细胞色素P450IA1与食管癌遗传易感性
作者：张宏艳 孙长生 李良寿 阎明晓
单位：张宏艳(第四军医大学流行病学教研室)；孙长生(第四军医大学流行病学教研室)；李良寿(第四军医大学流行病学教研室)；阎明晓(第四军医大学流行病学教研室)
关键词：食管肿瘤；细胞色素P-450；基因型
中华预防医学杂志000202 摘 要：目的 探讨细胞色素P450IA1(CYPIA1)的3种基因型患食管癌易感程度的差异，及其与吸烟的联合作用。方法 采用病例对照研究和PCR检测手段的分子流行病学方法，比较CYPIA1基因型在食管癌患者和对照者中的分布频率。结果 CYPIA1 3种基因型在食管癌病例组和对照组的分布差异有显著性；吸烟与CYPIA1的4 889位突变在食管癌发生中具有联合作用，呈相加模型(SIA=1.56)，并有显著的剂量反应关系。突变使患食管癌的危险增加3倍。结论 CYPIA1的4 889位突变可能是食管癌发生的重要宿主易感因素之一，与吸烟共同作用使患食管癌的危险显著增加。
, 百拇医药
Cytochrome P450IA1 and the genetic susceptibility to esophageal carcinoma
ZHANG Hongyan, SUN Changsheng, LI Liangshou, et al.
(Department of Epidemiology, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710033, China)
Abstract：Objectives To explore the susceptibility to esophageal carcinoma (EC) in different population with different cytochrome P450 IA1 (CYPIA1) genotype, and study the synergistic effects between CYPIA1 and smoking. Methods A case-control study (case=111, control=114) was used to compare the frequency of CYPIA1 genotype between EC and controls with a PCR method. Results The distribution of three genotypes of CYPIA1 in EC and controls was significantly different (χ2=19.35, P<0.01). There was a synergistic effect between the mutation of CYPIA1 4 889 site and smoking (SIA=1.56), and a significant dose-response effect was observed. The risk of individual whose CYPIA1 4 889 site is mutated was 3 times higher than those not mutated. Conclusions The mutation of CYPIA1 4 889 site maybe one of important host susceptible factors of EC, and the risk would increase significantly in smokers.
, 百拇医药
Key words：Esophageal neoplasms；Cytochrome P-450；Genotype
人类肿瘤发生过程中，对外来化合物易感性的个体差异，是重要的宿主因素。环境中的前致癌物进入体内后，约95%需经细胞色素P450酶激活形成亲电子的终致癌物。多年研究发现，吸烟是西安地区食管癌发生的重要环境因素[1]，而香烟中的主要致癌物——多环芳烃类化合物(PAH)在体内主要经细胞色素P450IA1(CYPIA1)激活，由于CYPIA1第7外显子4 889位碱基的差异，导致462位氨基酸的不同，成为异亮氨酸(Ile)或缬氨酸(Val)。人群中呈现3种不同基因型的CYPIA1: A型(Ile/Ile), B型(Ile/Val), C型(Val/Val)[2]。其中C型活化PAH能力最强，B型次之，A型最弱。本研究旨在分析CYPIA1在食管癌病例与对照中的基因型分布，探讨其与食管癌遗传易感性的关系。
