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编号:10260564
抗血小板溶栓素的生物相容性及免疫毒性实验研究
http://www.100md.com 《毒理学杂志》 1999年第4期
     作者:王家骥 王取南 徐德祥 孙美芳 李兆羿 承新

    单位:王家骥(广州医学院预防医学教研室 (510182));王取南(安徽医科大学卫生毒理教研室);徐德祥(安徽医科大学卫生毒理教研室);孙美芳(安徽医科大学卫生毒理教研室);李兆羿(合肥兆峰科大药业有限公司);承新(合肥兆峰科大药业有限公司)

    关键词:

    卫生毒理学杂志000407 抗血小板溶栓素(Anti-Platelet Thrombolysin,简称抗栓素)是从皖南尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)毒液中提纯的具有抗凝、去纤、溶栓和抗血栓形成等疗效的一类新药[1]。已有研究报道不同种类、不同产地、不同的分离纯化工艺纯化的蛇毒制剂,其疗效和毒性具有较大的差异[2],且已有资料报导蝮蛇抗栓素可致过敏反应[3]。为了解采用新的分离纯化工艺纯化制备的抗血小板溶栓素对机体有无局部刺激、降压、致热以及溶血等毒副作用,以及反复使用后对机体是否会产生明显的速发型或迟发型致敏毒副作用及其最小致敏剂量,本研究采用多种不同种属的动物(小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和猫)对抗血小板溶栓素进行了局部刺激试验、生物相容性以及免疫毒性实验研究,以便为本药的临床安全应用提供参考依据。
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    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 药品 抗血小板溶栓素冻干粉针剂由合肥兆峰科大药业有限公司从生长在安徽皖南山区的皖南尖吻蝮蛇毒液中提纯制备(简单工艺为:先经DEAE-阴离子交换柱,进一步经凝胶过滤层析和反相层析精细纯化,所得组分纯度在99%以上)。其效价以抗血小板活性单位(U)表示,批号941028(142.5U/支)和940505(247.5U/支),临用前用生理盐水(NS)配制成所需浓度。

    1.1.2 动物 白色家兔(体重2.1±0.5kg),家猫(体重3.4±1.3kg),豚鼠(体重265±13g),SD大鼠(体重198±11g),昆明小鼠(体重21±3g)均由安徽医科大学实验动物中心提供。

    2 实验方法

    2.1 局部刺激试验[4]
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    2.1.1 皮内注射刺激试验 6只白色家兔脱毛备皮后随机分成高(900U/ml)、低(300U/ml)两组(n=3)。分别在每只家兔左侧5个间隔2cm的等距点皮内各注射0.1ml不同浓度的抗栓素,对侧同法注射等量NS。分别于注射后1、6、24、48、72小时观察并记录注射部位皮肤及周围组织有无局部红肿等刺激反应。

    2.1.2 原发性皮肤刺激试验 12只白色家兔脱毛备皮并在两侧各划#形损伤伤口(面积约3cm×3cm),随机分成高(900U/ml)、低(300U/ml)实验组和阳性对照组(3%甲醛)3组(n=4)。在家兔左侧创面各自涂敷抗栓素或3%甲醛0.1ml,所有家兔右侧伤口涂敷等量NS为阴性对照,用消毒纱布覆盖,24小时后移去斑贴物,观察并记录受试物对家兔破损皮肤有无刺激作用以及移去斑贴物后1、24、48小时各组平均原发性刺激指数。

    2.1.3 家兔眼刺激试验 将8只白色家兔随机分成高(900U/ml)、低(300U/ml)两组(n=4)。在家兔左眼结膜囊内分别滴入不同浓度的抗栓素NS稀释液0.1ml,右眼滴入等量NS作为对照,滴药后立即被动使家兔眼睛闭合10s,分别观察并记录滴入后15min,1、2、24小时、7、14天内家兔有无流泪、充血及分泌物等眼部刺激症状,分别计算各组家兔眼刺激反应积分。
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    2.2 生物相容性研究[4]

