短波紫外线与交联淀粉碘对血浆中辛德比斯病毒灭活的研究
作者：熊鸿燕 刘育京* 涂瀛
单位：熊鸿燕 刘育京 涂瀛 (第三军医大学预防医学系，重庆 400038)
关键词：短波紫外线；交联淀粉碘；血浆消毒；病毒灭活；辛德比斯病毒
中国消毒学杂志980401
提 要 对UVC与CSI分别对血浆中病毒灭活的效果和对血浆中F Ⅷ凝血活性的影响进行了观察。CSI按100 mg/ml加入血浆，作用30 min与60 min，能使SV分别下降2.55与3.61个对数级，但血浆F Ⅷ凝血活性亦分别降至57.33%和0；继续延长作用时间至120 min，灭活病毒的效果增加不明显。用剂量为7 170～57 360 J/m2的UVC照射血浆，可使SV下降4.26～6.71个对数级。照射剂量为7 170 J/m2时，病毒灭活速度较快，F Ⅷ凝血活性也无损害，但超过此剂量后的病毒下降速度减缓，而对F Ⅷ凝血活性的损害明显加重。
, 百拇医药
STUDY ON INACTIVATION OF SINDBIS VIRUS IN PLASMA BY SHORT-#CWAVE
ULTRAVIOLET RAYS AND CROSS-LINKED STARCH IODINE
Xiong Hongyan Liu Yujing* Tu Ying
(Faculty of Preventive Medicine, Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract The efficacy of short-wave ultraviolet rays (UVC) and cross-linked starch iodine (CSI) in inactivating respectively Sindbis Virus in plasma and their influence on activity of Factor Ⅷ of the plasma were observed experimentally.
, http://www.100md.com
The results indicated that addition of CSI 100 mg/ml to plasma with contact time of 30, 60, 90 and 120 min could reduce Sindbis Virus (SV) in plasma by log 2.55, 3.61, 3.83 and 3.83 respectively, but the coagulation activity of plasma Factor Ⅷ decreased to 57.33% and 0 with 30 min and 60 min contact time respectively. Irradiation of plasma with UVC at dosages of 7 170～57 360 J/m2 could reduce SV by log 4.26～6.71. Irradiation with dosage of 7 170 J/m2 could inactivate the virus rapidly and was essentially harmless to the activity of Factor Ⅷ, while the dosages higher than this showed decreased speed of inactivating the virus and had significant injurious effect on coagulating activity of Factor Ⅷ.
, http://www.100md.com
Key words Kshort-wave ultraviolet rays cross-linked starch iodine disinfection of blood inactivation of virus Sindbis Virus
短波紫外线(UVC)和碘复合物(IC)均为常用的杀菌因子，国外学者的研究显示，UVC和IC对病毒均有良好的灭活作用，同时能较好地保存血液成分[1～3]。为探索有效的血浆消毒方法，观察了UVC与交联淀粉碘(CSI)分别对血浆中辛德比斯病毒(SV)灭活的效果和对血浆中第八凝血因子活性的影响。
1 方法
1.1细胞培养和病毒滴定
1.1.1 BHK-13细胞的培养 BHK-13细胞采用DMEM培养液进行培养。培养箱中二氧化碳浓度为5%。正常细胞经0.25%胰蛋白酶消化后接种传代，24～28 h后可形成单层细胞。细胞形态用倒置显微镜观察(放大100×)。
