抗氧化维生素对氧化低密度脂蛋白作用的主动脉内皮细胞脂质过氧化损伤的影响*
作者：和 红 王福俤 蔡梅雪
单位：上海第二医科大学，上海 200025
关键词：抗氧化维生素；内皮细胞；氧化低密度脂蛋白；脂质过氧化；动脉粥样硬化
抗氧化维生素对氧化低密度脂蛋白作用的主动脉内皮 细胞脂质过氧化损伤的影响摘要 为深入探讨抗氧化维生素(维生素E、维生素C及β-胡萝卜素)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)损伤内皮细胞的防治作用及可能机理，我们以体外培养的小牛主动脉内皮细胞为模型、在培养的主动脉内皮细胞中加入不同剂量的抗氧化维生素，共同培养12h，再与终浓度为0.1g/L的oxLDL继续培养24h，取贴壁细胞及培养液，通过硫代巴比妥酸荧光比色法(TBA)和单核细胞(HL60)粘附计数法观察不同浓度的抗氧化维生素对oxLDL损伤的内皮细胞脂质过氧化及单核细胞粘附性的影响。结果表明，抗氧化维生素各组细胞培养液中丙二醛(MDA)含量以及内皮细胞粘附的HL60细胞数均明显低于oxLDL组，提示维生素E、维生素C及β-胡萝卜素三种抗氧化维生素均可减轻oxLDL对内皮细胞的脂质过氧化损伤，阻止单核细胞的粘附。这些可能是抗氧化维生素防治动脉粥样硬化的重要机理之一。
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中图分类号 R543.1 R977.2
Effect of antioxidant vitamins on lipid peroxide injury of aortic endothelial cells induced by oxidatively modified low-density lipoprotein in vitro
He Hong, Wang Fudi, Cai Meixue
Department of Health Administration, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China
The effect of antioxidant vitamins including vitamin E, vitamin C and beta-carotene on lipid peroxidation injury of aortic endothelial cells induced by oxidatively modified low density lipoprotein (oxLDL) were observed. Bovine aortic endothelial cells were incubated in culture media with antioxidant vitamins for 12 hours, and then with oxLDL (0.1 g/L) for 24 hours respectively. The results showed that the malondialdehyde (MDA) content in culture media of the groups with oxLDL was significantly higher than those of groups with vitamin E, vitamin C and beta-carotene alone. The number of HL60 monocyte cells adhered to bovine aortic endothelial cells was obviously higher in oxLDL groups than those in groups with only antioxidant vitamins. This study indicated that antioxidant vitamins are protective on vascular from injury induced by oxLDL, including decreasing lipid peroxidation and reducing adherence of monocyte cells on endothelia and seemed to be promising in the prevention of atherosclerosis.
, 百拇医药
Key words:antioxidant vitamins, endothelial cell, oxidatively modified low density lipoprotein, lipid peroxidation, atherosclerosis
心脑血管疾病已严重影响人群生活质量和健康状况，是危害人类健康的常见疾病。作为心脑血管疾病的共同病理基础——动脉粥样硬化(AS)一直是人们研究心脑血管疾病发生机理及探索防治手段的突破口。血管内皮细胞的损伤是AS发生的始动环节[1]，而氧化低密度脂蛋白(oxLDL)参与AS的形成，其在内皮细胞损伤中是一个关键成分[2]。一旦形成了oxLDL，就可以直接损伤内皮及促进单核细胞进入内皮下间隙，增加单核细胞的迁移性和粘连性，诱导有粘性的细胞表面糖蛋白形成，从而引起AS病变部位的动脉壁内脂质过氧化物产生增多，大量单核巨噬细胞蓄积脂质，并转化为泡沫细胞，促进AS的形成。研究资料证实抗氧化维生素与AS的发生发展具有一定的负相关，如Gey等发现血浆维生素E水平与心脑血管病死亡率呈负相关[3]；Salonen等证明血清维生素E及β-胡萝卜素的水平与颈动脉壁厚度的进展之间存在负相关[4]；Dieber等从动物实验中得到的数据也表明膳食维生素E可以阻止AS的进展[5]；Scottish研究所发现维生素C的摄入量与心脑血管病的危险性呈负相关[6]；我们近期研究亦表明维生素E可减轻高脂血症大鼠脂质过氧化作用对动脉内皮的损伤作用[7，8]。但有关抗氧化维生素抗oxLDL损伤性保护作用的实验研究较少，本研究试图通过oxLDL对主动脉内皮细胞的体外直接作用，探讨抗氧化维生素在血管内皮细胞脂质过氧化损伤中所起的作用及可能机理，为AS的防治提供进一步的实验资料。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