, http://www.100md.com 对象与方法
1.研究对象：111例病例来自1997年9月～1998年10月第四军医大学第一和第二附属医院胸外科由病理学确诊的食管癌连续病例，并且要求无任何其他部位肿瘤, 未经放疗和化疗。对照组Ⅰ(44例)来自同期在消化科内镜室检查的非肿瘤门诊患者，对照组Ⅱ(70例)属健康体检者，且年龄在45岁以上。两组均为在西安地区生活15年以上的常住居民，年龄、性别职业等分布均衡。
2.调查内容：一般人口学特征及食管癌危险因素(吸烟、饮酒、家族史等)。
3.标本收集：病例标本来自手术切除的食管癌组织; 对照组Ⅰ的标本是内镜下取材的食管组织; 对照组Ⅱ为被检者静脉血5 ml，离心去血清后剩余的血凝块。均保存于-70℃冰箱。
4.实验: 模本DNA的提取, 将研磨后的食管组织或被吹打细碎的血凝块组织经蛋白酶K消化后，用酚-氯仿抽提数次、乙醇和Na+沉淀、DNA溶解液溶解后保存于-20℃。
, 百拇医药
PCR反应, 每例DNA模本分别经引物P1(5′-CGGAAGTGTATCGGTGAGACC-3′)与P2(5′-GTAGAC- AGAGTCTAGGCCTCA-3′), P1′(P1的3′端A→G)与P2(分别编为a管和b管)进行PCR扩增，产物约为200 bp片段。反应混合物含10×Buffer(1.5 mmol/L Mg2+)、200 μmol/L dNTP、2种引物各0.25 μmol/L、1 U TaqDNA聚合酶，其余以水补足总体积至50 μl。PCR循环条件为：94℃变性55 s、60℃复性1.5 min、72℃延伸1 min，经35个循环后继续在72℃延伸7 min。
电泳及结果判定, PCR反应产物于2.0% Agarose凝胶、电泳缓冲液中，在电压40 V、电流25 mA的条件下进行电泳。电泳后于300 nm的紫外光透射分析仪上观察、拍照。电泳后凝胶上的同一模本显示2条200 bp的条带则为Ile/Val杂合体；若只显示其中1条，则为Ile/Ile或Val/Val型(图1)。
a、b分别代表Ile、Va1等位基因，2、4为A型，1为B型，3为C型，5为阳性对照，M为100 bp的DNA Ladder
, 百拇医药
图1 CYP450IA1基因型检测PCR扩增产物电泳结果
5.主要设备和试剂：TaqDNA聚合酶、dNTP购自华美公司。PCR扩增仪为PE公司产480型，紫外光透射分析仪为上海康华生化仪器厂产2 F型，电泳仪为北京六一仪器厂产DYY-Ⅱ1型。所有试剂均为分析纯。
结果
1. CYPIA1 3种基因型在食管癌病例、对照组Ⅰ、对照组Ⅱ中的分布情况见表1，三者分布差异有显著性(P<0.01)。因为2个对照组分布无差异(P=0.365)，合并分析。
2. CYPIA1基因型分布按吸烟与否分层分析(表2)。结果显示，只有A型中，病例组的吸烟率明
表1 CYPIA1基因型在食管癌病例组和对照组中的分布例数 CYPIA1基因型
, http://www.100md.com
病例组
对照组Ⅰ
对照组Ⅱ
A型
31 (27.9)
25 (56.8)
34 (48.6)
B型
41 (36.9)
12 (27.3)
28 (40.0)
C型
, http://www.100md.com 39 (35.2)
7 (15.9)
8 (11.4)
合计
111(100.0)
44(100.0)
70(100.0)
括号内为构成比(%)
表2 食管癌患者与对照组CYPIA1基因型分布与吸烟的分层分析 项目
A型(例)
B型(例)
, http://www.100md.com C型(例)
χ2值
P值
病例
对照
病例
对照
病例
对照
吸烟组
23
30
23
, http://www.100md.com
15
26
7
10.60
0.005
非吸烟组
8
29
18
25
13