, 百拇医药
1.1.2 SV的增殖与滴定 增殖SV时，将含SV原液用D-Hank液10倍稀释。取2 ml稀释液加入长满单层BHK-13细胞的40 cm2空斑瓶内，摇匀。37℃下吸附2 h，弃上清液，再加入10 ml培养液继续培养。当细胞病变效应(CPE)达+++以上时，收集细胞悬液，存放于-70℃。
CPE分级标准是：“+”为少于25%的细胞出现CPE；“++”为大于25%，少于50%细胞出现CPE；“+++”为50%～70%的细胞出现CPE；“++++”为大于75%的细胞出现CPE[4]。
将收集的病变细胞悬液在-20℃反复冻熔3次，-4℃下离心(5 000 r/min)10 min。将上清液装入灭菌的透吸袋(D 21 mm，8 000～10 000 MW)，用聚乙二醇(PEG)粉包埋。4 h后用1 ml离心管分装浓缩的病毒悬液，置-70℃冻存。
, http://www.100md.com SV的滴定采用组织培养半数感染量法(Tissue Culture Infection Dose, TCID50)。用96孔细胞培养板做细胞培养。等细胞长满呈致密单层后弃培养液，用D-Hank液洗涤细胞，然后每孔加入0.1 ml用DMEM液稀释的不同稀释度SV液，每个稀释度平行接种4孔。常规条件下吸附4 h后弃DMEM液，再加入细胞培养液继续培养并观察CPE。根据Reed-Muench方法计算病毒的TCID50[4]。
1.2 #FK含病毒血浆的准备
将供血者的新鲜血浆(西南医院输血科提供)立即分装，-20℃保存。试验前，将冷冻血浆经37℃水浴迅速溶解。将病毒悬液用DMEM液适当稀释，以1∶10的比例加入血浆，使病毒含量约为7～8 lg TCID50。
1.3 #FK血浆消毒方法
, 百拇医药
1.3.1 不同因素对CSI消毒血浆的影响观察
1.3.1.1 CSI消毒血浆的回收量测定 分别取200 mg、400 mg和500 mg的CSI与2 ml崐血浆混悬60 min，离心，用1 ml针管吸取上层血浆并观察其回收量。
1.3.1.2 CSI对血浆中病毒灭活的正交试验 按正交设计(表1)，在不同温度下，将不同剂量CSI(为本单位自制的，不溶于水，有效碘含量为6.393 mg/1 000 mg的载碘淀粉颗粒)与含病毒血浆混悬(混悬速度约20～30 r/min)。作用不同时间后，离心(4 000 r/min)1 min，分离血浆进行病毒含量测定。
表1 CSI对血浆中SV灭活正交试验设计
Table1 Design of orthogonal test for inacti-
, 百拇医药
vation of SV in plasma by CSI 组号
Group
(A)
CSI剂量
CSIdose
(mg/ml)
(B)
作用温度
Temperature
(℃)
(C)
作用时间
, 百拇医药
Contact time
(min)
1
125
4
30
2
125
25
45
3
125
37
, http://www.100md.com
60
4
200
4
60
5
200
25
30
6
200
37
45
7
, http://www.100md.com
250
4
45
8
250
25
60
9
250
37
30
1.3.1.3 一定剂量CSI作用不同时间对血浆中病毒的灭活效果观察 以100 mg/ml的比例加CSI于血浆中。在室温(20～25℃)下，分别作用30 min、60 min、90 min和120 min，离心，分离血浆进行病毒含量测定。
, 百拇医药
1.3.2 UVC对血浆中病毒的灭活试验
将含病毒的血浆以0.5 ml/孔的比例加入20 mm直径的细胞培养板孔中(血浆厚度2 mm)。将培养板置冰块上，以无臭氧紫外线灯照射(辐照度值为2 390 μW/cm2)不同时间。照射时控制温度在18～20℃，同时人工摇动，使血浆可被均匀照射。于照射处理前、后，分别收集血浆作病毒含量测定。UVC照射剂量计算单位为 J/m2。
结果的判断，以含病毒血浆吸附细胞后，连续7 d无CPE者为阴性。对可疑细胞进行传代，再连续培养7 d，无CPE者为阴性。按TCID50计算病毒减少量对数值〔4〕。
病毒减少量对数值=对照组病毒含量对数值 - 试验组病毒含量对数值。
1.4 F Ⅷ #FK凝血活性测定
, 百拇医药
1.4.1 缺F Ⅷ基质血浆的制备 将正常人的枸橼酸盐抗凝血浆(西南医院输血科提供)在37℃水浴中保持24 h(此时所得F Ⅷ凝血活性小于0.1%)，然后小量分装，置-20℃保存。
