脂肪酸组成对化学物诱导的结肠癌变危险性机理的研究*
作者：周少波 陈炳卿 王蓬勃 王桂杰
单位：哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，哈尔滨 150001
关键词：脂肪酸组成；结肠粘膜；增生细胞核抗原；膜脂流动性；前列腺素E2
脂肪酸组成对化学物诱导的结肠癌变危险性机理的研究摘要 大鼠喂以含15%脂肪，但是脂肪酸组成不一致的5组半合成饲料，实验期给以甲基亚硝基脲诱导结肠肿瘤，观察脂肪组成对处于增生危险的大鼠结肠粘膜的增生细胞核抗原(PCNA)、碱性磷酸酶活性(ALP)、膜脂流动性、前列腺素E2(PGE2)及细胞动力学的影响。结果表明：含饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸成分最少而含n-6多不饱和脂肪酸(PUFA)成分最高的第3组，PCNA和PI标志的S期细胞数最多，ALP活性较高；含n-3PUFA比例最高的第4组，PCNA和PI标志的S期细胞数、ALP活性及PGE2含量最少，而膜脂流动性最好。结果提示，含n-3 PUFA较高比例的脂肪酸组成降低由化学物诱导的结肠癌变危险性，其机制之一可能是，通过减少结肠粘膜PCNA、PI标志的S期细胞数、ALP活性、保护膜脂流动性及减少PGE2生成等进行。
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中图分类号 R735.35 R155.3
Research on the mechanism of the fatty acid composition
on the tumorigenic danger induced by chemical
tumorigenic material
Zhou Shaobo，Chen Bingqing, Wang Pengbo, Wang Guijie
Department of Nutrition and Food Hygiene, Public Health College,Harbin Medical University, Harbin 150001,China
, 百拇医药
Rats were given 5 kinds of diets which contained 15% (w/w)fat and different fatty acids composition. The rats were given methyl-nitrosurea (MNU) to induce colonic tumor. Proliferation cell nuclear antigen (PCNA), cell kinetics, membrane fluidity, the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the content of prostaglandin E2(PGE2) in colonic mucosa were determined in order to assess the fatty acids composition on the colonic cell tumorigenesis. The results indicated that the cells of PCNA, cells of PI labeled in S period and the activity of ALP were the highest in the 3rd group which contained lowest saturated fatty acids (SFA) and monounsaturated fatty acids (MUFA) and highest n-6 polyunsaturated fatty acids. Whereas ,these indexes and PGE2 were lowest and membrane fluidity was the best in the 4th group which contained the highest n-3 PUFA. It is considered that the inhibition tumorigenesis of n-3 PUFA may be related to its effects of decreaing PCNA, PGE2，cells in S period and increasing membrane fluidity.
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Key words: fatty acids composition, colonic mucosa, proliferation cell nuclear antigen membrane fluidity