    2.2.1 家猫降压物质检查试验 将9只家猫随机分成三组,即高(900U/kg体重)、中(90U/kg体重)、低(9U/kg体重),每组3只。自耳缘静脉注射2.5%硫喷妥钠(25mg/kg)使家猫麻醉,分离气管及右侧颈动脉,插入气管插管及动脉插管,连接动物测压装置。分离左侧股静脉,连接静脉插管及注射器,分别自股静脉依次注入组胺标准品(0.05、0.1、0.15μg/kg),鉴定每只家猫降压反应灵敏合格后,分别依次(组胺标准溶液→抗栓素溶液→抗栓素溶液→组胺标准溶液)从股静脉缓慢(1ml/min)注入相应浓度的抗栓素溶液或组胺标准溶液(0.1μg/kg)。

    2.2.2 家兔热原试验 将9只家兔随机分成三组,即高(900U/kg)、低(225U/kg)实验组和阴性对照组(注射等量NS),每组3只。实验前测家兔基础体温,按5ml/kg体重的容量自耳缘静脉缓慢(1ml/min)注射抗栓素NS稀释液,分别于注射后60、120、180min测量各兔体温。
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    2.2.3 溶血试验 采用抗栓素NS稀释液与2%兔血悬液直接接触的方法进行体外溶血试验。设实验组若干组及阴、阳性对照组各一组,最高浓度组抗栓素终浓度为26.25U/ml,倍倍稀释至最低浓度为0.0016U/ml。实验组加入抗栓素NS稀释液2ml,阴阳性对照组分别加入NS或蒸馏水2ml,每组设3个平行管。先将各管置37℃水浴30min,再加入2%兔血悬液2ml,混匀后,继续置37℃水浴60min,750g离心5min,721型分光光度计545nm测定各管吸光度,并按溶血率=样品吸光度-阴性对照吸光度/阳性对照吸光度×100%计算各管溶血率。

    3.3 免疫毒性实验[4]

    3.3.1 速发型致敏实验 32只豚鼠随机分成加福氏完全佐剂的高剂量(致敏剂量99.9U/kg)A组和溶剂(NS)对照组、不加福氏完全佐剂的高剂量B组和低剂量组(11.1U/kg);32只大鼠随机分成不加福氏完全佐剂的高(99.9U/kg)、中(33.3U/kg)、低(11.1U/kg)三个剂量组和溶剂(NS)对照组,每组8只。60只小鼠随机分成6组(各组均不加福氏完全佐剂,其致敏剂量分别为0、3.7、11.1、33.3、99.9、299.7U/kg),每组10只。所有动物每天经皮下注射相应剂量的抗栓素溶液或溶剂各一次,连续注射3次;首次注射后3周,经胫静脉(豚鼠)或尾静脉(大、小鼠)激发注射一次,观察记录动物出现的过敏反应症状。
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    3.3.2 迟发型致敏实验 40只白色豚鼠随机分成高(99.9U/0.2ml/点)、低(33.3U/0.2ml/点)实验组和阳性(2.4-二硝基氯苯)、阴性(含福氏完全佐剂的NS)对照组,每组10只。各组分别于背部脱毛区皮内注射含福氏完全佐剂的抗栓素稀释液、0.5% 2.4-二硝基氯苯溶液或含福氏完全佐剂的NS,每鼠等距离间隔2cm注射3点,每点0.2ml,此后每隔一周局部斑贴一次,共2次,末次斑贴后第14天在对侧皮肤作激发试验,分别观察1、24、48小时、7天时激发部位皮肤有无红斑、水肿及硬块等。

    4 结果

    4.1 局部刺激试验

    家兔皮内注射刺激试验结果显示:各组家兔各观察时点均未见皮肤出现明显的红斑、水肿等刺激症状,表明抗血小板溶栓素对家兔皮肤无刺激性。家兔原发性皮肤刺激试验结果显示:抗栓素高、低实验组平均原发性刺激指数均为0,属无刺激性物质。家兔眼刺激试验结果显示:各试验组家兔角膜未见混浊及损伤,虹膜正常,结膜无充血、水肿和分泌物,眼刺激反应评分积分为0。根据眼刺激性评价标准判定抗血小板溶栓素对家兔眼无刺激性。
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    4.2 生物相容性研究

    4.2.1 家猫降压物质检查试验 不同浓度组胺标准溶液(0.05、0.1、0.15μg/kg)引起血压下降值平均分别为7.09±3.54kPa;7.98±2.18kPa;9.44±2.42kPa;抗栓素高、中、低剂量组血压下降值平均分别为1.02±0.73kPa;1.24±0.70kPa;0.96±0.54kPa;表明抗血小板溶栓素对血压无明显影响。