1.4.2 制备各种稀释度正常人血浆标准曲线 按一期法〔5〕，取20名以上健康人混合新鲜枸橼酸盐抗凝血浆(西南医院输血科提供)，用咪唑-枸橼酸缓冲液作10、20、40、80、160、320、640、1 280的倍数稀释，各吸取0.1 ml，然后加入缺F Ⅷ的基质血浆0.1 ml、0.05 mol/L氯化钙0.1 ml、0.5%白陶土。置37℃预温2～3 min，加入预温的适当稀释的部分凝血活酶液0.1 ml，混匀。立即开始计时，观察记录血浆凝固时间。在双对数纸上以凝固时间(s)为崐纵坐标，以血浆中F Ⅷ浓度为横坐标绘制标准曲线。
1.4.3 空白测定 取缺F Ⅷ的基质血浆(作为空白样品)0.1 ml，并加入咪唑缓冲液、部分凝血活酶缓冲液、白陶土和氯化钙溶液等各0.1 ml，混匀。按上述方法测定血浆凝固时间。调整部分凝血活酶的浓度，使凝固时间在240～250 s。
, 百拇医药
1.4.4 样本测定 将分别经UVC与CSI法消毒的血浆作为试验样品，以在37℃预温30 min、60 min、90 min和120 min的正常血浆为对照样品。将血浆样本用咪唑-枸橼酸缓冲液以1∶10的比例稀释，以其代替咪唑-枸橼酸缓冲液，按空白测定方法测定血浆凝固时间。查找标准曲线，计算F Ⅷ浓度，观察血浆中F Ⅷ凝血活性的变化。
1.5 #FK数据处理
正交试验统计检验按徐吉民的〔6〕正交试验统计方法进行级差(R值)和方差分析。其它部分数据使用MicroCal Origin 2.94软件程序和SAS软件程序在计算机上进行多因素方差分析及指数回归方程计算。
2 结果
2.1 不同因素对CSI消毒血浆效果的影响
2.1.1 消毒血浆的回收量 加入2 ml血浆的CSI量分别为100 mg/ml、200 mg/ml和250 mg/ml时，血浆回收率分别为85%、60%和51%(表2)。这可能是CSI吸收水份所导致的结果。因此，在实用中，CSI用量宜控制在100 mg/ml左右，否则血浆回收量过少。
, 百拇医药
表2 CSI加入量对消毒后血浆回收量的影响
Table2 Influence of amount of CSI added on
recovery of plasma after disinfection CSI加入量
Amount of CSI added
(mg/ml)
回收血浆量
Amount of pladms recovered
(ml，X±SD)
回收率
, http://www.100md.com Recovery rate
(%)
100
1.69±0.04
85
200
1.20±0.03
60
250
1.01±0.09
51
注： 各组加入血浆量均为2.00 ml。
, http://www.100md.com
Note: The amount of plasma added was 2.00 ml in
any group.
2.1.2 CSI对血浆中SV的灭活效果 正交试验结果(表3)，CSI含量、作用时间和作用温度3因素级差(R值)分别为1.67，1.09和0.23。这说明CSI含量和作用时间在灭活SV过程中具有决定性作用，而温度则影响不大。方差分析也显示，F(A)为57.16，F(C)为25.65，即CSI含量和作用时间的不同使病毒的灭活效果不同(P < 0.01)。
表3 CSI对血浆中SV灭活的正交试验结果
Table3 Results of orthogonal test for inac
tivation of SV in plasma by CSI 试验序号
, http://www.100md.com
Test No.
(A)
CSI含量
CSI content
(mg/ml)
(B)
作用温度
Temperature
(℃)
(C)
作用时间
Contact time
, 百拇医药
(min)
病毒减少量
Reduction of virus
(lg)
1
125
4
30
2.22
2
125
25
45
, http://www.100md.com
2.44
3
125
37
60
3.28
4
200
4
60
4.11
5
200
25
, 百拇医药
30
3.11
6
200
37
45
3.78
7
250
4
45
3.94
8
250
, http://www.100md.com
25
60
5.11
9
250
37
30
3.89
注： 阳性对照组病毒滴度为7.111 lg TCID50。
Note: The virus titer of positive control gruop was
7.111 lg TCID50.