结肠癌为我国第四高发癌症，在美国居癌症之首。随着我国居民膳食结构和饮食方式的逐步西方化，结肠癌的发病率也会迅速提高。由于结肠癌术后5年存活率较低，那么如何预防和治疗结肠癌就成为医学界亟待解决的课题。较多研究认为结肠癌与膳食中摄入的动物脂肪量呈正相关，脂肪酸的种类和组成也影响癌变的危险性[1]。人们积极探讨食物中饱和脂肪、单不饱和脂肪和多不饱和脂肪的适宜比例为多少，才能既对健康有利又有较佳的抑癌效果。我们已经报道了较好的抑制甲基亚硝基脲(MNU)诱导的结肠肿瘤生成的脂肪酸组成。本文是通过研究脂肪酸组成对结肠粘膜增生的细胞核抗原(PCNA)、前列腺素E2和膜脂流动性等指标的影响，以探讨脂肪酸组成对MNU诱导的结肠肿瘤生成影响的可能机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物
50只清洁级雄性SD大鼠(123±11)g(上海西普尔必凯实验动物有限公司提供)，适应一周后按体重随机分为5组，每组10只，不锈钢笼饲养，每笼2只，实验期180天，喂半合成饲料，饮蒸馏水，实验期经腹腔注射给以30mg/kg体重剂量的MNU诱导结肠肿瘤生成，每周1次，共6次。取远端无肿瘤的结肠组织测定指标。
1.2 实验饲料
1.2.1 基础饲料 按AIN-76TM配方[2]，略加调整淀粉与蔗糖的比例、不含纤维素的半合成饲料。其主要成分如表1。
表1 饲料主要成分 %
成 分
, 百拇医药
组成
成 分
组成
酪蛋白
20.0
混合无机盐
3.5
淀 粉
30.0
混合维生素
1.0
蔗 糖
30.0
, 百拇医药
氯化胆碱
0.2
DL-蛋氨酸
0.3
脂 肪
15.0
1.2.2 实验饲料 各组实验饲料含脂肪量为15%，但是组成不一致，各组均含有2%的玉米油(黑龙江黑龙制药公司提供)，以防止必需脂肪酸的缺乏，其它脂肪酸用牛油(市售牛脂购回后自己加工熬制)，豆油(元宝牌，南海油脂工业公司生产)，紫草油(黑龙江宏图公司赞助)和鱼油乙酯(黑龙制药厂提供)调整为如表2的比例。各种油脂的脂肪酸组成见参考文献[3] 表2 饲料脂肪酸组成表(1) %
分组
, 百拇医药
C16∶0
C16∶1
C18∶0
C18∶1
C18∶2
C18∶3
C18∶4
C20∶5
C22：6
1
0.209
0.034
0.269
, 百拇医药
0.305
0.129
0.057
2
0.119
0.050
0.263
0.560
0.070
3
0.058
0.022
0.142
, 百拇医药
0.272
0.385
0.112
4
0.117
0.003
0.023
0.161
0.201
0.089
0.154
0.244
5
, 百拇医药
0.100
0.010
0.089
0.210
0.264
0.152
0.028
0.050
0.079
分组
SFA
MUFA
PUFA
, 百拇医药
n-6/n-3
M/S
P/S
1
0.478
0.339
0.186
0.709
0.389
2
0.169
0.263
0.630
, 百拇医药
1.556
3.728
3
0.080
0.142
0.769
4.53
1.775
9.613
4
0.139
0.164
0.688
, 百拇医药
0.73
1.180
4.950
5
0.189
0.220
0.573
1.95
1.164
3.032
注：(1) SFA：饱和脂肪酸；MUFA：单不饱和脂肪酸；PUFA：多不饱和脂肪酸；n-6/n-3为n-6系列脂肪酸/n-3系列脂肪酸；M/S与P/S分别为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸之比
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1.3 结肠粘膜细胞动力学测定
采用Thornton的流式细胞学测定方法[4]。基本步骤是：用冰冷的生理盐水冲洗结肠→70%乙醇固定→制备单一细胞核悬浮液→调整细胞核浓度为1×109个/L→分别加入anti-PCNA(抗-增生细胞核抗原)和标记FITC的鼠IgG抗体，最后将其悬浮于含PI的PBS，用Becton Dickinson公司的流式细胞仪分析。每一动物至少分析1万个细胞核。
1.4 结肠粘膜细胞的膜脂流动性测定
用冰冷的生理盐水冲洗肠腔，取远端结肠，用载玻片刮粘膜于PBS(pH7.4)中，1500r/10min离心7min后，加入0.4mg/L0.01HCl的胃蛋白酶消化液，在37℃振荡孵育13min，用滴管将组织吹打分散成细胞悬浮液，再以1500r/min离心10min，将其悬浮于含BSA2.5%的PBS中，调整细胞浓度为109ml，取1ml细胞悬液加入4ml2×10-6mol/L DPH溶液，于25℃条件下温育30min，用Schimadzn RF540荧光分光光度计测偏振度[5]。