    4.2.2 家兔热原试验 注射抗栓素后第60、120、180min各兔平均体温变化分别为高剂量组0.57±0.23℃,-0.15±0.21℃,-0.13±0.12℃;低剂量组0.17±0.21℃,0.07±0.06℃,0.23±0.32℃;对照组0.17±0.21℃,0.07±0.06℃,0.23±0.32℃;3小时内不同观察时点各组家兔体温变化均低于药典规定的1.4℃标准。表明抗血小板溶栓素对家兔无致热作用。

, 百拇医药     4.2.3 溶血试验 抗血小板溶栓素各实验管溶血率在0~5%范围之间,均低于5%的标准[4]。表明抗血小板溶栓素对家兔血细胞无溶血作用。实验过程中发现:抗血小板溶栓素浓度超过0.0064U/ml时出现红细胞粘集现象。

    4.3 兔疫毒性实验

    4.3.1 速发型致敏实验 含福氏完全佐剂的抗栓素高剂量A组(99.9U/kg)豚鼠激发注射后立即出现耸毛、搔耳、抓脸等不安表现,随即出现颤抖、呼吸急促,个别豚鼠出现打喷嚏等过敏症状,3min左右出现抽搐、侧卧等,激发注射后5min内豚鼠全部死亡。不加福氏完全佐剂的高剂量B组豚鼠激发注射后3min左右开始出现上述过敏症状,3/8只豚鼠出现明显的全身肌肉痉挛、侧卧等,7min后死亡;低剂量组(11.1U/kg)豚鼠激发注射后10min左右开始出现不安、颤抖、呼吸急促等轻度过敏症状,1只豚鼠于激发注射后20min死亡,其余豚鼠上述过敏症状于10小时内基本恢复,未见其它严重过敏症状。对照组豚鼠未见上述过敏症状,无豚鼠死亡。根据全身性变态反应强度分级标准:高剂量组加福氏完全佐剂反应强度分级为4;不加福氏完全佐剂为2.25,低剂量组为1.375。表明抗栓素对豚鼠具有速发型致敏毒作用,其最小致死致敏剂量为11.1U/kg。
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    高剂量组(99.9U/kg)大鼠激发注射后开始仅出现轻度兴奋和不安症状,随即出现明显的紫绀、呼吸加深、抬头深吸气、全身肌无力、瘫卧等症状;4/8大鼠于激发注射后1小时内死亡,大鼠死亡前活动明显减少,呼吸缓慢而微弱;病理检查见肠壁充血、腹腔壁及全身肌肉发红但未见明显出血。中剂量组(33.3U/kg)出现的过敏症状与高剂量组相似,但症状稍轻微,3/8大鼠于激发注射后24小时内死亡。低剂量组(11.1U/kg)仅出现轻度兴奋、不安和呼吸困难等过敏症状,未见动物死亡。对照组大鼠未见上述过敏症状,无大鼠死亡。表明抗栓素对大鼠亦具有速发型致敏毒作用,其半数致死致敏剂量为60U/kg(1/128LD50),最小致死致敏剂量为33.3U/kg(1/230LD50,按体重计相当于临床人体用药量的100倍)。

    各剂量组小鼠于激发注射后立即出现不同程度的耸毛、快速搔耳、抓脸、双前肢合抱立起、口舔后肢等不安表现,随即出现呼吸加快,并见明显的紫绀、口鼻发青等过敏症状;高剂量组小鼠大多在激发染毒后20min左右突然出现后肢强直性后蹬并立即死亡。各实验组小鼠出现的过敏症状和死亡数存在明显的剂量-反应关系,死亡比分别为0/10、2/10、5/10、5/10、10/10;对照组小鼠未见上述过敏症状,无小鼠死亡。表明抗栓素对小鼠具有速发型致敏毒作用,其半数致死致敏剂量为47U/kg(1/85LD50),最小致死致敏剂量为11.1U/kg(1/360LD50,按体重计相当于临床人体用药量的33倍。
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    4.3.2 迟发型豚鼠皮肤致敏实验 抗栓素各实验组和对照组豚鼠未见致敏症状,反应率均为0,而阳性对照组豚鼠激发部位皮肤出现明显的红斑、水肿及硬块等致敏表现,反应率为70%。表明抗栓素对豚鼠皮肤无迟发型致敏作用。