, 百拇医药
R(A)= 1.67，R(B)= 0.23，R(C)= 1.09；
F(A)= 57.16，F(C)= 25.65。
T = 31.88，CT = 112.93。
虽然增加CSI用量可提高CSI灭活血浆中SV病毒的效果，但考虑到血浆回收量，在用CSI消毒血浆时应控制其用量。由于4～37℃温度的变化对病毒的灭活影响较小，试验在室温下即可进行。
在室温下，按100 mg/ml将CSI加入血浆，混悬。作用30、60、90、120 min时，可分别灭活病毒2.55、3.61、3.83、3.83个对数级。根据方差分析，CSI的作用时间在60 min以内，病毒灭活效果增加(F=17.68， P< 0.01)；60 min以后，未见病毒数量有显著差异(F=2.14， P > 0.05)。病毒存活量(Y) 与作用时间(X)呈指数曲线分布(图1)。由此，单用CSI消毒血浆时，作用时间不必超过60 min。
, 百拇医药
图1 血浆中SV的存活量与CSI作用时间的回归曲线
Fig 1 Regression curve of contact time of CSI
and surviving SV in plasma
2.2 UVC#FK对血浆中SV#FK的灭活效果
以辐照度值为2 390 μW/cm2的UVC照射含SV血浆。照射5 min(剂量为7 170 J/m2)时，病毒减少4.26个对数级，照射5 min以后病毒下降减缓，照射10、20、30、40 min，病毒分别减少4.50个对数级、5.50个对数级、6.11个对数级与6.71个对数级。病毒存活量(Y)随照射时间 (X) 延长，亦呈指数曲线分布(图2)。
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图2 血浆中SV存活量与UVC照射时间的回归曲线
Fig 2 Regression curve of UVC exposure time
and surviving SV in plasma
2.3 #FK血浆中F Ⅷ#FK凝血活性变化
经CSI(100 mg/ml)处理10 min的血浆，F Ⅷ凝血活性仅存57.33%；作用60 min者已降至零。用辐照度值为2 390 μW/cm2的UVC照射血浆5 min(剂量为7 170 J/m2)、10 min(14 340 J/m2)和20 min(28 680 J/m2)，Ⅷ凝血活性保存分别为85.19%、73.42%和54.70%(表4)。与放置室温下的正常血浆对比，CSI对F Ⅷ凝血活性损害很大；7 170 J/m2的UVC照射对F Ⅷ凝血活性基本无损害，照射剂量为14 340 J/m2与26 680 J/m2时，F Ⅷ凝血活性将分别降低约10%与28%。为此，应控制UVC照射剂量。
, 百拇医药
表4 不同处理后血浆中F Ⅷ凝血活性的变化
Table4 Changes in coagulating activity of plasma Factor Ⅷ after
different treatments 组别
Group
处理不同时间(min)血浆中F Ⅷ凝血活性(%)
Coagulating activity(%) of plasma Factor Ⅶ after treatment
for different periods of tine(min)
0
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5
10
20
30
60
90
在室温下放置
Standing at room temperature
86.41
86.18……
83.10
84.75
83.78
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经100mg/mlCSI作用
After exposure to100mg/ml CSI……
57.33……
0.00…
经2 390μW/cm2 UVC照射
After exposure to 2 390μW/cm2 UVC…
85.19
73.42
54.70………
3 讨论
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3.1 试验结果，用CSI处理血浆时，病毒灭活剂量与CSI含量和作用时间(30～60 min以内)呈明显的相关效应，而受作用温度(4～37℃)影响较小。鉴于血浆的回收率，CSI加入血浆的比例宜为100 mg/ml。此时，60 min能使SV下降3.61个对数级，但F Ⅷ凝血活性已降至零；继续延长作用时间至120 min，灭活病毒的效果增加不明显。
用UVC照射血浆时，剂量为7 170～57 360 J/m2的UVC可使SV下降4.26～6.71个对数级。在照射剂量为7 170 J/m2时，病毒被灭活的速度较快，F Ⅷ凝血活性也无损害。超过此剂量后的病毒下降速度减缓，且对F Ⅷ凝血活性的损害明显加重。
上述结果表明，对F Ⅷ凝血活性的保存，UVC照射法比CSI处理法好，但两种方法灭活病毒的彻底性均有限。
3.2 本试验中，用CSI消毒血浆后，检测病毒时未用中和剂。原因是CSI不溶于水，经离心后可从血浆中除去。并且预试验亦表明，用硫代硫酸钠(I2的中和剂)溶液组与用生理盐水组的病毒计数无明显差别。
, 百拇医药
3.3 温度为4～37℃对CSI灭活病毒效果无明显影响，可能因血浆中含大量蛋白质，抑制了温度效应所致。其机理尚待探讨。
*军事医学科学院微生物流行病研究所
参考文献
〔1〕 Marx G, Mou X, Freed R, et al. Protecting fibrinogen with rutin during UVC irradiation for viral inactivation. Photochem Photobiol 1996; 63 (4) : 541.
〔2〕 Highsmith FA, Xue H, Caple M, et al. Viral inactivation of vesicular stomatitis virus in normal Human Serum by cross-linked polyvinylpyrrolidone. J Infect Dis 1993; 167: 1027. ?amp;
, 百拇医药
〔3〕 Hart H, Reid K and Hart W. Inactivation of viruses during ultraviolet light treatmeat of human intravenous immunoglobulin and albumin. Vox Sang 1993; 64: 8211.
〔4〕 黄祯祥. 医学病毒学基础及实验技术. 北京： 科学出版社， 1990: 1304.
〔5〕 朱忠勇. 实验医学检验学. 北京： 人民军医出版社， 1992: 135.
〔6〕 徐吉明. 正交法在医药科研中的应用. 北京： 中国医药科技出版社， 1986: 31～133.