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1.5 结肠组织中碱性磷酸酶活性和前列腺素E2测定
先将组织制成匀浆，按试剂盒说明的步骤进行，碱性磷酸酶试剂盒由北京中生生物公司生产，前列腺素E2试剂盒由北京长城生物公司生产。
1.6 统计学分析
使用Statistics软件。率的比较使用χ2分析的方法，组间均数的比较使用方差分析的方法。
2 结果
2.1 对结肠粘膜细胞动力学的影响
表3结果表明，各组PCNA表达有很大差异，第3组的显著高于第2、4和1组，第2组的亦显著高于第4组和1组；从PI标记的细胞数来看，各组G1期细胞数没有显著差异，S期细胞各组之间有显著差异，顺次为3组、2组、4组，1组的最低。G1和G2+M期的细胞数各组之间无显著差异。
, 百拇医药
表3 各组细胞PCNA表达及PI标志的细胞数(1) %
分组
PCNA总数
G1
S
G2+M
1
17.1± 1.2a
89
3.4a
5.4
2
, 百拇医药
24.7± 4.9b
88
4.8b
5.0
3
34.5±11.8c
87
6.6c
4.7
4
18.9± 3.6a
, 百拇医药 92
3.2a
5.2
注：(1) 同列不同字母表示该两组之间比较，差异显著P<0.05
2.2 对结肠粘膜组织碱性磷酸酶活性、细胞膜脂流动性及前列腺素E2的影响
表4 结肠粘膜组织碱性磷酸酶活性、细胞膜脂流动性及前列腺素E2(1)
分组
碱性磷酸酶
〔m mol/(min.g)〕
偏振度
, 百拇医药
前列腺素E2
1
0.693±0.112a
0.190±0.026a
75.5±10.6a
2
0.671±0.141a
0.170±0.024
66.5±11.6a
3
, 百拇医药 0.651±0.126a
0.179±0.032
62.8±13.5
4
0.405±0.063b
0.156±0.013b
51.2±10.0b
5
0.181±0.012a
64.4±12.5
注：(1) 同表3 表4结果表明，第1、2和3组的碱性磷酸酶活性显著高于第4组(P<0.01)；第4组荧光偏振度最小，即膜脂流动性最大，显著高于第1和第5组；前列腺素E2以第4组的最小，显著低于第1和第2组。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 脂肪酸组成、PCNA与结肠癌变危险性
在细胞循环周期中，往往出现许多数量内源性细胞蛋白，即环素蛋白(Cyclin)，它的合成与细胞的增生状态有关，它可以调整正常细胞蛋白的表达，影响细胞的生物学活性。研究表明在正常增生和转运的细胞中存在着不同数量的Cyclin，在细胞循环中，它的数量处于波动状态，在S期显著增多。PCNA正好可以反映Cyclin的数量变化，PCNA在细胞增生的启始阶段起着重要的作用。G0期PCNA不表达，但从G1末期到早S期PCNA表达显著。2个PCNA亚群存在于细胞核，约有30%的PCNA与DNA复制位点紧密相连，该抗原与S期紧密相连。在大鼠由癌前病变变为癌症的过程中PCNA表达增加[6]。由于PCNA与DNA复制位点紧密相连，故它的表达与否对于控制从G0期到早S期DNA复制位点起一定的作用，并进一步影响了细胞的增殖。Reddy喂给动物含玉米油较高比例的饲料[7]，表明了比例越高越易增加增生，进而增加癌症的危险性，这使得其诱发肿瘤的危险性越大。Thornton通过对结肠细胞增生动力学研究认为脂肪酸不饱和程度较高[4]，即含n-6脂肪酸较多的玉米油要比饱和的牛脂更易促进增生细胞核抗原的表达，进而增加其结肠癌变的危险性。表3结果表明，化学物诱导的喂以饲料含脂肪酸组成不同的大鼠粘膜细胞PCNA表达有很大差异；从PI标记的细胞数来看，S期细胞各组之间有显著差异，并与anti-PCNA标记总的细胞数基本一致，表明与文献报道的PCNA与S期紧密相连是一致的。反映了长期摄入脂肪酸组成不同的饲料，可以影响PCNA的表达。且其表达的强弱与产生的结肠肿瘤数一致[2]。第4组富含n-3系列脂肪酸，使大鼠结肠粘膜细胞PCNA表达的较少，可能导致δ—DNA聚合酶辅助蛋白下降，从而影响了该酶活性，减少了异常细胞的增殖，抑制MNU对肿瘤的启动过程。
, 百拇医药
3.2 脂肪酸组成对细胞膜脂流动性、前列腺素E2含量及碱性磷酸酶活性的影响与结肠癌变危险性