胶原酶Ⅱ型及胰蛋白酶(活力1∶250)均为Sigma公司产品；DMEM细胞培养液为Gibco产品；维生素E为Merck公司产品；维生素C及β-胡萝卜素均为Fluka公司产品。其它试剂均为进口或国产分析试剂。
1.2 oxLDL的制备
按Mills的方法制备低密度脂蛋白(LDL)[9]，4℃保存备用。按Lowry法进行蛋白测定，蛋白测定结果为0.75g/L。按王淳本等报道的方法制备oxLDL[10]。测丙二醛(MDA)值为25.7μmol/g，明显高于氧化前LDL的MDA值(2.2μmol/g)。
1.3 小牛主动脉内皮细胞的体外培养及鉴定
, 百拇医药
新生小牛颈动脉放血处死，无菌条件下取出胸主动脉，置于冷D-Hank's液中。采用胶原酶消化法离解主动脉内皮细胞[11]，用含20%小牛血清DMEM细胞培养液调整细胞密度为3×104/ml，37℃静置培养。无血清培养：当细胞生长融合成单层后，倾去培养液，用Hanks液洗2～3遍，换上无血清的DMEM细胞培养液继续培养。传代培养：当内皮细胞融合成致密单层细胞时，用0.25%胰蛋白酶与0.04%EDTA-Na2等量混合消化，加含10%小牛血清的DMEM细胞培养液，以1∶2传代培养。采用Ⅷ因子相关抗原间接免疫荧光法鉴定内皮细胞。
1.4 丙二醛(MDA)的测定
取培养上清液，按八木国夫所描述的脂质过氧化物(LPO)测定的TBA法[12]，以0.5nmol/L的1∶1∶3∶3-四甲氧基丙烷为标准品，日立F3000荧光分光光度计测定LPO代谢终产物丙二醛(MDA)的含量，结果以均值±标准差(x±s)，表示。
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1.5 单核细胞粘附性测定
内皮细胞以1.4×105/孔密度接种于24孔板中，培养至融合后，加入不同浓度的抗氧化维生素预孵12h，再加入终浓度为0.1mg/ml的oxLDL继续培养24h后，倾去培养液。每孔加入106个/ml的HL60细胞，置37℃，2h后洗去未粘附细胞，用倒置相差显微镜观察各组HL60粘附内皮细胞的情况，每组观察10个视野，计算粘附细胞数，结果以均值±标准差(x±s)表示。
1.6 实验分组及统计学分析
将培养瓶或培养板中的内皮细胞随机分为2组，每瓶或每孔细胞为1个样品。第1组为对照组，加入不含抗氧化维生素的培养液；第2组为实验组，加入含不同浓度的三种抗氧化维生素的培养液。各组于37℃ 5%CO2孵箱内培养12h，然后用含有终浓度均为0.1mg的LDL或oxLDL的培养液继续培养，24h后进行检测。本实验中均使用培养的第3～5代内皮细胞。各组实验数据以平均值±标准差(x±s)表示，多组间差异显著性使用方差分析。
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2 实验结果
2.1 抗氧化维生素对内皮细胞培养液中MDA的影响
2.1.1 VE对内皮细胞培养液中MDA的影响 由表1可见，VE三个剂量组细胞培养上清液中MDA含量分别较对照组(oxLDL组)降低10.89%、18.02%和29.09%。低浓度的VE即可以显著降低oxLDL组内皮细胞培养液中MDA的含量；而且随着VE浓度升高呈剂量依赖关系。三个剂量组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。表明VE可显著降低内皮细胞培养液中过氧化脂质含量，抑制内皮细胞的脂质过氧化反应。
2.1.2 VC对内皮细胞培养液中MDA的影响 由表2可见，VC可显著降低内皮细胞培养液中MDA含量，50.0μmol/L组和100.0μmol/L组与对照组(oxLDL)相比均有显著性差异(P<0.01)。其三个剂量组细胞培养上清液中MDA含量分别较对照组(oxLDL组)降低7.42%、17.24%和21.19%。结果表明VC可通过抑制oxLDL组内皮细胞培养液中MDA的生成阻止内皮细胞脂质过氧化损伤。
, 百拇医药
2.1.3 β-胡萝卜素对内皮细胞培养液中MDA的影响 由表3可见，β-胡萝卜素三个剂量组细胞培养上清液中MDA含量均较对照组(oxLDL组)降低，但其中只有高浓度的β-胡萝卜素(10.0μmol/L)组降低程度具有统计学意义(P<0.05)，而1.0μmol/L组和5.0μmol/L组与对照组相比无显著性差异。
表1 维生素E对内皮细胞培养液中MDA的影响 nmol/ml
组 别
对照组
(不加VE)
维生素E(μmol/L)
12.5
25.0
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50.0
正常组
0.353±0.017a
0.354±0.020a
0.349±0.032a
0.336±0.021a
LDL组
0.849±0.039b
0.743±0.033b
0.675±0.024b(2)
, 百拇医药
0.534±0.012b(2)
oxLDL组
1.038±0.014c
0.925±0.039c(1)
0.851±0.028c(2)
0.736±0.019c(2)
注：同列中不同上角字母表示数据之间具有显著性差异P<0.01；不同剂量VE实验组与对照组进行比较 (1)P<0.05 (2)P<0.01 表2 维生素C对内皮细胞培养液中MDA的影响 nmol/ml
组 别
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对照组
(不加VE)
维生素E(μmol/L)
12.5
25.0
50.0
正常组
0.353±0.017a
0.347±0.042a
0.352±0.023a
0.357±0.042a
, 百拇医药
LDL组
0.849±0.039b
0.797±0.026b
0.743±0.028b(1)
0.683±0.024b(2)
OxLDL组
1.038±0.014c
0.961±0.039c
0.859±0.053c(1)
, 百拇医药 0.818±0.025c(2)