〔7〕 Highsmith FA, Xue H, Caple M, et al. Inactivation of lipid-enveloped and non-lipid-enveloped model viruses in normal human plasma by crosslinked starch-iodine. Tnansfusion 1994; 34 (4) : 322.
(1997-11-03收稿 1998-05-10修回), http://www.100md.com(熊鸿燕 刘育京* 涂瀛)
单位：熊鸿燕 刘育京 涂瀛 (第三军医大学预防医学系，重庆 400038)
关键词：短波紫外线；交联淀粉碘；血浆消毒；病毒灭活；辛德比斯病毒
中国消毒学杂志980401
提 要 对UVC与CSI分别对血浆中病毒灭活的效果和对血浆中F Ⅷ凝血活性的影响进行了观察。CSI按100 mg/ml加入血浆，作用30 min与60 min，能使SV分别下降2.55与3.61个对数级，但血浆F Ⅷ凝血活性亦分别降至57.33%和0；继续延长作用时间至120 min，灭活病毒的效果增加不明显。用剂量为7 170～57 360 J/m2的UVC照射血浆，可使SV下降4.26～6.71个对数级。照射剂量为7 170 J/m2时，病毒灭活速度较快，F Ⅷ凝血活性也无损害，但超过此剂量后的病毒下降速度减缓，而对F Ⅷ凝血活性的损害明显加重。
, 百拇医药
STUDY ON INACTIVATION OF SINDBIS VIRUS IN PLASMA BY SHORT-#CWAVE
ULTRAVIOLET RAYS AND CROSS-LINKED STARCH IODINE
Xiong Hongyan Liu Yujing* Tu Ying
(Faculty of Preventive Medicine, Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract The efficacy of short-wave ultraviolet rays (UVC) and cross-linked starch iodine (CSI) in inactivating respectively Sindbis Virus in plasma and their influence on activity of Factor Ⅷ of the plasma were observed experimentally.
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The results indicated that addition of CSI 100 mg/ml to plasma with contact time of 30, 60, 90 and 120 min could reduce Sindbis Virus (SV) in plasma by log 2.55, 3.61, 3.83 and 3.83 respectively, but the coagulation activity of plasma Factor Ⅷ decreased to 57.33% and 0 with 30 min and 60 min contact time respectively. Irradiation of plasma with UVC at dosages of 7 170～57 360 J/m2 could reduce SV by log 4.26～6.71. Irradiation with dosage of 7 170 J/m2 could inactivate the virus rapidly and was essentially harmless to the activity of Factor Ⅷ, while the dosages higher than this showed decreased speed of inactivating the virus and had significant injurious effect on coagulating activity of Factor Ⅷ.
, http://www.100md.com
Key words Kshort-wave ultraviolet rays cross-linked starch iodine disinfection of blood inactivation of virus Sindbis Virus
短波紫外线(UVC)和碘复合物(IC)均为常用的杀菌因子，国外学者的研究显示，UVC和IC对病毒均有良好的灭活作用，同时能较好地保存血液成分[1～3]。为探索有效的血浆消毒方法，观察了UVC与交联淀粉碘(CSI)分别对血浆中辛德比斯病毒(SV)灭活的效果和对血浆中第八凝血因子活性的影响。
1 方法
1.1细胞培养和病毒滴定
1.1.1 BHK-13细胞的培养 BHK-13细胞采用DMEM培养液进行培养。培养箱中二氧化碳浓度为5%。正常细胞经0.25%胰蛋白酶消化后接种传代，24～28 h后可形成单层细胞。细胞形态用倒置显微镜观察(放大100×)。
, 百拇医药
1.1.2 SV的增殖与滴定 增殖SV时，将含SV原液用D-Hank液10倍稀释。取2 ml稀释液加入长满单层BHK-13细胞的40 cm2空斑瓶内，摇匀。37℃下吸附2 h，弃上清液，再加入10 ml培养液继续培养。当细胞病变效应(CPE)达+++以上时，收集细胞悬液，存放于-70℃。
CPE分级标准是：“+”为少于25%的细胞出现CPE；“++”为大于25%，少于50%细胞出现CPE；“+++”为50%～70%的细胞出现CPE；“++++”为大于75%的细胞出现CPE[4]。