膜脂流动性主要受膜脂性质及膜脂与膜其它组份(特别是蛋白质)之间相互作用的影响。脂肪酸的饱和度，不同磷脂的比例对膜脂流动性的影响较大。正常细胞的生理功能均要求膜脂具有适宜的流动性。自由基通过氧化生物膜使其不饱和脂肪酸因氧化而减少，膜脂的流动性下降，并使细胞丧失了正常的生理功能。膜脂流动性对细胞功能的影响主要体现在对蛋白质功能的影响上，通过改变界面脂性质，进而改变功能蛋白质的构象(如对载体、酶活性的影响)。影响了蛋白质在膜上的运动并影响受体的功能[8]。饱和脂肪酸比重较大的第1组，其膜脂偏振度最大，即膜脂流动性最低。第3组和第4组饲料中的PUFA，前者高于后者，但是n-6/n-3比值不一致，第4组中富含n-3系列脂肪酸，它能提高磷脂酰链的不饱和度而降低胆固醇与磷脂的比值，这可能是该组结肠粘膜细胞的膜脂流动性最大的原因之一。摄入的PUFA(x)与膜流动性P(y)的相关系数(r)为0.710(P=0.170)，回归方程为
=0.156-0.06X。第4组饲料的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的组成为(%)14.9，16.4和68.8，它使生物膜有较好的膜脂流动性，这可能是它能较好的抑制结肠肿瘤的原因之一。
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适量的PGE2对机体是有益的，可以保证正常细胞的生长，过多就会对机体产生不利影响，如它可以抑制体外培养的T和B细胞的有丝分裂，减少白细胞介素1和2的产生，降低T细胞对白介素2的反应，抑制血淋巴细胞分泌的巨噬细胞胶原酶的合成，从而抑制自然杀伤细胞活力和抑制激活的巨噬细胞肿瘤杀伤活力[9]。脂肪来源可能影响体内合成前列腺素E2的量，这主要与其在代谢过程中生成的花生四烯酸的量呈正相关。我们测得各组大鼠体脂中的花生四烯酸的量有差异，第4组花生四烯酸的量最少，而其它各组均较多，第4组前列腺素也最少。细胞增生活跃的组织中碱性磷酸酶活性增加，第4组的显著低于第1、2、3组(表4)，也反映了这一点。
综合以上分析，我们认为含n-3 PUFA较高比例的脂肪酸组成降低由化学物诱导的结肠癌变危险性的机制之一，可能是通过减少结肠粘膜PCNA、PI标志的S期细胞数、ALP活性、保护膜脂流动性及减少PGE2等进行。
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* 国家教委研究生经费资助
作者简介：周少波，男，博士，副教授，现为中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所博士后
王蓬勃 汕头大学医学院生理教研室
王桂杰 佳木斯大学医学院生化教研室
参考文献
[1] 周少波，陈炳卿.脂肪与结肠癌关系的研究进展.国外医学卫生学分册，1998，25：267—270
[2] American Institute of Nutrition. Report of the American institute of nutrition. ad hoc comitted on standards of nutritional studies. J Nutr, 1977,107:1340—1348
, http://www.100md.com
[3] 王桂杰，魏晓东，周少波，等.食用油脂成分和过氧化值测定.佳木斯医学院学报，1997，20：8—10
[4] Thornton WH, MacDonald RS. Dietary fat quantity and composition alter colon cell kinetics in growing rats. Ann Nutr Metab, 1994, 38：270—277
[5] Zhou SB, Zhao XJ, Chen BQ. Research on antigonism of shikonin to xxidative injury.哈尔滨医科大学学报，1996,30:524—526
[6] Ottaviol，Chang CD, Rizzo MG, et al. Importance of introns in the growth regulation of mRNA levels of the proliferating cell nuclear antigen. Mol Cell Biol, 1990, 10:303—307
, 百拇医药
[7] Reddy BS. Dietary fat and colon cancer: animal model studies. Lipids, 1992, 27: 807—810
[8] 扬福榆.生物膜的流动性与功能.国外医学分子生物学分册，1982，4,151—154
[9] Lokesh BR, Hsieh HL, Kinsella. Alterations in the lipids and prostaglandins in mouse spleen following the ingestion of menhaden oil. Ann Nutr Metab, 1986, 30:357—361