注：同表1 表3 β-胡萝卜素对内皮细胞培养液中MDA的影响 nmol/ml
组 别
对照组
(不加VE)
维生素E(μmol/L)
12.5
25.0
50.0
正常组
0.353±0.017a
, 百拇医药
0.351±0.023a
0.355±0.032a
0.358±0.012a
LDL组
0.849±0.039b
0.837±0.035b
0.809±0.021b
0.767±0.021b(1)
oxLDL组
1.038±0.014c
, 百拇医药
1.021±0.021c
0.965±0.041c
0.893±0.015c(2)
注：同表1
2.2 抗氧化维生素对内皮细胞粘附性的影响
2.2.1 VE对内皮细胞粘附性的影响 由表4可见，VE三个剂量组粘附的HL60细胞数分别较对照组(oxLDL组)减少6.20%、12.09%和16.90%。其中低浓度的VE(12.5μmol/L)对粘附性影响无显著性；而较高浓度(25.0μmol/L和50.0μmol/L)VE可以显著降低内皮细胞与HL60细胞的粘附(P<0.05或P<0.01)。
, 百拇医药
表4 维生素E对培养的主动脉内皮细胞粘附性的影响
组 别
对照组
(不加VE)
维生素E(μmol/L)
12.5
25.0
50.0
正常组
19.8±2.94a
19.3±1.84a
, 百拇医药 19.7±2.35a
18.9±2.02a
LDL组
28.3±2.98b
27.1±3.17b
23.9±2.12a(1)
20.1±2.46a(1)
OxLDL组
64.5±3.66c
60.5±3.23c
, 百拇医药
56.7±1.89b(2)
53.6±2.07b(2)
注：同表1
2.2.2 VC对内皮细胞粘附性的影响 由表5可见，VC三个剂量粘附的HL60细胞数均较对照组(oxLDL)减少，但其中浓度为20.0μmol/L和50.0μmol/L的VC对oxLDL引发的HL60细胞粘附性影响无显著性(P>0.05)；而高浓度的VC(100.0μmol/L)即可显著降低内皮细胞与HL60细胞的粘附(P<0.01)，使其粘附数仅为对照组(oxLDL组)的87.44%。 表5 维生素C对培养的主动脉内皮细胞粘附性的影响
组 别
对照组
, 百拇医药
(不加Vc)
维生素C(μmol/L)
20.0
50.0
100.0
正常组
19.8±2.94a
19.6±2.34a
19.1±3.51a
19.4±2.50a
LDL组
, 百拇医药
28.3±2.98b
25.8±3.42b
22.8±2.71a(1)
19.8±3.61a(1)
OxLDL组
64.5±3.66c
62.7±2.13c
59.6±2.54b
56.4±2.19b(2)
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注：同表1
2.2.3 β-胡萝卜素对内皮细胞粘附性的影响 由表6可见，浓度为1.0μmol/L和5.0μmol/L的β-胡萝卜素对内皮细胞与HL60细胞的粘附影响不明显；而较高浓度(10.0μmol/L)的β-胡萝卜素可显著降低内皮细胞与HL60细胞的粘附，具有统计学意义(P<0.05)。 表6 β-胡萝卜素对培养的主动脉内皮细胞粘附性的影响
组 别
对照组
(不加β胡萝卜素)
β-胡萝卜素(μmol/L)
1.0
5.0
, 百拇医药
10.0
正常组
19.8±2.94a
19.3±2.34a
19.5±2.46a
20.5±1.57a
LDL组
28.3±2.98b
27.4±3.05b
26.9±2.33b
, 百拇医药
24.6±3.69a
OxLDL组
64.5±3.66c
63.9±2.47c
63.1±3.45c
59.8±2.26b(1)
注：同表1
3 讨论
抗氧化维生素(维生素E、维生素C及β-胡萝卜素)作为一种抗氧化剂在细胞脂质过氧化物的清除中起重要作用，大量研究资料表明抗氧化维生素具有防治内皮细胞oxLDL损伤，延缓AS形成的作用。Jialal等和Lavy等实验表明β-胡萝卜素在体内的补充可阻止oxLDL对内皮细胞的损伤作用[13，14]；Keaney等研究发现[15]，VE对内皮细胞功能的保护作用与其抗氧化作用有关；王福亻 弟等研究亦表明维生素E可减轻高脂血症大鼠脂质过氧化作用对动脉内皮的损伤作用[7，8]。但抗氧化维生素保护内皮细胞的机理尚不完全清楚。
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“损伤一反应”学说认为内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(AS)形成的始动环节；而oxLDL是内皮细胞损伤的关键因素之一。因此oxLDL与AS关系已成为心血管疾病基础研究的热点。有实验证实[12]，血管壁内皮细胞损伤后最早出现的反应就是单核细胞的粘附，随后单核细胞进入内皮下层，形成泡沫细胞，在AS病变形成中起重要作用。而MDA的生成除可进一步氧化修饰LDL以外，还可通过抑制高密度脂蛋白(HDL)的合成促进泡沫细胞的形成。HDL可介导外周组织胆固醇的逆转运，不利于泡沫细胞的形成。本实验发现，抗氧化维生素可以显著降低内皮细胞培养液中MDA的生成及内皮细胞与单核细胞的粘附。这可能是因为在脂质过氧化反应中，由于抗氧化剂的阻断，不能发生自由基连锁反应，使生物膜磷脂中的不饱和脂肪酸未受到氧化，而不能生成大量过氧化脂质；由于避免生物膜系统损伤，避免细胞膜上蛋白质的空间构型发生改变，使细胞保持稳定，而不致出现细胞坏死、脱落。有研究报道[17]，当血液中过氧化脂质增加时，可损伤与血液接触的内皮细胞。内皮细胞膜的改变会增加其粘性，使单核细胞易于粘附，这与本实验结果一致。可能与oxLDL引发内皮细胞脂质过氧化损伤，进而促进内皮细胞及单核细胞分泌粘附分子有关。而抗氧化维生素可降低MDA的生成，阻止单核细胞的粘附，防止单核细胞在血管内皮细胞易损部位的聚集和渗入，阻抑泡沫细胞的大量形成，使内皮细胞脂质过氧化损伤减轻，从而发挥其抗AS的作用。但抗氧化维生素抗AS形成的详细机理还需进一步研究。