8
9.50
, 百拇医药 0.009
χ2值
4.52
2.78
1.79
P值
0.033
0.096
0.181
OR值
2.78
2.13
2.29
, http://www.100md.com
95%CI
0.98～8.08
0.80～5.73
0.58～9.16
显高于对照组(P=0.033)。
3. CYPIA1基因型与环境暴露(吸烟)对食管癌患病风险的联合作用及剂量反应关系。表3显示CYPIA14 889位突变与吸烟在患食管癌中呈相加模型的协同作用，SIA=8.07/(2.78+3.40-1)=1.56。表4是以Ile/Ile型的非吸烟者OR值作为1.00，将不同基因型及不同吸烟暴露与之相比，计算相应的OR(95%CI)值。结果表明，随着等位基因Ile→Val突变数与吸烟共同作用剂量的增加，患食管癌的风险逐渐增高。
表3 CYPIA1第7外显子突变与吸烟的协同作用 Ile→Val
, 百拇医药
吸烟
病例
(例)
对照
(例)
OR值
95%CI
χ2值
P值
-
-
8
29
, 百拇医药
1.00
-
+
23
30
2.78
0.98～ 8.08
4.52
0.033
+
-
31
33
, 百拇医药
3.40
6.24～ 9.56
7.04
0.008
+
+
49
22
8.07
2.93～22.95
21.72
0.000
表4 吸烟与CYPIA1 突变共同作用的剂量反应关系(OR值及95%CI) CYPIA1
, http://www.100md.com
非吸烟者
吸烟者
Ile/Ile
1.00
2.78 (0.98～ 8.08)*
Ile/Val
2.61 (0.88～ 7.94)
5.56 (1.81～17.64)**
Val/Val
5.89 (1.57～23.08)**
, 百拇医药
13.46 (3.78～51.00)**
χ2 趋势=25.465
P<0.01
* P<0.05，** P<0.01
讨论
目前，公认CYPIA1有2个多态性位点，分别是3′端MspI多态性和第7外显子4 889位多态性。Hayashi等[3]发现患肺癌的危险与此区域多态性及吸烟剂量有关，如第7外显子突变患肺癌风险增加3倍。而且证明2种多态性完全相关。
我们发现食管癌病例C型所占比例(35.1%)明显高于对照组(13.1%)。按吸烟与否分层后，无论是吸烟组还是非吸烟组B、C两型病例组仍高于对照组，C型尤其显著；在型别组中，只有A型中病例的吸烟率明显高于对照，但将B、C两组合并后，病例组的吸烟率明显高于对照组。由此说明CYPIA1的3种基因型中，C型对食管癌的易感性最高，而A型可能需要有较高的吸烟暴露。另外，B、C两型中吸烟率差异不显著的原因可能与样本量较少有关，合并后样本增大，显示出4 889位突变后，吸烟有更为强大的作用。
, 百拇医药
吸烟与CYPIA1 4 889位突变的联合作用和剂量反应关系证明，吸烟加重了患食管癌的危险，从而证实C型P450IA1激活香烟中致癌物的能力最强。
CYPIA1在人群中的遗传多态性导致不同个体患食管癌易感程度的差异，从某种程度上解释了所有吸烟者中，仅有少数发生食管癌的原因，并且证实食管癌确为遗传与环境共同作用的多因素疾病。
另外，人体内生物代谢酶还包括谷胱苷肽转移酶、N-乙酰转化酶、微粒体环氧化物酶以及不同类型的P450酶等，这些酶对进入人体内的不同化合物发挥着激活或灭活作用，在人群中又可表现出一定的多态性，因而可能与某种肿瘤的易感性差异有关。研究这种差异可以为解释不同部位肿瘤的发生机制提供线索，为筛选易患肿瘤的高危人群提供生物学标志，并可以更有针对性和更有效地预防肿瘤。
基金项目：国家自然科学基金资助(39670651)
, 百拇医药
参考文献
[1]乔贵宾，王嫣，阎明晓，等. 吸烟和遗传因素与西安地区食管癌关系的病例对照研究. 第四军医大学学报，1997,18,150-152.
[2]Petersen DD, McKinney CE, Ikeya K, et al. Human CYPIA1 gene: cosegregation of the enzyme inducibility phenotype and RFLP. Am J Hum Genet, 1991,48:720-725.