将收集的病变细胞悬液在-20℃反复冻熔3次，-4℃下离心(5 000 r/min)10 min。将上清液装入灭菌的透吸袋(D 21 mm，8 000～10 000 MW)，用聚乙二醇(PEG)粉包埋。4 h后用1 ml离心管分装浓缩的病毒悬液，置-70℃冻存。
, http://www.100md.com SV的滴定采用组织培养半数感染量法(Tissue Culture Infection Dose, TCID50)。用96孔细胞培养板做细胞培养。等细胞长满呈致密单层后弃培养液，用D-Hank液洗涤细胞，然后每孔加入0.1 ml用DMEM液稀释的不同稀释度SV液，每个稀释度平行接种4孔。常规条件下吸附4 h后弃DMEM液，再加入细胞培养液继续培养并观察CPE。根据Reed-Muench方法计算病毒的TCID50[4]。
1.2 #FK含病毒血浆的准备
将供血者的新鲜血浆(西南医院输血科提供)立即分装，-20℃保存。试验前，将冷冻血浆经37℃水浴迅速溶解。将病毒悬液用DMEM液适当稀释，以1∶10的比例加入血浆，使病毒含量约为7～8 lg TCID50。
1.3 #FK血浆消毒方法
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1.3.1 不同因素对CSI消毒血浆的影响观察
1.3.1.1 CSI消毒血浆的回收量测定 分别取200 mg、400 mg和500 mg的CSI与2 ml崐血浆混悬60 min，离心，用1 ml针管吸取上层血浆并观察其回收量。
1.3.1.2 CSI对血浆中病毒灭活的正交试验 按正交设计(表1)，在不同温度下，将不同剂量CSI(为本单位自制的，不溶于水，有效碘含量为6.393 mg/1 000 mg的载碘淀粉颗粒)与含病毒血浆混悬(混悬速度约20～30 r/min)。作用不同时间后，离心(4 000 r/min)1 min，分离血浆进行病毒含量测定。
表1 CSI对血浆中SV灭活正交试验设计
Table1 Design of orthogonal test for inacti-
, 百拇医药
vation of SV in plasma by CSI 组号
Group
(A)
CSI剂量
CSIdose
(mg/ml)
(B)
作用温度
Temperature
(℃)
(C)
作用时间
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Contact time
(min)
1
125
4
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125
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60
4
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4
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7
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250
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1.3.1.3 一定剂量CSI作用不同时间对血浆中病毒的灭活效果观察 以100 mg/ml的比例加CSI于血浆中。在室温(20～25℃)下，分别作用30 min、60 min、90 min和120 min，离心，分离血浆进行病毒含量测定。
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1.3.2 UVC对血浆中病毒的灭活试验
将含病毒的血浆以0.5 ml/孔的比例加入20 mm直径的细胞培养板孔中(血浆厚度2 mm)。将培养板置冰块上，以无臭氧紫外线灯照射(辐照度值为2 390 μW/cm2)不同时间。照射时控制温度在18～20℃，同时人工摇动，使血浆可被均匀照射。于照射处理前、后，分别收集血浆作病毒含量测定。UVC照射剂量计算单位为 J/m2。
结果的判断，以含病毒血浆吸附细胞后，连续7 d无CPE者为阴性。对可疑细胞进行传代，再连续培养7 d，无CPE者为阴性。按TCID50计算病毒减少量对数值〔4〕。
病毒减少量对数值=对照组病毒含量对数值 - 试验组病毒含量对数值。
1.4 F Ⅷ #FK凝血活性测定
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1.4.1 缺F Ⅷ基质血浆的制备 将正常人的枸橼酸盐抗凝血浆(西南医院输血科提供)在37℃水浴中保持24 h(此时所得F Ⅷ凝血活性小于0.1%)，然后小量分装，置-20℃保存。
1.4.2 制备各种稀释度正常人血浆标准曲线 按一期法〔5〕，取20名以上健康人混合新鲜枸橼酸盐抗凝血浆(西南医院输血科提供)，用咪唑-枸橼酸缓冲液作10、20、40、80、160、320、640、1 280的倍数稀释，各吸取0.1 ml，然后加入缺F Ⅷ的基质血浆0.1 ml、0.05 mol/L氯化钙0.1 ml、0.5%白陶土。置37℃预温2～3 min，加入预温的适当稀释的部分凝血活酶液0.1 ml，混匀。立即开始计时，观察记录血浆凝固时间。在双对数纸上以凝固时间(s)为崐纵坐标，以血浆中F Ⅷ浓度为横坐标绘制标准曲线。
1.4.3 空白测定 取缺F Ⅷ的基质血浆(作为空白样品)0.1 ml，并加入咪唑缓冲液、部分凝血活酶缓冲液、白陶土和氯化钙溶液等各0.1 ml，混匀。按上述方法测定血浆凝固时间。调整部分凝血活酶的浓度，使凝固时间在240～250 s。
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1.4.4 样本测定 将分别经UVC与CSI法消毒的血浆作为试验样品，以在37℃预温30 min、60 min、90 min和120 min的正常血浆为对照样品。将血浆样本用咪唑-枸橼酸缓冲液以1∶10的比例稀释，以其代替咪唑-枸橼酸缓冲液，按空白测定方法测定血浆凝固时间。查找标准曲线，计算F Ⅷ浓度，观察血浆中F Ⅷ凝血活性的变化。