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* 国家自然科学基金资助项目(39770643)
作者简介：和红，女，硕士，讲师
王福亻弟 第二军医大学海军卫生学教研室
蔡梅雪 上海铁道大学医学院预防医学教研室
参考文献
[1] Ross RN. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993，362:801-809
[2] Yla-Herttuala S, Palinski W, Rosenfeld ME, et al. Lipoproteins in normal and atherosclerotic aorta. Eur Heart J, 1990, 11(Suppl E):88-99
, 百拇医药
[3] Gey KF, Puska P, Jordan P, et al. Inverse correlation between plasma vitamin E and mortality from ischemic heart disease in cross-cultural epidemiology. Am J Clin Nutr, 1991, 53:326s-334s
[4] Salonen JT, Nzzssonen K, Parviainen M, et al. Low plasma beta-carotene, Vitamin E and selenium levels associated with accelerated carotid atherogenesis in hypercholesterolemic eastern Finnish men. Circulation, 1993,87:1(abs.)
[5] Dieber-Rotheneder M, Puh1 H, Waeg G, et al. effect of oral supplementation with alpha tocopherol on the vitamin E of human low density lipoproteins and resistance to oxidation. J Lipid Res, 1991, 32:1325-1332
, 百拇医药
[6] Bolton-Smith C, Woodward M, Tunstall-Pedoe H. The Scottish Heart Study, Dietary intake by food frequency questionnaire and odds ratios for coronary heart disease risk. Ⅱ.The antioxidant vitamins and fibre. Eur J Clin Nutr, 1992, 46:85-92
[7] 王福亻弟，蔡梅雪，祝寿嵩.硒、维生素E对血脂及脂质过氧化作用的影响.营养学报，1997，19(1)：16-22
[8] 王福亻弟，蔡梅雪，祝寿嵩.硒和/或维生素E预防大鼠内皮细胞损伤的实验研究.营养学报，1997，19(2)：163-166
[9] Mills GL, Lane PA. A guidebook to lipoprotein technique. In: Burdon R H eds. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. New York: Elsevier, 1984.27-43
, 百拇医药
[10] 王淳本，宗义强，吴万生，等.两步超速离心法快速分离大量血浆极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白.同济医科大学学报，1995，24(3)：169-171
[11] 盛民立，陈思白，金慰芳，等.血管内皮细胞培养及鉴定.上海医科大学学报，1987，14(1)：71-73
[12] 八木国夫.血清过氧化脂质の测定とその临床的意义.临床病理，1981，29(3)：221-223
[13] Jialal I, Norkus P, Cristol L, et al. Beta-carotene inhibits the oxidative modification of low density lipoprotein. Biochem biophys Acta, 1991 1086:134-138
[14] Lavy A, Brook JG, dankner G, et al. Enhanced in vitro oxidation of plasma lipoproteins derived from hypercholesterolemic patients. Metabolism, 1991, 40:794-799
, 百拇医药
[15] Keaney JF, Gaziano JM, Xu A, et al. Low dose alpha-tocopherol improves and high dose alpha-tocopherol worsens endothelial vasodilator function in cholesterolfed rabbits. Lin Invest, 1994, 93:844-851
[16] Joris I, Zand T, Nunnari J, et al. Studies on the pathogenesis of atherosclerosis. I Adhesion and emigration of mononuclear cells in the aorta of hypercholesterolemic rat. Am J Pathol, 1983,113(3):341-349
[17] Lehr H, Becker M, Marklund S, et al. Superoxide-dependent stimulation of leukocyte adhesion by oxidatively modified LDL in vivo. Arterio Thromb, 1992, 12:936-943