(1998-08-23收稿), http://www.100md.com
单位：哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，哈尔滨 150001
关键词：脂肪酸组成；结肠粘膜；增生细胞核抗原；膜脂流动性；前列腺素E2
脂肪酸组成对化学物诱导的结肠癌变危险性机理的研究摘要 大鼠喂以含15%脂肪，但是脂肪酸组成不一致的5组半合成饲料，实验期给以甲基亚硝基脲诱导结肠肿瘤，观察脂肪组成对处于增生危险的大鼠结肠粘膜的增生细胞核抗原(PCNA)、碱性磷酸酶活性(ALP)、膜脂流动性、前列腺素E2(PGE2)及细胞动力学的影响。结果表明：含饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸成分最少而含n-6多不饱和脂肪酸(PUFA)成分最高的第3组，PCNA和PI标志的S期细胞数最多，ALP活性较高；含n-3PUFA比例最高的第4组，PCNA和PI标志的S期细胞数、ALP活性及PGE2含量最少，而膜脂流动性最好。结果提示，含n-3 PUFA较高比例的脂肪酸组成降低由化学物诱导的结肠癌变危险性，其机制之一可能是，通过减少结肠粘膜PCNA、PI标志的S期细胞数、ALP活性、保护膜脂流动性及减少PGE2生成等进行。
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中图分类号 R735.35 R155.3
Research on the mechanism of the fatty acid composition
on the tumorigenic danger induced by chemical
tumorigenic material
Zhou Shaobo，Chen Bingqing, Wang Pengbo, Wang Guijie
Department of Nutrition and Food Hygiene, Public Health College,Harbin Medical University, Harbin 150001,China
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Rats were given 5 kinds of diets which contained 15% (w/w)fat and different fatty acids composition. The rats were given methyl-nitrosurea (MNU) to induce colonic tumor. Proliferation cell nuclear antigen (PCNA), cell kinetics, membrane fluidity, the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the content of prostaglandin E2(PGE2) in colonic mucosa were determined in order to assess the fatty acids composition on the colonic cell tumorigenesis. The results indicated that the cells of PCNA, cells of PI labeled in S period and the activity of ALP were the highest in the 3rd group which contained lowest saturated fatty acids (SFA) and monounsaturated fatty acids (MUFA) and highest n-6 polyunsaturated fatty acids. Whereas ,these indexes and PGE2 were lowest and membrane fluidity was the best in the 4th group which contained the highest n-3 PUFA. It is considered that the inhibition tumorigenesis of n-3 PUFA may be related to its effects of decreaing PCNA, PGE2，cells in S period and increasing membrane fluidity.