1.5 #FK数据处理
正交试验统计检验按徐吉民的〔6〕正交试验统计方法进行级差(R值)和方差分析。其它部分数据使用MicroCal Origin 2.94软件程序和SAS软件程序在计算机上进行多因素方差分析及指数回归方程计算。
2 结果
2.1 不同因素对CSI消毒血浆效果的影响
2.1.1 消毒血浆的回收量 加入2 ml血浆的CSI量分别为100 mg/ml、200 mg/ml和250 mg/ml时，血浆回收率分别为85%、60%和51%(表2)。这可能是CSI吸收水份所导致的结果。因此，在实用中，CSI用量宜控制在100 mg/ml左右，否则血浆回收量过少。
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表2 CSI加入量对消毒后血浆回收量的影响
Table2 Influence of amount of CSI added on
recovery of plasma after disinfection CSI加入量
Amount of CSI added
(mg/ml)
回收血浆量
Amount of pladms recovered
(ml，X±SD)
回收率
, http://www.100md.com Recovery rate
(%)
100
1.69±0.04
85
200
1.20±0.03
60
250
1.01±0.09
51
注： 各组加入血浆量均为2.00 ml。
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Note: The amount of plasma added was 2.00 ml in
any group.
2.1.2 CSI对血浆中SV的灭活效果 正交试验结果(表3)，CSI含量、作用时间和作用温度3因素级差(R值)分别为1.67，1.09和0.23。这说明CSI含量和作用时间在灭活SV过程中具有决定性作用，而温度则影响不大。方差分析也显示，F(A)为57.16，F(C)为25.65，即CSI含量和作用时间的不同使病毒的灭活效果不同(P < 0.01)。
表3 CSI对血浆中SV灭活的正交试验结果
Table3 Results of orthogonal test for inac
tivation of SV in plasma by CSI 试验序号
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Test No.
(A)
CSI含量
CSI content
(mg/ml)
(B)
作用温度
Temperature
(℃)
(C)
作用时间
Contact time
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(min)
病毒减少量
Reduction of virus
(lg)
1
125
4
30
2.22
2
125
25
45
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2.44
3
125
37
60
3.28
4
200
4
60
4.11
5
200
25
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30
3.11
6
200
37
45
3.78
7
250
4
45
3.94
8
250
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25
60
5.11
9
250
37
30
3.89
注： 阳性对照组病毒滴度为7.111 lg TCID50。
Note: The virus titer of positive control gruop was
7.111 lg TCID50.
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R(A)= 1.67，R(B)= 0.23，R(C)= 1.09；
F(A)= 57.16，F(C)= 25.65。
T = 31.88，CT = 112.93。
虽然增加CSI用量可提高CSI灭活血浆中SV病毒的效果，但考虑到血浆回收量，在用CSI消毒血浆时应控制其用量。由于4～37℃温度的变化对病毒的灭活影响较小，试验在室温下即可进行。
在室温下，按100 mg/ml将CSI加入血浆，混悬。作用30、60、90、120 min时，可分别灭活病毒2.55、3.61、3.83、3.83个对数级。根据方差分析，CSI的作用时间在60 min以内，病毒灭活效果增加(F=17.68， P< 0.01)；60 min以后，未见病毒数量有显著差异(F=2.14， P > 0.05)。病毒存活量(Y) 与作用时间(X)呈指数曲线分布(图1)。由此，单用CSI消毒血浆时，作用时间不必超过60 min。
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图1 血浆中SV的存活量与CSI作用时间的回归曲线
Fig 1 Regression curve of contact time of CSI
and surviving SV in plasma
2.2 UVC#FK对血浆中SV#FK的灭活效果
以辐照度值为2 390 μW/cm2的UVC照射含SV血浆。照射5 min(剂量为7 170 J/m2)时，病毒减少4.26个对数级，照射5 min以后病毒下降减缓，照射10、20、30、40 min，病毒分别减少4.50个对数级、5.50个对数级、6.11个对数级与6.71个对数级。病毒存活量(Y)随照射时间 (X) 延长，亦呈指数曲线分布(图2)。
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图2 血浆中SV存活量与UVC照射时间的回归曲线