(1998-09-01收稿), http://www.100md.com
单位：上海第二医科大学，上海 200025
关键词：抗氧化维生素；内皮细胞；氧化低密度脂蛋白；脂质过氧化；动脉粥样硬化
抗氧化维生素对氧化低密度脂蛋白作用的主动脉内皮 细胞脂质过氧化损伤的影响摘要 为深入探讨抗氧化维生素(维生素E、维生素C及β-胡萝卜素)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)损伤内皮细胞的防治作用及可能机理，我们以体外培养的小牛主动脉内皮细胞为模型、在培养的主动脉内皮细胞中加入不同剂量的抗氧化维生素，共同培养12h，再与终浓度为0.1g/L的oxLDL继续培养24h，取贴壁细胞及培养液，通过硫代巴比妥酸荧光比色法(TBA)和单核细胞(HL60)粘附计数法观察不同浓度的抗氧化维生素对oxLDL损伤的内皮细胞脂质过氧化及单核细胞粘附性的影响。结果表明，抗氧化维生素各组细胞培养液中丙二醛(MDA)含量以及内皮细胞粘附的HL60细胞数均明显低于oxLDL组，提示维生素E、维生素C及β-胡萝卜素三种抗氧化维生素均可减轻oxLDL对内皮细胞的脂质过氧化损伤，阻止单核细胞的粘附。这些可能是抗氧化维生素防治动脉粥样硬化的重要机理之一。
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中图分类号 R543.1 R977.2
Effect of antioxidant vitamins on lipid peroxide injury of aortic endothelial cells induced by oxidatively modified low-density lipoprotein in vitro
He Hong, Wang Fudi, Cai Meixue
Department of Health Administration, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China
The effect of antioxidant vitamins including vitamin E, vitamin C and beta-carotene on lipid peroxidation injury of aortic endothelial cells induced by oxidatively modified low density lipoprotein (oxLDL) were observed. Bovine aortic endothelial cells were incubated in culture media with antioxidant vitamins for 12 hours, and then with oxLDL (0.1 g/L) for 24 hours respectively. The results showed that the malondialdehyde (MDA) content in culture media of the groups with oxLDL was significantly higher than those of groups with vitamin E, vitamin C and beta-carotene alone. The number of HL60 monocyte cells adhered to bovine aortic endothelial cells was obviously higher in oxLDL groups than those in groups with only antioxidant vitamins. This study indicated that antioxidant vitamins are protective on vascular from injury induced by oxLDL, including decreasing lipid peroxidation and reducing adherence of monocyte cells on endothelia and seemed to be promising in the prevention of atherosclerosis.
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Key words:antioxidant vitamins, endothelial cell, oxidatively modified low density lipoprotein, lipid peroxidation, atherosclerosis
心脑血管疾病已严重影响人群生活质量和健康状况，是危害人类健康的常见疾病。作为心脑血管疾病的共同病理基础——动脉粥样硬化(AS)一直是人们研究心脑血管疾病发生机理及探索防治手段的突破口。血管内皮细胞的损伤是AS发生的始动环节[1]，而氧化低密度脂蛋白(oxLDL)参与AS的形成，其在内皮细胞损伤中是一个关键成分[2]。一旦形成了oxLDL，就可以直接损伤内皮及促进单核细胞进入内皮下间隙，增加单核细胞的迁移性和粘连性，诱导有粘性的细胞表面糖蛋白形成，从而引起AS病变部位的动脉壁内脂质过氧化物产生增多，大量单核巨噬细胞蓄积脂质，并转化为泡沫细胞，促进AS的形成。研究资料证实抗氧化维生素与AS的发生发展具有一定的负相关，如Gey等发现血浆维生素E水平与心脑血管病死亡率呈负相关[3]；Salonen等证明血清维生素E及β-胡萝卜素的水平与颈动脉壁厚度的进展之间存在负相关[4]；Dieber等从动物实验中得到的数据也表明膳食维生素E可以阻止AS的进展[5]；Scottish研究所发现维生素C的摄入量与心脑血管病的危险性呈负相关[6]；我们近期研究亦表明维生素E可减轻高脂血症大鼠脂质过氧化作用对动脉内皮的损伤作用[7，8]。但有关抗氧化维生素抗oxLDL损伤性保护作用的实验研究较少，本研究试图通过oxLDL对主动脉内皮细胞的体外直接作用，探讨抗氧化维生素在血管内皮细胞脂质过氧化损伤中所起的作用及可能机理，为AS的防治提供进一步的实验资料。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