    5 讨论

    随着人口老龄化和不良饮食习惯等危险因素的增加,冠心病、心肌梗塞、脑血管意外等心脑血管疾病的发病逐年增多,已成为危害人类健康最严重的一类疾病,而这类疾病的发生和发展均与血栓形成有着密切的关系。近30多年来,国内外采用多种分离纯化手段从蛇毒蛋白组分中纯化出具有抗凝、去纤、溶栓和抗血栓形成等作用的抗栓酶等制剂[1]。目前市售的蛇毒类抗栓酶主要是“蛇毒类凝血酶”,其药理作用类似于凝血酶,通过降解纤维蛋白原,释放纤维蛋白原的A肽,形成不稳定的纤维蛋白单体,由于不激活凝血XⅡ因子,因此被体内纤溶系统降解,从而达到降低纤维蛋白原、抗凝、抗栓的作用。而抗血小板溶栓素是采用新的层析工艺从皖南尖吻蝮蛇毒液中提纯的一类新药,药效学实验研究结果显示:抗血小板溶栓素可直接将纤维蛋白原和纤维蛋白降解成更小的片段,并进一步抑制纤维蛋白原与血小板的结合,从而更有效地抑制血小板的聚集。因此,抗血小板溶栓素新药的抗栓、抗再梗作用更有效,并同时具有部分直接溶栓作用。从作用机理上更优于目前市售的蛇毒抗栓类产品。
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    本研究发现:经皮内注射或皮肤表面涂敷或经眼粘膜给予900U/ml的抗栓素对家兔皮肤以及眼粘膜刺激指数均为0,根据眼刺激性评价标准判定抗血小板溶栓素对家兔皮肤和眼结膜均无刺激性[4],而这一剂量相当于临床人体最大用药量的600多倍;经静脉给予900U/kg体重的抗栓素(相当于临床人体最大用药量的1200多倍)各组家兔各观察时点体温变化均低于药典规定的1.4℃标准,提示抗栓素对家兔无致热作用;经静脉给予家猫900、90、9U/kg的抗栓素(最高剂量相当于临床人体最大用药量的800倍)各剂量组血压下降值均小于组胺标准溶液(0.1μg/kg)的一半,表明不同浓度的抗栓素对家猫无降血压作用;几乎所有浓度的抗栓素对家兔血细胞均无溶血作用;给豚鼠相当于临床人体最大用药量3000多倍的抗栓素溶液多次多点注射,未见对豚鼠皮肤产生迟发型致敏作用。系列研究结果表明抗血小板溶栓素无局部刺激作用、无致热作用、无降血压作用、无迟发型致敏作用。但由于抗血小板溶栓素为蛋白质类制剂,对豚鼠、小鼠、大鼠仍具有明显的速发型致敏毒副作用,其最小致死致敏剂量分别为11.1U/kg和33.3U/kg(按体重计分别相当于临床人体用药量的33倍和100倍)。因此,在临床试用阶段或临床上使用该制剂时应密切关注其速发型致敏毒副作用,并应做好必要的脱敏急救准备。本研究还进一步证实,不同种属动物对血小板溶栓素蛋白类制剂引发速发型致敏毒副作用的敏感性以及致敏毒作用表现有较大的差异,其敏感顺序为小鼠与豚鼠相近,而大鼠的敏感性较低。相同剂量的抗血小板溶栓素溶液加福氏完全佐剂引发的速发型致敏毒副作用明显强于不加福氏完全佐剂,因此,为提高对血小板溶栓素蛋白类制剂(尤其是低蛋白类制剂)速发型致敏毒副作用的检出率,建议用福氏完全佐剂配制为宜。
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    参考文献

    1,朱中良,龚为民,牛立文,等.皖南尖吻蝮蛇毒出血毒素Ⅳ的纯化与初步鉴定.生物化学杂志,1996,12(3):357-9.

    2,陈康德,杨梅兰,杨渭川,等.蛇毒研究和应用概述.蛇志,1997,9(4):47-9.

    3,黄连飞.218例蝮蛇抗栓素皮试结果及过敏反应分析.右江民族医学院学报,1996,18(2):244-5.

    4,裘雪友,孙定人,喻维新.药师手册.北京:人民军医出版社,第2版.1998.843-874.

    (收稿:1999-04-12), 百拇医药