聚积，NMJ突触后膜皱折增多、延长(图2)。MEMS组：肌纤维膜下大小不等的线粒体内见结晶样包涵体，神经末端内的线粒体大小不等，数目减少(图3)。
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图1 对照组NMJ各部分结构完整、清晰 ×6 000
图2 LEMS组突触后膜皱折增多、延长 ×12 000
图3 MEMS组NMJ结构完整，神经末端内线粒体
大小、数目减少 ×1 600
三、3组mpos、mpre/mpre、mpre，sn、sn/spos、spos变化(见表1)
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将4项测定值及两项比值作多变量逐步判别，设门坎值F=2，得知判别函数式为：
1. YConl=+3.7322E+00mpos/mpre+2.7070
表1 各组指标测定值(
±s) 组别标本数
mpos(μm)
mpos/mpre
mpre(μm)
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sn(μm2)
sn/Spos
spos(μm2)
对照组
51
27.2±10.1
3.6±1.0
7.8±3.0
9.8±5.5
2.8±1.5
3.8±2.1
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癌性肌病组
51
31.2±12.3*
4.7±1.2**
6.8±2.4
7.3±4.6△
2.0±0.9△
3.7±2.3
线粒体脑肌病组
32
25.5±14.2
, 百拇医药
3.2±0.6
8.0±4.3
9.2±9.7△
2.4±1.3△
3.6±2.5
注：与对照组比较* P<0.01，**P<0.001，△ P<0.05
00sn/Spos-1.1270E+01；YLEMS=+4.5106E-00mpos/mpre+2.3285E+00sn/spos-1.3587E+01。判别函数假设检验，P<0.001。从方程式得出反映LEMS的NMJ变化最佳指标为mpos/mpre、sn/spos。将两组数据及比值回代列判别矩阵(表2)。
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表2 LEMS组与对照组判别矩阵(标本数) 判别分类
原始分类
对照组
肌无力综合征
合计
对照组
48
2
50
肌无力综合征
3
49
52
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合计
51
51
102
注：假阳性率为5.88%，假阴性率1.96%
2.YConl=+5.4640E+00mpos/mpre+2.3323E+00sn/spos-1.3877E+01；YMEMS=+4.8224E+00mpos/mpre+1.9954E+00sn/spos-1.0810E+01。判别函数假设检验，P<0.001。从方程式中得出反映MEMS的NMJ变化最佳指标为mpos/mpre、sn/spos。将两组数据及比值回代列判别矩阵(表3)。
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表3 MEMS与对照组判别矩阵(标本数) 判别分类
原始分类
对照组
线粒体肌病
合计
对照组
49
1
50
线粒体肌病
2
31
33
, 百拇医药
合计
51
32
83
注：假阳性率为3.92%，假阴性率3.12%
五、突触后膜上AchR减少指数
LEMS组与MEMS组突触后膜上AchR减少指数(C)分别为：CLEMS=(27.178-31.174)÷27.178×100%=-14.703%；CMEMS=(27.178-25.525)÷27.178×100%=6.082%
讨论
MEMS中的MELAS型发病年龄小，肌肉及中枢神经损害，血清LDH增高，肌活检见RRF和异常的线粒体。本病例符合上述改变。该病例NMJ的突触后膜、前膜长度，后、前膜长度之比，神经末端、突触后膜面积及后膜AchR变化与对照组比较差异均无显著意义，可见本病时NMJ改变不明显。其神经末端面积与突触后膜面积之比小于对照组，可能与神经末端内线粒体损害有关。
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LEMS是恶性肿瘤引起神经肌肉接头处非转移性病变而出现的肌无力综合征，以小细胞肺癌者中多见。有人曾用45Ca测定运动终板上有Ca2+通道抗体产生，神经末端囊泡内的Ach量子释放受阻，Ach产生也减少；若将患者血清注射给小鼠，动物则发生LEMS，突触前膜的Ca2+活动电位降低。因此认为，本病是自家免疫导致NMJ突触的Ca2+通道抗体产生，造成Ach释放和产生受阻所致[4]。病变的主要部位在NMJ的突触前膜和神经末端。
当LEMS出现在原发癌变之前，与其他疾病如慢性感染性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力、MEMS等鉴别困难时，NMJ检查就十分必要[5]。本组4例肺癌并发LEMS患者肌肉NMJ的突触后膜长度明显长于对照组。神经末端与突触后膜面积之比小于对照组，这些与Engel报道一致[6]。其原因可能是突触前膜Ach量子释放减少，为能更多地利用Ach以满足机体需要，突触后膜表现一种潜在代偿功能；也可能是突触后膜具有生长能力的表现。LEMS组的神经末端面积变小，可能与神经末端内部分Ach囊泡退行性变有关。综上所述，突触后膜的延长，突触后膜与前膜长度之比增大，后膜上AchR增多是LEMS有别于其他肌病的重要指标。
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参考文献
1 郭祖超主编.医用数理统计方法.北京：人民卫生出版社，1988.458-465.
2 宋东林，吕强，石进，等.实验性重症肌无力大鼠神经肌肉接头处超微结构研究.中华神经精神科杂志，1994，27：135-137.
3 宋东林，吕强，石进，等.线粒体肌病和脑肌病PGA标记法免疫电镜研究.中华神经精神科杂志，1996，29：271-274.
4 Akihiro I. Neuroimmunological diseases. Tokyo: University of Tokyo, 1989. 353-362.
5 平山惠造.临床神经内科学.第2版.东京：南山堂出版社，1992. 466-475.
6 Engel AG, Santa T. Histometric analysis of the ultrastructure of the neuromuscular junction in myasthenia gravis and in the myasthenic syndrome. Ann N Y Acad Sci, 1971, 183:46-63.
(收稿：1998-02-23 修回：1998-03-30), 百拇医药