铅对大鼠海马神经细胞Ca2+浓度、Ca2+-ATP酶、Na+

铅对大鼠海马神经细胞Ca2+浓度、Ca2+-ATP酶、Na+-ATP酶活性的影响

http://www.100md.com 《毒理学杂志》 1999年第4期

     作者：孙黎光刘素媛邢伟石利德

    单位：孙黎光(中国医科大学基础医学院生化教研室 (沈阳 110001));刘素媛(中国医科大学基础医学院生化教研室 (沈阳 110001));邢伟(中国医科大学基础医学院生化教研室 (沈阳 110001));石利德(中国医科大学基础医学院生化教研室 (沈阳 110001))

    关键词：

    卫生毒理学杂志000409 已知脑海马区是学习和记忆的重要脑区，尤其LTP被认为是学习和记忆的功能单位。许多实验证明体外急性染铅时，神经细胞LTP过程中Ca²⁺浓度明显升高，Ca²⁺-ATP酶活性降低^[1]。在慢性染铅动物体内，铅对上述指标的影响还没有报道，本研究用慢性染铅Wistar大鼠为动物模型，予观察铅对脑海马神经细胞Ca²⁺，Ca²⁺-ATP酶，Na⁺-ATP酶活性及LTP的影响。
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    1 材料与方法

    1.1 材料

    Wistar大鼠由本校实验动物部提供。高速离心机为Dupout公司产品；液闪仪为BeckmanLS-180型；F-2000荧光光度计为日立产品；Fura-2/Am,ATP购自Sigma。其余试剂为分析纯。

    1.2 方法

    1.2.1 动物模型选择断乳后Wistar大鼠40只，体重为30g左右。分成2组，对照组饮蒸溜水，染铅组饮0.2%醋酸铅的水。待大鼠长至300g，用高频刺激诱发LTP后，测定海马神经细胞的Ca²⁺i,Ca²⁺-ATP酶，Na⁺-ATP酶活性。

    1.2.2 血铅浓度测定原子吸收石墨炉法。
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    1.2.3 高频刺激诱发LTP^[2]

    将刺激电极插入内嗅皮层，刺激穿通路纤维，将记录电极插入海马齿状回，引导单一刺激诱发群体峰电位(Population Spike)做基线记录后，给高频刺激5min，观察LTP改变。

    1.2.4 神经细胞内[Ca²⁺]i测定用Fura-2/Am荧光标记法^[2]。

    1.2.5 Ca²⁺-ATP酶及Na⁺-ATP酶活性测定按徐友涵^[3]方法。

    1.3 统计方法

    所有计量资料用t检验及相关分析。

    2 结果
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    2.1 染铅鼠血铅浓度及脑海马神经细胞LTP过程中[Ca²⁺]i改变

    本研究中用0.2%醋酸铅水喂养大鼠后，血铅浓度明显高于正常。脑海马神经细胞内[Ca²⁺]i也升高，统计学上有意义。见表1。

    表1 大鼠海马神经细胞血铅浓度及Ca²⁺i

    组别

    血铅浓度μmol/L

    [Ca²⁺]i nmol/L

    对照组

    0.25±0.12

    (n=13)
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    108.81±26.85

    (n=15)

    染铅组

    3.30±0.56

    (n=11)^*

    265.14±53.61

    (n=12)^{* *}

    与对照组比较^*P<0.01；^{* *}P<0.01

    经相关系数分析，神经细胞[Ca²⁺]i与血铅浓度呈仍显著正相关(r=0.90 P<0.01)。
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    2.2 染铅鼠神经细胞LTP过程中Ca²⁺-ATP酶和Na⁺-ATP酶活性变化

    染铅鼠脑海马神经细胞膜Ca²⁺-ATP酶及Na⁺-ATP酶活性亦随着[Ca²⁺]i升高而增加，并有统计学意义。见表2。

    表2 大鼠海马神经细胞Ca²⁺-ATP酶，Na⁺-ATP酶活性(nmol Pi mg^-1min^-1)

    组别

    Ca²⁺-ATP酶活性

    Na⁺-ATP酶活性
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    对照组

    265.17±28.44

    (n=12)

    829.10±89.25

    (n=13)

    染铅组

    355.62±41.16

    (n=13)^*

    1 332.19±290.10

    (n=13)^{* *}

    与对照组比较^P<0.01；^{* *}P<0.01
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    经相关系数分析证明，Ca²⁺-ATP酶及Na⁺-ATP酶活性亦与[Ca²⁺]i呈极显著正相关。(r=0.835 P<0.01,r=0.801 P<0.01)。