[3]Hayashi S, Watanabe J, Nakachi K, et al. Genetic linkage of lung cancer - associated MspI polymorphisms with amino acid replacement in the heme binding region of the human cytochrome P450IA1 gene. J Biochem, 1991,110:407-411.
收稿日期：1999-03-23, 百拇医药
单位：张宏艳(第四军医大学流行病学教研室)；孙长生(第四军医大学流行病学教研室)；李良寿(第四军医大学流行病学教研室)；阎明晓(第四军医大学流行病学教研室)
关键词：食管肿瘤；细胞色素P-450；基因型
中华预防医学杂志000202 摘 要：目的 探讨细胞色素P450IA1(CYPIA1)的3种基因型患食管癌易感程度的差异，及其与吸烟的联合作用。方法 采用病例对照研究和PCR检测手段的分子流行病学方法，比较CYPIA1基因型在食管癌患者和对照者中的分布频率。结果 CYPIA1 3种基因型在食管癌病例组和对照组的分布差异有显著性；吸烟与CYPIA1的4 889位突变在食管癌发生中具有联合作用，呈相加模型(SIA=1.56)，并有显著的剂量反应关系。突变使患食管癌的危险增加3倍。结论 CYPIA1的4 889位突变可能是食管癌发生的重要宿主易感因素之一，与吸烟共同作用使患食管癌的危险显著增加。
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Cytochrome P450IA1 and the genetic susceptibility to esophageal carcinoma
ZHANG Hongyan, SUN Changsheng, LI Liangshou, et al.
(Department of Epidemiology, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710033, China)
Abstract：Objectives To explore the susceptibility to esophageal carcinoma (EC) in different population with different cytochrome P450 IA1 (CYPIA1) genotype, and study the synergistic effects between CYPIA1 and smoking. Methods A case-control study (case=111, control=114) was used to compare the frequency of CYPIA1 genotype between EC and controls with a PCR method. Results The distribution of three genotypes of CYPIA1 in EC and controls was significantly different (χ2=19.35, P<0.01). There was a synergistic effect between the mutation of CYPIA1 4 889 site and smoking (SIA=1.56), and a significant dose-response effect was observed. The risk of individual whose CYPIA1 4 889 site is mutated was 3 times higher than those not mutated. Conclusions The mutation of CYPIA1 4 889 site maybe one of important host susceptible factors of EC, and the risk would increase significantly in smokers.
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Key words：Esophageal neoplasms；Cytochrome P-450；Genotype
人类肿瘤发生过程中，对外来化合物易感性的个体差异，是重要的宿主因素。环境中的前致癌物进入体内后，约95%需经细胞色素P450酶激活形成亲电子的终致癌物。多年研究发现，吸烟是西安地区食管癌发生的重要环境因素[1]，而香烟中的主要致癌物——多环芳烃类化合物(PAH)在体内主要经细胞色素P450IA1(CYPIA1)激活，由于CYPIA1第7外显子4 889位碱基的差异，导致462位氨基酸的不同，成为异亮氨酸(Ile)或缬氨酸(Val)。人群中呈现3种不同基因型的CYPIA1: A型(Ile/Ile), B型(Ile/Val), C型(Val/Val)[2]。其中C型活化PAH能力最强，B型次之，A型最弱。本研究旨在分析CYPIA1在食管癌病例与对照中的基因型分布，探讨其与食管癌遗传易感性的关系。