Fig 2 Regression curve of UVC exposure time
and surviving SV in plasma
2.3 #FK血浆中F Ⅷ#FK凝血活性变化
经CSI(100 mg/ml)处理10 min的血浆，F Ⅷ凝血活性仅存57.33%；作用60 min者已降至零。用辐照度值为2 390 μW/cm2的UVC照射血浆5 min(剂量为7 170 J/m2)、10 min(14 340 J/m2)和20 min(28 680 J/m2)，Ⅷ凝血活性保存分别为85.19%、73.42%和54.70%(表4)。与放置室温下的正常血浆对比，CSI对F Ⅷ凝血活性损害很大；7 170 J/m2的UVC照射对F Ⅷ凝血活性基本无损害，照射剂量为14 340 J/m2与26 680 J/m2时，F Ⅷ凝血活性将分别降低约10%与28%。为此，应控制UVC照射剂量。
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表4 不同处理后血浆中F Ⅷ凝血活性的变化
Table4 Changes in coagulating activity of plasma Factor Ⅷ after
different treatments 组别
Group
处理不同时间(min)血浆中F Ⅷ凝血活性(%)
Coagulating activity(%) of plasma Factor Ⅶ after treatment
for different periods of tine(min)
0
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5
10
20
30
60
90
在室温下放置
Standing at room temperature
86.41
86.18……
83.10
84.75
83.78
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经100mg/mlCSI作用
After exposure to100mg/ml CSI……
57.33……
0.00…
经2 390μW/cm2 UVC照射
After exposure to 2 390μW/cm2 UVC…
85.19
73.42
54.70………
3 讨论
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3.1 试验结果，用CSI处理血浆时，病毒灭活剂量与CSI含量和作用时间(30～60 min以内)呈明显的相关效应，而受作用温度(4～37℃)影响较小。鉴于血浆的回收率，CSI加入血浆的比例宜为100 mg/ml。此时，60 min能使SV下降3.61个对数级，但F Ⅷ凝血活性已降至零；继续延长作用时间至120 min，灭活病毒的效果增加不明显。
用UVC照射血浆时，剂量为7 170～57 360 J/m2的UVC可使SV下降4.26～6.71个对数级。在照射剂量为7 170 J/m2时，病毒被灭活的速度较快，F Ⅷ凝血活性也无损害。超过此剂量后的病毒下降速度减缓，且对F Ⅷ凝血活性的损害明显加重。
上述结果表明，对F Ⅷ凝血活性的保存，UVC照射法比CSI处理法好，但两种方法灭活病毒的彻底性均有限。
3.2 本试验中，用CSI消毒血浆后，检测病毒时未用中和剂。原因是CSI不溶于水，经离心后可从血浆中除去。并且预试验亦表明，用硫代硫酸钠(I2的中和剂)溶液组与用生理盐水组的病毒计数无明显差别。
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3.3 温度为4～37℃对CSI灭活病毒效果无明显影响，可能因血浆中含大量蛋白质，抑制了温度效应所致。其机理尚待探讨。
*军事医学科学院微生物流行病研究所
参考文献
〔1〕 Marx G, Mou X, Freed R, et al. Protecting fibrinogen with rutin during UVC irradiation for viral inactivation. Photochem Photobiol 1996; 63 (4) : 541.
〔2〕 Highsmith FA, Xue H, Caple M, et al. Viral inactivation of vesicular stomatitis virus in normal Human Serum by cross-linked polyvinylpyrrolidone. J Infect Dis 1993; 167: 1027. ?amp;
, 百拇医药
〔3〕 Hart H, Reid K and Hart W. Inactivation of viruses during ultraviolet light treatmeat of human intravenous immunoglobulin and albumin. Vox Sang 1993; 64: 8211.
〔4〕 黄祯祥. 医学病毒学基础及实验技术. 北京： 科学出版社， 1990: 1304.
〔5〕 朱忠勇. 实验医学检验学. 北京： 人民军医出版社， 1992: 135.
〔6〕 徐吉明. 正交法在医药科研中的应用. 北京： 中国医药科技出版社， 1986: 31～133.
〔7〕 Highsmith FA, Xue H, Caple M, et al. Inactivation of lipid-enveloped and non-lipid-enveloped model viruses in normal human plasma by crosslinked starch-iodine. Tnansfusion 1994; 34 (4) : 322.
(1997-11-03收稿 1998-05-10修回), http://www.100md.com(熊鸿燕 刘育京* 涂瀛)