    2.3 染铅鼠海马LTP变化

    对照组(n=12)有10只产生了LTP，染铅组(n=11)有2只产生LTP，两组间发生率下降差异显著(P<0.01)。并且两组间群体峰电位(PS)平均幅值下降差异显著(P<0.05)。证明铅确实可使LTP发生改变。

    3 讨论

    铅是环境中一种重要的神经毒物，对青少年学习、记忆及心理、行为的影响引起人们的极大关注。但铅对中枢神经系统的致毒机理仍不清楚。在分子水平研究上主要集中在铅与Ca²⁺的关系上。Ca²⁺广泛分布于人体的细胞与体液中，细胞内游离Ca²⁺浓度的改变是细胞生理生化功能的重要物质基础，也是多种受体激动后信号传递的中心环节。已经证明染铅鼠脑神经细胞内游离Ca²⁺浓度明显升高^[2]，但其机制不清。Ca²⁺-ATP酶存在于胞膜及内质网，肌浆网上，是胞浆内Ca²⁺向胞外或内质网转运的重要载体。质膜Ca²⁺-ATP酶是一个140KD蛋白质每水解一分子ATP可泵出一分子的Ca²⁺。体外实验证明，急性染铅后Ca²⁺-ATP酶活性降低，即胞浆内Ca²⁺向外转运受阻，可能是胞浆Ca²⁺升高的原因之一。本研究中，大鼠慢性染铅后，胞浆Ca²⁺浓度升高，Ca²⁺-ATP酶活性亦升高。胞浆Ca²⁺浓度升高可能有两方面原因：一是Ca²⁺流入量增加；Kaczmerek^[4]研究显示：PKC活性升高可激活膜上钙通道使Ca²⁺流入增多。我室已证明染铅后可引起大鼠脑海马神经细胞PKC活性升高^[2]。PKC激活后可引起内质网、线粒体内Ca²⁺释放，导致胞浆Ca²⁺浓度升高。另外胞内Ca²⁺流出减少也是造成胞浆Ca²⁺浓度升高的原因之一。Ca²⁺-ATP酶可将胞浆内Ca²⁺泵出细胞外或泵入内质网，是胞浆Ca²⁺流出的主要通道。本研究Ca²⁺-ATP酶活性增高，是由于在体长期染铅，胞浆Ca²⁺浓度持续升高，刺激Ca²⁺-ATP酶合成量增加，活性升高，可将细胞内Ca²⁺泵出胞外，是一种代偿机制。Na⁺-ATP酶活性亦明显升高。可能是由于胞内Ca²⁺升高不仅使Ca²⁺-ATP酶活性代偿升高，另外膜上还有Na⁺、Ca²⁺交换器，可使膜外3个Na⁺离子顺浓度差流入胞内，并使胞内一个Ca²⁺逆浓度差泵出，结果使胞内Na⁺浓度升高。Na⁺-ATP酶每水解一分子ATP，同时泵出3个Na⁺，泵入2个K⁺。这样就维持细胞外高钠、细胞内高钾的特殊离子梯度。也是一种适应长期染铅造成胞内高Ca²⁺状态的代偿机制，使胞浆Ca²⁺浓度不至于过高，保证细胞内钙稳态。Ca²⁺浓度的变化是Ca²⁺跨膜转运及细胞内钙池摄取、释放等动态平衡改变的总结果^[5]，有报导指出在急性染铅时内质网(一种钙池)膜上IP₃受体激活是胞浆Ca²⁺浓度升高的主要原因^[6]，在慢性染铅鼠内，IP₃受体及Na⁺、Ca²⁺交换器，及各种钙通道是如何改变，还不清楚，有待于进一步观察。
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    国家自然科学基金资助项目(39070454)

    参考文献

    1，Bettaiya R,Yallapragada P R, Hall E, et al. Ecotoxicol Environ Saf.1996,33(2):157.

    2，孙黎光，邢伟，刘素媛，等.卫生毒理学杂志，1997，11(3)：180.

    3，徐友涵，宋FDA9华，等.生物化学与生物物理进展，1986，4：64

    4，Kaczmerek Lk. Trends Neurosci,1987,10:30.

    5，陈松海，韩启德.生理科学进展，1993，24(1)：10.

    6，Timothy J Simons.Neurotoxicology,1993,14(2-3):77.

    (收稿：1999-04-10), 百拇医药

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