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Key words: fatty acids composition, colonic mucosa, proliferation cell nuclear antigen membrane fluidity
结肠癌为我国第四高发癌症，在美国居癌症之首。随着我国居民膳食结构和饮食方式的逐步西方化，结肠癌的发病率也会迅速提高。由于结肠癌术后5年存活率较低，那么如何预防和治疗结肠癌就成为医学界亟待解决的课题。较多研究认为结肠癌与膳食中摄入的动物脂肪量呈正相关，脂肪酸的种类和组成也影响癌变的危险性[1]。人们积极探讨食物中饱和脂肪、单不饱和脂肪和多不饱和脂肪的适宜比例为多少，才能既对健康有利又有较佳的抑癌效果。我们已经报道了较好的抑制甲基亚硝基脲(MNU)诱导的结肠肿瘤生成的脂肪酸组成。本文是通过研究脂肪酸组成对结肠粘膜增生的细胞核抗原(PCNA)、前列腺素E2和膜脂流动性等指标的影响，以探讨脂肪酸组成对MNU诱导的结肠肿瘤生成影响的可能机制。
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1 材料与方法
1.1 动物
50只清洁级雄性SD大鼠(123±11)g(上海西普尔必凯实验动物有限公司提供)，适应一周后按体重随机分为5组，每组10只，不锈钢笼饲养，每笼2只，实验期180天，喂半合成饲料，饮蒸馏水，实验期经腹腔注射给以30mg/kg体重剂量的MNU诱导结肠肿瘤生成，每周1次，共6次。取远端无肿瘤的结肠组织测定指标。
1.2 实验饲料
1.2.1 基础饲料 按AIN-76TM配方[2]，略加调整淀粉与蔗糖的比例、不含纤维素的半合成饲料。其主要成分如表1。
表1 饲料主要成分 %
成 分
, 百拇医药
组成
成 分
组成
酪蛋白
20.0
混合无机盐
3.5
淀 粉
30.0
混合维生素
1.0
蔗 糖
30.0
, 百拇医药
氯化胆碱
0.2
DL-蛋氨酸
0.3
脂 肪
15.0
1.2.2 实验饲料 各组实验饲料含脂肪量为15%，但是组成不一致，各组均含有2%的玉米油(黑龙江黑龙制药公司提供)，以防止必需脂肪酸的缺乏，其它脂肪酸用牛油(市售牛脂购回后自己加工熬制)，豆油(元宝牌，南海油脂工业公司生产)，紫草油(黑龙江宏图公司赞助)和鱼油乙酯(黑龙制药厂提供)调整为如表2的比例。各种油脂的脂肪酸组成见参考文献[3] 表2 饲料脂肪酸组成表(1) %
分组
, 百拇医药
C16∶0
C16∶1
C18∶0
C18∶1
C18∶2
C18∶3
C18∶4
C20∶5
C22：6
1
0.209
0.034
0.269
, 百拇医药
0.305
0.129
0.057
2
0.119
0.050
0.263
0.560
0.070
3
0.058
0.022
0.142
, 百拇医药
0.272
0.385
0.112
4
0.117
0.003
0.023
0.161
0.201
0.089
0.154
0.244
5
, 百拇医药
0.100
0.010
0.089
0.210
0.264
0.152
0.028
0.050
0.079
分组
SFA
MUFA
PUFA
, 百拇医药
n-6/n-3
M/S
P/S
1
0.478
0.339
0.186
0.709
0.389
2
0.169
0.263
0.630
, 百拇医药
1.556
3.728
3
0.080
0.142
0.769
4.53
1.775
9.613
4
0.139
0.164
0.688
, 百拇医药
0.73
1.180
4.950
5
0.189
0.220
0.573
1.95
1.164
3.032
注：(1) SFA：饱和脂肪酸；MUFA：单不饱和脂肪酸；PUFA：多不饱和脂肪酸；n-6/n-3为n-6系列脂肪酸/n-3系列脂肪酸；M/S与P/S分别为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸之比
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1.3 结肠粘膜细胞动力学测定
采用Thornton的流式细胞学测定方法[4]。基本步骤是：用冰冷的生理盐水冲洗结肠→70%乙醇固定→制备单一细胞核悬浮液→调整细胞核浓度为1×109个/L→分别加入anti-PCNA(抗-增生细胞核抗原)和标记FITC的鼠IgG抗体，最后将其悬浮于含PI的PBS，用Becton Dickinson公司的流式细胞仪分析。每一动物至少分析1万个细胞核。