胶原酶Ⅱ型及胰蛋白酶(活力1∶250)均为Sigma公司产品；DMEM细胞培养液为Gibco产品；维生素E为Merck公司产品；维生素C及β-胡萝卜素均为Fluka公司产品。其它试剂均为进口或国产分析试剂。
1.2 oxLDL的制备
按Mills的方法制备低密度脂蛋白(LDL)[9]，4℃保存备用。按Lowry法进行蛋白测定，蛋白测定结果为0.75g/L。按王淳本等报道的方法制备oxLDL[10]。测丙二醛(MDA)值为25.7μmol/g，明显高于氧化前LDL的MDA值(2.2μmol/g)。
1.3 小牛主动脉内皮细胞的体外培养及鉴定
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新生小牛颈动脉放血处死，无菌条件下取出胸主动脉，置于冷D-Hank's液中。采用胶原酶消化法离解主动脉内皮细胞[11]，用含20%小牛血清DMEM细胞培养液调整细胞密度为3×104/ml，37℃静置培养。无血清培养：当细胞生长融合成单层后，倾去培养液，用Hanks液洗2～3遍，换上无血清的DMEM细胞培养液继续培养。传代培养：当内皮细胞融合成致密单层细胞时，用0.25%胰蛋白酶与0.04%EDTA-Na2等量混合消化，加含10%小牛血清的DMEM细胞培养液，以1∶2传代培养。采用Ⅷ因子相关抗原间接免疫荧光法鉴定内皮细胞。
1.4 丙二醛(MDA)的测定
取培养上清液，按八木国夫所描述的脂质过氧化物(LPO)测定的TBA法[12]，以0.5nmol/L的1∶1∶3∶3-四甲氧基丙烷为标准品，日立F3000荧光分光光度计测定LPO代谢终产物丙二醛(MDA)的含量，结果以均值±标准差(x±s)，表示。
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1.5 单核细胞粘附性测定
内皮细胞以1.4×105/孔密度接种于24孔板中，培养至融合后，加入不同浓度的抗氧化维生素预孵12h，再加入终浓度为0.1mg/ml的oxLDL继续培养24h后，倾去培养液。每孔加入106个/ml的HL60细胞，置37℃，2h后洗去未粘附细胞，用倒置相差显微镜观察各组HL60粘附内皮细胞的情况，每组观察10个视野，计算粘附细胞数，结果以均值±标准差(x±s)表示。
1.6 实验分组及统计学分析
将培养瓶或培养板中的内皮细胞随机分为2组，每瓶或每孔细胞为1个样品。第1组为对照组，加入不含抗氧化维生素的培养液；第2组为实验组，加入含不同浓度的三种抗氧化维生素的培养液。各组于37℃ 5%CO2孵箱内培养12h，然后用含有终浓度均为0.1mg的LDL或oxLDL的培养液继续培养，24h后进行检测。本实验中均使用培养的第3～5代内皮细胞。各组实验数据以平均值±标准差(x±s)表示，多组间差异显著性使用方差分析。
, 百拇医药
2 实验结果
2.1 抗氧化维生素对内皮细胞培养液中MDA的影响
2.1.1 VE对内皮细胞培养液中MDA的影响 由表1可见，VE三个剂量组细胞培养上清液中MDA含量分别较对照组(oxLDL组)降低10.89%、18.02%和29.09%。低浓度的VE即可以显著降低oxLDL组内皮细胞培养液中MDA的含量；而且随着VE浓度升高呈剂量依赖关系。三个剂量组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。表明VE可显著降低内皮细胞培养液中过氧化脂质含量，抑制内皮细胞的脂质过氧化反应。
2.1.2 VC对内皮细胞培养液中MDA的影响 由表2可见，VC可显著降低内皮细胞培养液中MDA含量，50.0μmol/L组和100.0μmol/L组与对照组(oxLDL)相比均有显著性差异(P<0.01)。其三个剂量组细胞培养上清液中MDA含量分别较对照组(oxLDL组)降低7.42%、17.24%和21.19%。结果表明VC可通过抑制oxLDL组内皮细胞培养液中MDA的生成阻止内皮细胞脂质过氧化损伤。
, 百拇医药
2.1.3 β-胡萝卜素对内皮细胞培养液中MDA的影响 由表3可见，β-胡萝卜素三个剂量组细胞培养上清液中MDA含量均较对照组(oxLDL组)降低，但其中只有高浓度的β-胡萝卜素(10.0μmol/L)组降低程度具有统计学意义(P<0.05)，而1.0μmol/L组和5.0μmol/L组与对照组相比无显著性差异。
表1 维生素E对内皮细胞培养液中MDA的影响 nmol/ml
组 别
对照组
(不加VE)
维生素E(μmol/L)
12.5
25.0
, http://www.100md.com
50.0
正常组
0.353±0.017a
0.354±0.020a
0.349±0.032a
0.336±0.021a
LDL组
0.849±0.039b
0.743±0.033b
0.675±0.024b(2)
, 百拇医药
0.534±0.012b(2)
oxLDL组
1.038±0.014c
0.925±0.039c(1)
0.851±0.028c(2)
0.736±0.019c(2)
注：同列中不同上角字母表示数据之间具有显著性差异P<0.01；不同剂量VE实验组与对照组进行比较 (1)P<0.05 (2)P<0.01 表2 维生素C对内皮细胞培养液中MDA的影响 nmol/ml
组 别
, http://www.100md.com
对照组
(不加VE)
维生素E(μmol/L)
12.5
25.0
50.0
正常组
0.353±0.017a
0.347±0.042a
0.352±0.023a
0.357±0.042a
, 百拇医药
LDL组
0.849±0.039b
0.797±0.026b
0.743±0.028b(1)
0.683±0.024b(2)
OxLDL组
1.038±0.014c
0.961±0.039c
0.859±0.053c(1)
, 百拇医药 0.818±0.025c(2)