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1.研究对象：111例病例来自1997年9月～1998年10月第四军医大学第一和第二附属医院胸外科由病理学确诊的食管癌连续病例，并且要求无任何其他部位肿瘤, 未经放疗和化疗。对照组Ⅰ(44例)来自同期在消化科内镜室检查的非肿瘤门诊患者，对照组Ⅱ(70例)属健康体检者，且年龄在45岁以上。两组均为在西安地区生活15年以上的常住居民，年龄、性别职业等分布均衡。
2.调查内容：一般人口学特征及食管癌危险因素(吸烟、饮酒、家族史等)。
3.标本收集：病例标本来自手术切除的食管癌组织; 对照组Ⅰ的标本是内镜下取材的食管组织; 对照组Ⅱ为被检者静脉血5 ml，离心去血清后剩余的血凝块。均保存于-70℃冰箱。
4.实验: 模本DNA的提取, 将研磨后的食管组织或被吹打细碎的血凝块组织经蛋白酶K消化后，用酚-氯仿抽提数次、乙醇和Na+沉淀、DNA溶解液溶解后保存于-20℃。
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PCR反应, 每例DNA模本分别经引物P1(5′-CGGAAGTGTATCGGTGAGACC-3′)与P2(5′-GTAGAC- AGAGTCTAGGCCTCA-3′), P1′(P1的3′端A→G)与P2(分别编为a管和b管)进行PCR扩增，产物约为200 bp片段。反应混合物含10×Buffer(1.5 mmol/L Mg2+)、200 μmol/L dNTP、2种引物各0.25 μmol/L、1 U TaqDNA聚合酶，其余以水补足总体积至50 μl。PCR循环条件为：94℃变性55 s、60℃复性1.5 min、72℃延伸1 min，经35个循环后继续在72℃延伸7 min。
电泳及结果判定, PCR反应产物于2.0% Agarose凝胶、电泳缓冲液中，在电压40 V、电流25 mA的条件下进行电泳。电泳后于300 nm的紫外光透射分析仪上观察、拍照。电泳后凝胶上的同一模本显示2条200 bp的条带则为Ile/Val杂合体；若只显示其中1条，则为Ile/Ile或Val/Val型(图1)。
a、b分别代表Ile、Va1等位基因，2、4为A型，1为B型，3为C型，5为阳性对照，M为100 bp的DNA Ladder, 百拇医药
图1 CYP450IA1基因型检测PCR扩增产物电泳结果
5.主要设备和试剂：TaqDNA聚合酶、dNTP购自华美公司。PCR扩增仪为PE公司产480型，紫外光透射分析仪为上海康华生化仪器厂产2 F型，电泳仪为北京六一仪器厂产DYY-Ⅱ1型。所有试剂均为分析纯。
结果
1. CYPIA1 3种基因型在食管癌病例、对照组Ⅰ、对照组Ⅱ中的分布情况见表1，三者分布差异有显著性(P<0.01)。因为2个对照组分布无差异(P=0.365)，合并分析。
2. CYPIA1基因型分布按吸烟与否分层分析(表2)。结果显示，只有A型中，病例组的吸烟率明
表1 CYPIA1基因型在食管癌病例组和对照组中的分布例数 CYPIA1基因型
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病例组
对照组Ⅰ
对照组Ⅱ
A型
31 (27.9)
25 (56.8)
34 (48.6)
B型
41 (36.9)
12 (27.3)
28 (40.0)
C型
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7 (15.9)
8 (11.4)
合计
111(100.0)
44(100.0)
70(100.0)
括号内为构成比(%)
表2 食管癌患者与对照组CYPIA1基因型分布与吸烟的分层分析 项目
A型(例)
B型(例)
, http://www.100md.com C型(例)
χ2值
P值
病例
对照
病例
对照
病例
对照
吸烟组
23
30
23
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15
26
7
10.60
0.005
非吸烟组
8
29
18
25
13
8
9.50
, 百拇医药 0.009
χ2值
4.52
2.78
1.79
P值
0.033
0.096
0.181
OR值
2.78
2.13
2.29
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95%CI
0.98～8.08
0.80～5.73
0.58～9.16
显高于对照组(P=0.033)。