1.4 结肠粘膜细胞的膜脂流动性测定
用冰冷的生理盐水冲洗肠腔，取远端结肠，用载玻片刮粘膜于PBS(pH7.4)中，1500r/10min离心7min后，加入0.4mg/L0.01HCl的胃蛋白酶消化液，在37℃振荡孵育13min，用滴管将组织吹打分散成细胞悬浮液，再以1500r/min离心10min，将其悬浮于含BSA2.5%的PBS中，调整细胞浓度为109ml，取1ml细胞悬液加入4ml2×10-6mol/L DPH溶液，于25℃条件下温育30min，用Schimadzn RF540荧光分光光度计测偏振度[5]。
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1.5 结肠组织中碱性磷酸酶活性和前列腺素E2测定
先将组织制成匀浆，按试剂盒说明的步骤进行，碱性磷酸酶试剂盒由北京中生生物公司生产，前列腺素E2试剂盒由北京长城生物公司生产。
1.6 统计学分析
使用Statistics软件。率的比较使用χ2分析的方法，组间均数的比较使用方差分析的方法。
2 结果
2.1 对结肠粘膜细胞动力学的影响
表3结果表明，各组PCNA表达有很大差异，第3组的显著高于第2、4和1组，第2组的亦显著高于第4组和1组；从PI标记的细胞数来看，各组G1期细胞数没有显著差异，S期细胞各组之间有显著差异，顺次为3组、2组、4组，1组的最低。G1和G2+M期的细胞数各组之间无显著差异。
, 百拇医药
表3 各组细胞PCNA表达及PI标志的细胞数(1) %
分组
PCNA总数
G1
S
G2+M
1
17.1± 1.2a
89
3.4a
5.4
2
, 百拇医药
24.7± 4.9b
88
4.8b
5.0
3
34.5±11.8c
87
6.6c
4.7
4
18.9± 3.6a
, 百拇医药 92
3.2a
5.2
注：(1) 同列不同字母表示该两组之间比较，差异显著P<0.05
2.2 对结肠粘膜组织碱性磷酸酶活性、细胞膜脂流动性及前列腺素E2的影响
表4 结肠粘膜组织碱性磷酸酶活性、细胞膜脂流动性及前列腺素E2(1)
分组
碱性磷酸酶
〔m mol/(min.g)〕
偏振度
, 百拇医药
前列腺素E2
1
0.693±0.112a
0.190±0.026a
75.5±10.6a
2
0.671±0.141a
0.170±0.024
66.5±11.6a
3
, 百拇医药 0.651±0.126a
0.179±0.032
62.8±13.5
4
0.405±0.063b
0.156±0.013b
51.2±10.0b
5
0.181±0.012a
64.4±12.5
注：(1) 同表3 表4结果表明，第1、2和3组的碱性磷酸酶活性显著高于第4组(P<0.01)；第4组荧光偏振度最小，即膜脂流动性最大，显著高于第1和第5组；前列腺素E2以第4组的最小，显著低于第1和第2组。
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3 讨论
3.1 脂肪酸组成、PCNA与结肠癌变危险性
在细胞循环周期中，往往出现许多数量内源性细胞蛋白，即环素蛋白(Cyclin)，它的合成与细胞的增生状态有关，它可以调整正常细胞蛋白的表达，影响细胞的生物学活性。研究表明在正常增生和转运的细胞中存在着不同数量的Cyclin，在细胞循环中，它的数量处于波动状态，在S期显著增多。PCNA正好可以反映Cyclin的数量变化，PCNA在细胞增生的启始阶段起着重要的作用。G0期PCNA不表达，但从G1末期到早S期PCNA表达显著。2个PCNA亚群存在于细胞核，约有30%的PCNA与DNA复制位点紧密相连，该抗原与S期紧密相连。在大鼠由癌前病变变为癌症的过程中PCNA表达增加[6]。由于PCNA与DNA复制位点紧密相连，故它的表达与否对于控制从G0期到早S期DNA复制位点起一定的作用，并进一步影响了细胞的增殖。Reddy喂给动物含玉米油较高比例的饲料[7]，表明了比例越高越易增加增生，进而增加癌症的危险性，这使得其诱发肿瘤的危险性越大。Thornton通过对结肠细胞增生动力学研究认为脂肪酸不饱和程度较高[4]，即含n-6脂肪酸较多的玉米油要比饱和的牛脂更易促进增生细胞核抗原的表达，进而增加其结肠癌变的危险性。表3结果表明，化学物诱导的喂以饲料含脂肪酸组成不同的大鼠粘膜细胞PCNA表达有很大差异；从PI标记的细胞数来看，S期细胞各组之间有显著差异，并与anti-PCNA标记总的细胞数基本一致，表明与文献报道的PCNA与S期紧密相连是一致的。反映了长期摄入脂肪酸组成不同的饲料，可以影响PCNA的表达。且其表达的强弱与产生的结肠肿瘤数一致[2]。第4组富含n-3系列脂肪酸，使大鼠结肠粘膜细胞PCNA表达的较少，可能导致δ—DNA聚合酶辅助蛋白下降，从而影响了该酶活性，减少了异常细胞的增殖，抑制MNU对肿瘤的启动过程。