注：同表1 表3 β-胡萝卜素对内皮细胞培养液中MDA的影响 nmol/ml
组 别
对照组
(不加VE)
维生素E(μmol/L)
12.5
25.0
50.0
正常组
0.353±0.017a
, 百拇医药
0.351±0.023a
0.355±0.032a
0.358±0.012a
LDL组
0.849±0.039b
0.837±0.035b
0.809±0.021b
0.767±0.021b(1)
oxLDL组
1.038±0.014c
, 百拇医药
1.021±0.021c
0.965±0.041c
0.893±0.015c(2)
注：同表1
2.2 抗氧化维生素对内皮细胞粘附性的影响
2.2.1 VE对内皮细胞粘附性的影响 由表4可见，VE三个剂量组粘附的HL60细胞数分别较对照组(oxLDL组)减少6.20%、12.09%和16.90%。其中低浓度的VE(12.5μmol/L)对粘附性影响无显著性；而较高浓度(25.0μmol/L和50.0μmol/L)VE可以显著降低内皮细胞与HL60细胞的粘附(P<0.05或P<0.01)。
, 百拇医药
表4 维生素E对培养的主动脉内皮细胞粘附性的影响
组 别
对照组
(不加VE)
维生素E(μmol/L)
12.5
25.0
50.0
正常组
19.8±2.94a
19.3±1.84a
, 百拇医药 19.7±2.35a
18.9±2.02a
LDL组
28.3±2.98b
27.1±3.17b
23.9±2.12a(1)
20.1±2.46a(1)
OxLDL组
64.5±3.66c
60.5±3.23c
, 百拇医药
56.7±1.89b(2)
53.6±2.07b(2)
注：同表1
2.2.2 VC对内皮细胞粘附性的影响 由表5可见，VC三个剂量粘附的HL60细胞数均较对照组(oxLDL)减少，但其中浓度为20.0μmol/L和50.0μmol/L的VC对oxLDL引发的HL60细胞粘附性影响无显著性(P>0.05)；而高浓度的VC(100.0μmol/L)即可显著降低内皮细胞与HL60细胞的粘附(P<0.01)，使其粘附数仅为对照组(oxLDL组)的87.44%。 表5 维生素C对培养的主动脉内皮细胞粘附性的影响
组 别
对照组
, 百拇医药
(不加Vc)
维生素C(μmol/L)
20.0
50.0
100.0
正常组
19.8±2.94a
19.6±2.34a
19.1±3.51a
19.4±2.50a
LDL组
, 百拇医药
28.3±2.98b
25.8±3.42b
22.8±2.71a(1)
19.8±3.61a(1)
OxLDL组
64.5±3.66c
62.7±2.13c
59.6±2.54b
56.4±2.19b(2)
, http://www.100md.com
注：同表1
2.2.3 β-胡萝卜素对内皮细胞粘附性的影响 由表6可见，浓度为1.0μmol/L和5.0μmol/L的β-胡萝卜素对内皮细胞与HL60细胞的粘附影响不明显；而较高浓度(10.0μmol/L)的β-胡萝卜素可显著降低内皮细胞与HL60细胞的粘附，具有统计学意义(P<0.05)。 表6 β-胡萝卜素对培养的主动脉内皮细胞粘附性的影响
组 别
对照组
(不加β胡萝卜素)
β-胡萝卜素(μmol/L)
1.0
5.0
, 百拇医药
10.0
正常组
19.8±2.94a
19.3±2.34a
19.5±2.46a
20.5±1.57a
LDL组
28.3±2.98b
27.4±3.05b
26.9±2.33b
, 百拇医药
24.6±3.69a
OxLDL组
64.5±3.66c
63.9±2.47c
63.1±3.45c
59.8±2.26b(1)
注：同表1
3 讨论
抗氧化维生素(维生素E、维生素C及β-胡萝卜素)作为一种抗氧化剂在细胞脂质过氧化物的清除中起重要作用，大量研究资料表明抗氧化维生素具有防治内皮细胞oxLDL损伤，延缓AS形成的作用。Jialal等和Lavy等实验表明β-胡萝卜素在体内的补充可阻止oxLDL对内皮细胞的损伤作用[13，14]；Keaney等研究发现[15]，VE对内皮细胞功能的保护作用与其抗氧化作用有关；王福亻 弟等研究亦表明维生素E可减轻高脂血症大鼠脂质过氧化作用对动脉内皮的损伤作用[7，8]。但抗氧化维生素保护内皮细胞的机理尚不完全清楚。
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“损伤一反应”学说认为内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(AS)形成的始动环节；而oxLDL是内皮细胞损伤的关键因素之一。因此oxLDL与AS关系已成为心血管疾病基础研究的热点。有实验证实[12]，血管壁内皮细胞损伤后最早出现的反应就是单核细胞的粘附，随后单核细胞进入内皮下层，形成泡沫细胞，在AS病变形成中起重要作用。而MDA的生成除可进一步氧化修饰LDL以外，还可通过抑制高密度脂蛋白(HDL)的合成促进泡沫细胞的形成。HDL可介导外周组织胆固醇的逆转运，不利于泡沫细胞的形成。本实验发现，抗氧化维生素可以显著降低内皮细胞培养液中MDA的生成及内皮细胞与单核细胞的粘附。这可能是因为在脂质过氧化反应中，由于抗氧化剂的阻断，不能发生自由基连锁反应，使生物膜磷脂中的不饱和脂肪酸未受到氧化，而不能生成大量过氧化脂质；由于避免生物膜系统损伤，避免细胞膜上蛋白质的空间构型发生改变，使细胞保持稳定，而不致出现细胞坏死、脱落。有研究报道[17]，当血液中过氧化脂质增加时，可损伤与血液接触的内皮细胞。内皮细胞膜的改变会增加其粘性，使单核细胞易于粘附，这与本实验结果一致。可能与oxLDL引发内皮细胞脂质过氧化损伤，进而促进内皮细胞及单核细胞分泌粘附分子有关。而抗氧化维生素可降低MDA的生成，阻止单核细胞的粘附，防止单核细胞在血管内皮细胞易损部位的聚集和渗入，阻抑泡沫细胞的大量形成，使内皮细胞脂质过氧化损伤减轻，从而发挥其抗AS的作用。但抗氧化维生素抗AS形成的详细机理还需进一步研究。
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* 国家自然科学基金资助项目(39770643)