3. CYPIA1基因型与环境暴露(吸烟)对食管癌患病风险的联合作用及剂量反应关系。表3显示CYPIA14 889位突变与吸烟在患食管癌中呈相加模型的协同作用，SIA=8.07/(2.78+3.40-1)=1.56。表4是以Ile/Ile型的非吸烟者OR值作为1.00，将不同基因型及不同吸烟暴露与之相比，计算相应的OR(95%CI)值。结果表明，随着等位基因Ile→Val突变数与吸烟共同作用剂量的增加，患食管癌的风险逐渐增高。
表3 CYPIA1第7外显子突变与吸烟的协同作用 Ile→Val
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吸烟
病例
(例)
对照
(例)
OR值
95%CI
χ2值
P值
-
-
8
29
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1.00
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+
23
30
2.78
0.98～ 8.08
4.52
0.033
+
-
31
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3.40
6.24～ 9.56
7.04
0.008
+
+
49
22
8.07
2.93～22.95
21.72
0.000
表4 吸烟与CYPIA1 突变共同作用的剂量反应关系(OR值及95%CI) CYPIA1
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非吸烟者
吸烟者
Ile/Ile
1.00
2.78 (0.98～ 8.08)*
Ile/Val
2.61 (0.88～ 7.94)
5.56 (1.81～17.64)**
Val/Val
5.89 (1.57～23.08)**
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13.46 (3.78～51.00)**
χ2 趋势=25.465
P<0.01
* P<0.05，** P<0.01
讨论
目前，公认CYPIA1有2个多态性位点，分别是3′端MspI多态性和第7外显子4 889位多态性。Hayashi等[3]发现患肺癌的危险与此区域多态性及吸烟剂量有关，如第7外显子突变患肺癌风险增加3倍。而且证明2种多态性完全相关。
我们发现食管癌病例C型所占比例(35.1%)明显高于对照组(13.1%)。按吸烟与否分层后，无论是吸烟组还是非吸烟组B、C两型病例组仍高于对照组，C型尤其显著；在型别组中，只有A型中病例的吸烟率明显高于对照，但将B、C两组合并后，病例组的吸烟率明显高于对照组。由此说明CYPIA1的3种基因型中，C型对食管癌的易感性最高，而A型可能需要有较高的吸烟暴露。另外，B、C两型中吸烟率差异不显著的原因可能与样本量较少有关，合并后样本增大，显示出4 889位突变后，吸烟有更为强大的作用。
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吸烟与CYPIA1 4 889位突变的联合作用和剂量反应关系证明，吸烟加重了患食管癌的危险，从而证实C型P450IA1激活香烟中致癌物的能力最强。
CYPIA1在人群中的遗传多态性导致不同个体患食管癌易感程度的差异，从某种程度上解释了所有吸烟者中，仅有少数发生食管癌的原因，并且证实食管癌确为遗传与环境共同作用的多因素疾病。
另外，人体内生物代谢酶还包括谷胱苷肽转移酶、N-乙酰转化酶、微粒体环氧化物酶以及不同类型的P450酶等，这些酶对进入人体内的不同化合物发挥着激活或灭活作用，在人群中又可表现出一定的多态性，因而可能与某种肿瘤的易感性差异有关。研究这种差异可以为解释不同部位肿瘤的发生机制提供线索，为筛选易患肿瘤的高危人群提供生物学标志，并可以更有针对性和更有效地预防肿瘤。
基金项目：国家自然科学基金资助(39670651)
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参考文献
[1]乔贵宾，王嫣，阎明晓，等. 吸烟和遗传因素与西安地区食管癌关系的病例对照研究. 第四军医大学学报，1997,18,150-152.
[2]Petersen DD, McKinney CE, Ikeya K, et al. Human CYPIA1 gene: cosegregation of the enzyme inducibility phenotype and RFLP. Am J Hum Genet, 1991,48:720-725.
[3]Hayashi S, Watanabe J, Nakachi K, et al. Genetic linkage of lung cancer - associated MspI polymorphisms with amino acid replacement in the heme binding region of the human cytochrome P450IA1 gene. J Biochem, 1991,110:407-411.
收稿日期：1999-03-23, 百拇医药