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3.2 脂肪酸组成对细胞膜脂流动性、前列腺素E2含量及碱性磷酸酶活性的影响与结肠癌变危险性
膜脂流动性主要受膜脂性质及膜脂与膜其它组份(特别是蛋白质)之间相互作用的影响。脂肪酸的饱和度，不同磷脂的比例对膜脂流动性的影响较大。正常细胞的生理功能均要求膜脂具有适宜的流动性。自由基通过氧化生物膜使其不饱和脂肪酸因氧化而减少，膜脂的流动性下降，并使细胞丧失了正常的生理功能。膜脂流动性对细胞功能的影响主要体现在对蛋白质功能的影响上，通过改变界面脂性质，进而改变功能蛋白质的构象(如对载体、酶活性的影响)。影响了蛋白质在膜上的运动并影响受体的功能[8]。饱和脂肪酸比重较大的第1组，其膜脂偏振度最大，即膜脂流动性最低。第3组和第4组饲料中的PUFA，前者高于后者，但是n-6/n-3比值不一致，第4组中富含n-3系列脂肪酸，它能提高磷脂酰链的不饱和度而降低胆固醇与磷脂的比值，这可能是该组结肠粘膜细胞的膜脂流动性最大的原因之一。摄入的PUFA(x)与膜流动性P(y)的相关系数(r)为0.710(P=0.170)，回归方程为
=0.156-0.06X。第4组饲料的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的组成为(%)14.9，16.4和68.8，它使生物膜有较好的膜脂流动性，这可能是它能较好的抑制结肠肿瘤的原因之一。, http://www.100md.com
适量的PGE2对机体是有益的，可以保证正常细胞的生长，过多就会对机体产生不利影响，如它可以抑制体外培养的T和B细胞的有丝分裂，减少白细胞介素1和2的产生，降低T细胞对白介素2的反应，抑制血淋巴细胞分泌的巨噬细胞胶原酶的合成，从而抑制自然杀伤细胞活力和抑制激活的巨噬细胞肿瘤杀伤活力[9]。脂肪来源可能影响体内合成前列腺素E2的量，这主要与其在代谢过程中生成的花生四烯酸的量呈正相关。我们测得各组大鼠体脂中的花生四烯酸的量有差异，第4组花生四烯酸的量最少，而其它各组均较多，第4组前列腺素也最少。细胞增生活跃的组织中碱性磷酸酶活性增加，第4组的显著低于第1、2、3组(表4)，也反映了这一点。
综合以上分析，我们认为含n-3 PUFA较高比例的脂肪酸组成降低由化学物诱导的结肠癌变危险性的机制之一，可能是通过减少结肠粘膜PCNA、PI标志的S期细胞数、ALP活性、保护膜脂流动性及减少PGE2等进行。
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* 国家教委研究生经费资助
作者简介：周少波，男，博士，副教授，现为中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所博士后
王蓬勃 汕头大学医学院生理教研室
王桂杰 佳木斯大学医学院生化教研室
参考文献
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[3] 王桂杰，魏晓东，周少波，等.食用油脂成分和过氧化值测定.佳木斯医学院学报，1997，20：8—10
[4] Thornton WH, MacDonald RS. Dietary fat quantity and composition alter colon cell kinetics in growing rats. Ann Nutr Metab, 1994, 38：270—277
[5] Zhou SB, Zhao XJ, Chen BQ. Research on antigonism of shikonin to xxidative injury.哈尔滨医科大学学报，1996,30:524—526
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[9] Lokesh BR, Hsieh HL, Kinsella. Alterations in the lipids and prostaglandins in mouse spleen following the ingestion of menhaden oil. Ann Nutr Metab, 1986, 30:357—361
(1998-08-23收稿), http://www.100md.com