作者简介：和红，女，硕士，讲师
王福亻弟 第二军医大学海军卫生学教研室
蔡梅雪 上海铁道大学医学院预防医学教研室
参考文献
[1] Ross RN. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993，362:801-809
[2] Yla-Herttuala S, Palinski W, Rosenfeld ME, et al. Lipoproteins in normal and atherosclerotic aorta. Eur Heart J, 1990, 11(Suppl E):88-99
, 百拇医药
[3] Gey KF, Puska P, Jordan P, et al. Inverse correlation between plasma vitamin E and mortality from ischemic heart disease in cross-cultural epidemiology. Am J Clin Nutr, 1991, 53:326s-334s
[4] Salonen JT, Nzzssonen K, Parviainen M, et al. Low plasma beta-carotene, Vitamin E and selenium levels associated with accelerated carotid atherogenesis in hypercholesterolemic eastern Finnish men. Circulation, 1993,87:1(abs.)
[5] Dieber-Rotheneder M, Puh1 H, Waeg G, et al. effect of oral supplementation with alpha tocopherol on the vitamin E of human low density lipoproteins and resistance to oxidation. J Lipid Res, 1991, 32:1325-1332
, 百拇医药
[6] Bolton-Smith C, Woodward M, Tunstall-Pedoe H. The Scottish Heart Study, Dietary intake by food frequency questionnaire and odds ratios for coronary heart disease risk. Ⅱ.The antioxidant vitamins and fibre. Eur J Clin Nutr, 1992, 46:85-92
[7] 王福亻弟，蔡梅雪，祝寿嵩.硒、维生素E对血脂及脂质过氧化作用的影响.营养学报，1997，19(1)：16-22
[8] 王福亻弟，蔡梅雪，祝寿嵩.硒和/或维生素E预防大鼠内皮细胞损伤的实验研究.营养学报，1997，19(2)：163-166
[9] Mills GL, Lane PA. A guidebook to lipoprotein technique. In: Burdon R H eds. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. New York: Elsevier, 1984.27-43
, 百拇医药
[10] 王淳本，宗义强，吴万生，等.两步超速离心法快速分离大量血浆极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白.同济医科大学学报，1995，24(3)：169-171
[11] 盛民立，陈思白，金慰芳，等.血管内皮细胞培养及鉴定.上海医科大学学报，1987，14(1)：71-73
[12] 八木国夫.血清过氧化脂质の测定とその临床的意义.临床病理，1981，29(3)：221-223
[13] Jialal I, Norkus P, Cristol L, et al. Beta-carotene inhibits the oxidative modification of low density lipoprotein. Biochem biophys Acta, 1991 1086:134-138
[14] Lavy A, Brook JG, dankner G, et al. Enhanced in vitro oxidation of plasma lipoproteins derived from hypercholesterolemic patients. Metabolism, 1991, 40:794-799
, 百拇医药
[15] Keaney JF, Gaziano JM, Xu A, et al. Low dose alpha-tocopherol improves and high dose alpha-tocopherol worsens endothelial vasodilator function in cholesterolfed rabbits. Lin Invest, 1994, 93:844-851
[16] Joris I, Zand T, Nunnari J, et al. Studies on the pathogenesis of atherosclerosis. I Adhesion and emigration of mononuclear cells in the aorta of hypercholesterolemic rat. Am J Pathol, 1983,113(3):341-349
[17] Lehr H, Becker M, Marklund S, et al. Superoxide-dependent stimulation of leukocyte adhesion by oxidatively modified LDL in vivo. Arterio Thromb, 1992, 12:936-943
(1998-09-01收稿), http://www.100md.com